動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)

1、 第十一章動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)第十一章動物細胞大規(guī)模培養(yǎng) 教教 學(xué)學(xué) 內(nèi)內(nèi) 容容 1、動物細胞培養(yǎng)基 2、動物細胞培養(yǎng)方法 3、動物細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 4、動物細胞培養(yǎng)技術(shù) 5、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝 本章內(nèi)容提要 在生物技術(shù)中，人們已廣泛地圍繞著在生物技術(shù)中，人們已廣泛地圍繞著細菌、酵母、絲狀真菌等細菌、酵母、絲狀真菌等微生物的微生物的 大量培養(yǎng)來生產(chǎn)各種大量培養(yǎng)來生產(chǎn)各種酶、抗生素、蛋白質(zhì)等產(chǎn)物酶、抗生素、蛋白質(zhì)等產(chǎn)物。然而，許多有重要價值的。然而，許多有重要價值的 蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)，必須借助于動物細胞的培養(yǎng)來獲得，例如蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)，必須借助于動物細胞的培養(yǎng)來獲得，例如病毒疫苗、干擾病毒

2、疫苗、干擾 素、單克隆抗體素、單克隆抗體等，如表等，如表11-1所示的是一些已實現(xiàn)工業(yè)化和正在研究開發(fā)的產(chǎn)所示的是一些已實現(xiàn)工業(yè)化和正在研究開發(fā)的產(chǎn) 品。品。 大規(guī)模的動物細胞培養(yǎng)開始于本世紀大規(guī)模的動物細胞培養(yǎng)開始于本世紀50年代，經(jīng)過多年來的研究，人類對動年代，經(jīng)過多年來的研究，人類對動 物細胞培養(yǎng)技術(shù)進行了大量的研究開發(fā)，取得了很大的進展。盡管如此，目前物細胞培養(yǎng)技術(shù)進行了大量的研究開發(fā)，取得了很大的進展。盡管如此，目前 的技術(shù)水平還遠不能滿足細胞生物產(chǎn)品研究和生產(chǎn)的要求，隨著動物細胞培養(yǎng)的技術(shù)水平還遠不能滿足細胞生物產(chǎn)品研究和生產(chǎn)的要求，隨著動物細胞培養(yǎng) 技術(shù)的應(yīng)用日趨廣泛，已顯示出很

3、廣闊的發(fā)展前景。技術(shù)的應(yīng)用日趨廣泛，已顯示出很廣闊的發(fā)展前景。 目前由動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物包括哪幾類？請分別列舉出目前由動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物包括哪幾類？請分別列舉出2-3個產(chǎn)物。個產(chǎn)物。 問題問題 表表11-1 動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物 疫苗人小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、風(fēng)疹疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫 苗等 動物牛病毒性腹瀉疫苗、牛痢疾疫苗、犬傳染性肝炎疫苗、雞痘 病疫苗、豬霍亂疫苗、牛疫狂犬疫苗、草魚出血熱疫苗 單克隆抗體IgG、IgM、IgA等 免疫調(diào)節(jié)劑-細胞生長因子、干擾素、白細胞活化因子、血清胸腺因子、 白細胞介素、胸腺素、巨噬細胞毒力因子等 酶尿激酶、天門冬氨酰胺酶、膠原酶、細胞

4、色素P、450、纖維 蛋白溶酶原激活劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脫羥酶等 激素絨膜促性腺激素、促紅細胞生成素、促濾泡激素、生長激素、 促間質(zhì)細胞激素、促黃體激素等 補充內(nèi)容（一）補充內(nèi)容（一） 單克隆抗體單克隆抗體 哺乳動物細胞中有一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)防御系統(tǒng)保護自己不受有毒物質(zhì)和病原物的侵 害，其中一部分防御反應(yīng)就是淋巴細胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的蛋白，這些蛋白可以在其 他免疫系統(tǒng)蛋白的幫助下與外來物質(zhì)結(jié)合，并抵消其生物學(xué)功能。這些特異的蛋白， 就是抗體；相對于抗體，誘發(fā)產(chǎn)生抗體的外來物質(zhì)即稱為抗原。 抗體最早是由德國微生物學(xué)家貝林發(fā)現(xiàn)的，它們存在于人和脊椎動物的血清之 中，是這些生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的

5、重要組成成分。由于抗體分子具有極其精確的結(jié)合 特異性，可以識別各種不同的抗原，還可以激活細胞的其他防衛(wèi)系統(tǒng)以消滅抗原， 因此抗體在基礎(chǔ)研究和臨床診斷中獲得了廣泛的重視和應(yīng)用。隨著雜交瘤技術(shù)、蛋 白質(zhì)工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等技術(shù)的發(fā)展，抗體已逐步在疾病治療等應(yīng)用領(lǐng)域顯示出越 來越廣闊的應(yīng)用前景。 抗體抗體 由B細胞產(chǎn)生的免疫球蛋白，它能識別抗原的某一特定位點?？贵w分 子由兩個完全相同的重鏈分子以及兩個完全相同的輕鏈分子組成。存在 于人或哺乳動物的血清之中。 抗原抗原 指誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。 如前所述，抗體分子是免疫系統(tǒng)反應(yīng)的一個重要組分，因為抗體分子可以識 別各種不同的外來抗原，同時可激活宿主的防衛(wèi)系

6、統(tǒng)。 對于一個免疫刺激（有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原），每一個淋巴細胞都 會合成并分泌一種單個的抗體，這些抗體可以高度特異地識別免疫抗原的特定區(qū)域， 也就是抗原決定簇。由于一個抗原通常都有幾個不同的抗原決定簇，因此每個免疫 淋巴細胞都可能產(chǎn)生一種針對某一個抗原決定簇的抗體，這些由同一抗原而產(chǎn)生的 不同的抗體統(tǒng)稱為多克隆抗體。 有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原 侵入 抗體2 抗體1 于是，人們認識到要把抗體應(yīng)用于臨床診斷或是治療，必須要制備單一類型的 只對某一特定抗原決定簇的抗體分子，也就是單克隆抗體。 多克隆抗體多克隆抗體 在一個血清樣品中包含了對同一抗原分子上不同抗原決定簇的多種抗體。 單克隆抗

7、體單克隆抗體 由雜交瘤細胞系產(chǎn)生的針對某一特定抗原決定簇的單一類型的抗體。 補充內(nèi)容（二）補充內(nèi)容（二） 動物細胞培養(yǎng)步驟動物細胞培養(yǎng)步驟 培養(yǎng)動物細胞一般可按以下步驟進行： 無菌取出目的細胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈 以鋒利無菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊 將小組織塊置解離液離散細胞。解離液含蛋白酶類，無鈣、鎂離子 低速離心洗滌細胞后，將目的細胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 一、動物細胞培養(yǎng)基 1、動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境、動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境 動物細胞的生長、繁殖和代謝等生理性質(zhì)在很大程度上受到各種環(huán)境因素的影 響。為了使動物細胞的培養(yǎng)處于最佳狀態(tài)，了解環(huán)境因素對其影響無疑是很重要的， 影響動物細胞生長、繁殖

8、的環(huán)境因素很多，主要有溫度、PH值、營養(yǎng)成分、溶氧、 氣體環(huán)境、滲透壓以及其他因素。 溫溫 度度 細胞在體外生存的基本條件之一，來源不同的動物細胞，其最適的生長溫度是 不盡相同的，例如昆蟲細胞的最適溫度是25-28，人和哺乳動物的細胞的最適溫度 是37.細胞代謝強度與溫度成正比，高于最適溫度范圍，細胞的正常代謝和生長將 會受到影響，甚至導(dǎo)致死亡?？偟膩碚f，動物細胞對低溫的耐受力比對高溫的耐受 力強，如溫度升至45時，1h內(nèi)人和哺乳動物細胞將被殺死；相反，降低細胞置于 25-35時，細胞仍能生長，但速度減慢，并維持長時間不死，甚至于放在4，數(shù)小 時后再置于37培養(yǎng)，細胞仍能繼續(xù)生長。 PH 值值

9、 合適的合適的PH值是細胞生存的必要的條件之一。動物細胞合適的值是細胞生存的必要的條件之一。動物細胞合適的PH值一般在值一般在7.2-7.4， 低于低于6.8或高于或高于7.6時都對細胞產(chǎn)生不利的影響，嚴重時可導(dǎo)致細胞退變或死亡。不同時都對細胞產(chǎn)生不利的影響，嚴重時可導(dǎo)致細胞退變或死亡。不同 的細胞對的細胞對PH值也有不同的要求，原代培養(yǎng)細胞對值也有不同的要求，原代培養(yǎng)細胞對PH值的變化耐受性差，傳代細胞值的變化耐受性差，傳代細胞 對對PH值變化的耐受性較強。而對于同一種細胞，增長期和維持期的最適值變化的耐受性較強。而對于同一種細胞，增長期和維持期的最適PH也不盡也不盡 相同，對于大多數(shù)細胞來

10、說，偏堿性環(huán)境比酸性環(huán)境更有利于細胞的生長。相同，對于大多數(shù)細胞來說，偏堿性環(huán)境比酸性環(huán)境更有利于細胞的生長。 營養(yǎng)成分營養(yǎng)成分 細胞的生長、繁殖以及產(chǎn)物的合成都必須從環(huán)境中攝取各種營養(yǎng)物質(zhì)，以合成細胞的生長、繁殖以及產(chǎn)物的合成都必須從環(huán)境中攝取各種營養(yǎng)物質(zhì)，以合成 細胞物質(zhì)及在新陳代謝中起調(diào)節(jié)作用。這些營養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、氨基酸、無細胞物質(zhì)及在新陳代謝中起調(diào)節(jié)作用。這些營養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、氨基酸、無 機鹽、微量元素、生長因子等。機鹽、微量元素、生長因子等。 溶氧及氣體環(huán)境溶氧及氣體環(huán)境（P205） 滲透壓等其它因素滲透壓等其它因素（P205） 1、影響動物細胞生長、繁殖的環(huán)境因素有哪

11、些？、影響動物細胞生長、繁殖的環(huán)境因素有哪些？ 問題問題 2、動物細胞培養(yǎng)合適的、動物細胞培養(yǎng)合適的PH值為多少？值為多少？ 2、培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)基的組成 培養(yǎng)基是維持體外細胞生存和生長的基本溶液，是組織細胞培養(yǎng)最重要的條件。培養(yǎng)基是維持體外細胞生存和生長的基本溶液，是組織細胞培養(yǎng)最重要的條件。 用于動物細胞的培養(yǎng)基可以分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩用于動物細胞的培養(yǎng)基可以分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩 大類。大類。 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是使用最早、最為有效的動物細胞培養(yǎng)基，它主要取自于動物體液是使用最早、最為有效的動物細胞培養(yǎng)基，它主要取自于動物體液 或從動物組織分離提取而得，其優(yōu)點是營養(yǎng)成分

12、豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點是成分或從動物組織分離提取而得，其優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點是成分 復(fù)雜、個體差異大、來源有限。復(fù)雜、個體差異大、來源有限。 天然培養(yǎng)基的種類有很多，包括生物性液體（如血清）、組織浸出液（如胚胎天然培養(yǎng)基的種類有很多，包括生物性液體（如血清）、組織浸出液（如胚胎 浸出液）、凝固劑（如血漿）等。浸出液）、凝固劑（如血漿）等。 3、溶氧濃度過高過低對細胞生長有何影響？、溶氧濃度過高過低對細胞生長有何影響？ 4、細胞代謝產(chǎn)物、細胞代謝產(chǎn)物CO2對細胞生長有何作用？對細胞生長有何作用？ 1、天然培養(yǎng)基有哪些？它有何優(yōu)缺點？、天然培養(yǎng)基有哪些？它有何優(yōu)缺點？ 問題問題

13、 2、血清和血漿分別如何取得？、血清和血漿分別如何取得？ 血液組成：紅細胞、白細胞、血小板和血漿。高速離心，分三層：上層為血漿血液組成：紅細胞、白細胞、血小板和血漿。高速離心，分三層：上層為血漿 40%多。多。 血漿冷凍到血漿冷凍到-30度，離心，分層：上層為血清，度，離心，分層：上層為血清， 下層為雜蛋白（少）。下層為雜蛋白（少）。 3、最廣泛使用的血清是什么動物血清？它有何營養(yǎng)成分？、最廣泛使用的血清是什么動物血清？它有何營養(yǎng)成分？ 血漿血漿 組織浸出液組織浸出液 血清血清 組織細胞培養(yǎng)中最常用的天然培養(yǎng)基是血清，這是因為血清中含有包括大分子的組織細胞培養(yǎng)中最常用的天然培養(yǎng)基是血清，這是因

14、為血清中含有包括大分子的 蛋白質(zhì)和核酸等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對促進細胞生長繁殖、粘附及中和某些物質(zhì)的毒蛋白質(zhì)和核酸等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對促進細胞生長繁殖、粘附及中和某些物質(zhì)的毒 性起著一定的作用。用于組織細胞培養(yǎng)的血清的種類很多，其來源主要動物，有小性起著一定的作用。用于組織細胞培養(yǎng)的血清的種類很多，其來源主要動物，有小 牛血清、胎牛血清、馬血清、兔血清以及人血清等，最廣泛使用的是小牛血清和胎牛血清、胎牛血清、馬血清、兔血清以及人血清等，最廣泛使用的是小牛血清和胎 牛血清。優(yōu)質(zhì)的血清外觀應(yīng)為透明、無溶血、淡黃色、無沉淀物。牛血清。優(yōu)質(zhì)的血清外觀應(yīng)為透明、無溶血、淡黃色、無沉淀物。 血漿不僅可用來支持

15、培養(yǎng)組織塊，而且還供給細胞生物匠營養(yǎng)物質(zhì)，但由于血血漿不僅可用來支持培養(yǎng)組織塊，而且還供給細胞生物匠營養(yǎng)物質(zhì)，但由于血 漿很容易發(fā)生液人經(jīng)，目前已很少單獨使用。一般使用的是禽類血漿。漿很容易發(fā)生液人經(jīng)，目前已很少單獨使用。一般使用的是禽類血漿。 組織浸出液常用的是胚胎浸出液（如雞胚浸出液），它的主要成分含有大分子組織浸出液常用的是胚胎浸出液（如雞胚浸出液），它的主要成分含有大分子 核蛋白和小分子的氨基酸，有促進細胞生長的作用。核蛋白和小分子的氨基酸，有促進細胞生長的作用。 水解乳蛋白水解乳蛋白 水解乳蛋白是常用的一種天然培養(yǎng)基，是由乳白蛋白經(jīng)水解而水解乳蛋白是常用的一種天然培養(yǎng)基，是由乳白蛋白

16、經(jīng)水解而 制得，氨基酸的含量較高。一般配制成制得，氨基酸的含量較高。一般配制成0.5%的溶液，或與合成培養(yǎng)的溶液，或與合成培養(yǎng) 基以基以1：1共同使用。共同使用。 合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)對細胞體內(nèi)生存環(huán)境中各種 已知物質(zhì)在體外人工條件的模擬，經(jīng)過反復(fù)實驗篩選、強化和重新組合后形成的培 養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基在很多方面有天然培養(yǎng)基所無法比擬的優(yōu)點，它既能經(jīng)細胞提供 一個近似于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標(biāo)準(zhǔn)化體外生存環(huán)境。 目前所有的細胞培養(yǎng)都已采用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、組成和含量都相對固定的各種合目前所有的細胞培養(yǎng)都已采用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、組成和含量都相對固定的各種合 成培養(yǎng)基，并已有

17、配制好的干粉型商品。盡管現(xiàn)在的合成培養(yǎng)基成分和含量已經(jīng)較成培養(yǎng)基，并已有配制好的干粉型商品。盡管現(xiàn)在的合成培養(yǎng)基成分和含量已經(jīng)較 為復(fù)雜，但仍然不能完全滿足體外培養(yǎng)細胞生長的需要，合成培養(yǎng)基中還是需要加為復(fù)雜，但仍然不能完全滿足體外培養(yǎng)細胞生長的需要，合成培養(yǎng)基中還是需要加 入一定量的天然培養(yǎng)基予以補充。入一定量的天然培養(yǎng)基予以補充。 合成培養(yǎng)基中一般都有哪些營養(yǎng)成分？合成培養(yǎng)基中一般都有哪些營養(yǎng)成分？ 問題問題 3、常用的合成培養(yǎng)基、常用的合成培養(yǎng)基 目前合成培養(yǎng)基的種類已有數(shù)十種，大多數(shù)培養(yǎng)基都是為適應(yīng)某種組織細胞的目前合成培養(yǎng)基的種類已有數(shù)十種，大多數(shù)培養(yǎng)基都是為適應(yīng)某種組織細胞的 生長

18、而在某種合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良而來的。目前較為常用的有生長而在某種合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良而來的。目前較為常用的有199培養(yǎng)液、培養(yǎng)液、 Eagle (MEM、DMEM)培養(yǎng)液培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、培養(yǎng)液、HAM培養(yǎng)液培養(yǎng)液等。表等。表11-2為常用為常用 的培養(yǎng)基的成分和配方。的培養(yǎng)基的成分和配方。 1、目前較常用的合成培養(yǎng)基有哪些？、目前較常用的合成培養(yǎng)基有哪些？ 問題問題 2、為什么在要求較高的基礎(chǔ)性研究中要用無血清培養(yǎng)液？、為什么在要求較高的基礎(chǔ)性研究中要用無血清培養(yǎng)液？ 3、無血清培養(yǎng)液由哪兩部分組成？、無血清培養(yǎng)液由哪兩部分組成？P208 表表11-4 微生物細胞和動物細胞

19、性質(zhì)的比較微生物細胞和動物細胞性質(zhì)的比較 性質(zhì)性質(zhì) 微生物細胞微生物細胞動物細胞動物細胞 大小1-10m10-100m 代謝調(diào)節(jié)方式內(nèi)部內(nèi)部和激素 營養(yǎng)要求 寬松，可利用多種底物 苛刻 生長速率倍增時間一般為0.5-2h倍增時間一般為12-60h 機械強度較好很差，缺乏保護性細胞壁 環(huán)境適應(yīng)好 差 二、動物細胞培養(yǎng)方法二、動物細胞培養(yǎng)方法 所謂所謂動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)是將動物組織或細胞從機體取出，分散成是將動物組織或細胞從機體取出，分散成 單個細胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體單個細胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體 外繼續(xù)生長和繁殖。外繼續(xù)生長和繁殖。表

20、表11-4，表，表11-5是微生物細胞與動物細胞性質(zhì)是微生物細胞與動物細胞性質(zhì) 和培養(yǎng)方法的比較。和培養(yǎng)方法的比較。 表11-5 微生物和動物細胞培養(yǎng)方法的比較 微生物細胞微生物細胞動物細胞動物細胞 PH控制添加酸、堿CO2-HCO3緩沖液 攪拌速度速度快、范圍廣較慢 溶氧控制改變攪拌速度、通氣量、進氣氧濃度改變進入氣體的氧濃度 培養(yǎng)基滅菌方法高溫蒸煮過濾 培養(yǎng)時間幾小時幾天幾天3、4周 對水純度的要求較低很高 與與微生物細胞培養(yǎng)類似，動物細胞的體外培養(yǎng)有兩種類型：微生物細胞培養(yǎng)類似，動物細胞的體外培養(yǎng)有兩種類型：一類是非貼一類是非貼 壁依賴性細胞，這類細胞可以采用與微生物培養(yǎng)類似的方法進行懸

21、浮培養(yǎng)；另一類壁依賴性細胞，這類細胞可以采用與微生物培養(yǎng)類似的方法進行懸浮培養(yǎng)；另一類 是貼壁依賴性細胞，它們需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面上生長。是貼壁依賴性細胞，它們需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面上生長。 1、懸浮培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng) P209 1、動物細胞培養(yǎng)有哪三種類型？、動物細胞培養(yǎng)有哪三種類型？ 提問提問 1、懸浮培養(yǎng)是用培養(yǎng)哪一類細胞的？ 問題問題 2、懸浮培養(yǎng)有何優(yōu)缺點？ 2、貼壁培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng) 貼壁指必須貼附在貼壁指必須貼附在固體介質(zhì)表面固體介質(zhì)表面上生長的細胞培養(yǎng)培養(yǎng)，主要用于上生長的細胞培養(yǎng)培養(yǎng)，主要用于非淋巴組非淋巴組 織和許多單倍體等貼壁依賴性細胞的織和許多

22、單倍體等貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)培養(yǎng)。由于大多數(shù)動物細胞屬于貼壁依賴。由于大多數(shù)動物細胞屬于貼壁依賴 性細胞，貼壁培養(yǎng)是動物細胞培養(yǎng)的一種重要方法。性細胞，貼壁培養(yǎng)是動物細胞培養(yǎng)的一種重要方法。 在貼壁培養(yǎng)過程中，貼壁依賴性細胞需要附著在帶適量正電荷或半固體的在帶適量正電荷或半固體的 表面上表面上，原來是圓形的細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展開來，然后開始有絲分裂，并很 快進入對數(shù)生長期。一般可在數(shù)天后鋪滿生長表面，形成致密的細胞單層。 在貼壁培養(yǎng)依賴性細胞中，請比較滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)系統(tǒng)？ 問題問題 細胞貼壁一般分為貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細胞與表面接觸、細胞貼壁于培 養(yǎng)表面和貼壁細胞在培養(yǎng)表面上擴

23、展等幾個步驟。圖11-1為細胞在培養(yǎng)表面貼壁過 程示意圖。 3、固定化培養(yǎng)、固定化培養(yǎng) 固定化培養(yǎng)是既適用于貼壁依賴性細胞，又適用于非貼壁依賴性細胞的包埋培 養(yǎng)方式，具有細胞生長密度高、抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點優(yōu)點。 由于所培養(yǎng)的細胞的不同，固定化培養(yǎng)的方式培養(yǎng)的方式也有不同，一般對于貼壁依賴 性細胞通常采用膠原包埋，而對于非貼壁依賴性細胞則常用海藻酸鈣包埋。 常用的細胞固定化的方法主要有細胞固定化的方法主要有吸附、共價貼附、離子/共價交聯(lián)、包埋和 微囊化等。 三、動物細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 自70年代以來，用于動物細胞培養(yǎng)的生長反應(yīng)器有了很大的發(fā)展，種類越來越多， 規(guī)模也越來越大。根據(jù)生物反

24、應(yīng)器的不同用途生物反應(yīng)器的不同用途，有懸浮培養(yǎng)用、貼壁培養(yǎng)用、包埋 培養(yǎng)用生物反應(yīng)器等，其種類大致上有種類大致上有塑料增殖器、填充床增殖器、多層板增殖器、 螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀增殖器、流化床反應(yīng)器、中空纖 維及其他膜式反應(yīng)器、槳式攪拌反應(yīng)器、棒式攪拌反應(yīng)器、船舶推進槳反應(yīng)器、傾斜 槳葉攪拌反應(yīng)器、般帆形攪拌反應(yīng)器、往復(fù)振動錐孔篩板攪拌反應(yīng)器、籠式通氣攪拌 反應(yīng)器、雙層籠式通氣攪拌反應(yīng)器、空氣提升式反應(yīng)器等。 1、氣升式細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器、氣升式細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 氣升式反應(yīng)器的基本原理如圖11-2 所示。氣體混合物從底部的噴射管進 入反應(yīng)器的中央導(dǎo)流管使得中央導(dǎo)流 管

25、側(cè)的液體密度低于外部區(qū)域從而形 成循環(huán)。氣升式生物反應(yīng)器主要采用 內(nèi)循環(huán)式，但也有采用外循環(huán)式。 與攪拌式生長反應(yīng)器相比，氣升式生物反應(yīng)器產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相 當(dāng)小，反應(yīng)器內(nèi)沒有機械運動部件，因而細胞損傷率比較低；同時由于采用直接噴射 空氣供氧，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，能使細胞和營養(yǎng)成分均勻地分布于培養(yǎng)基 中。 表11-9列出了八種細胞的有關(guān)培養(yǎng)數(shù)據(jù)，可以看出同傳統(tǒng)的方法（培養(yǎng)瓶和滾培養(yǎng)瓶和滾 瓶瓶）相比，氣升反應(yīng)器的抗體產(chǎn)量平均提高平均提高4.6倍倍。 在氣升式生物反應(yīng)器中，溶氧的控制溶氧的控制可以通過自動調(diào)節(jié)進入空氣的速率來實現(xiàn)； PH值值可通過在進氣中加入二氧化碳或加入氫氧

26、化鈉來控制。 優(yōu)點優(yōu)點 請畫出氣升式反應(yīng)器的簡圖，并說說溶氧濃度和PH值是如何控制的？ 問題問題 表表11-9 氣升式反應(yīng)器和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的抗體產(chǎn)率比較氣升式反應(yīng)器和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的抗體產(chǎn)率比較 細胞系細胞系抗體類型抗體類型抗體產(chǎn)量，抗體產(chǎn)量，mm/l氣升式氣升式/傳傳 統(tǒng)統(tǒng) 培養(yǎng)瓶滾瓶 氣升式氣升式 1IgG1420865.1 2IgM701272953.0 3IgG910737.7 4IgG28301003.4 5IgG60762603.8 6IgM20251125.0 7IgG30382005.9 8IgG1201003503.2 圖圖11-3 中空纖維反應(yīng)器示意圖中空纖維反應(yīng)器示意圖 細

27、胞細胞 培養(yǎng)基入口培養(yǎng)基入口 培養(yǎng)基出口培養(yǎng)基出口 2、中空纖維管生物反應(yīng)器、中空纖維管生物反應(yīng)器 中空纖維管生物反應(yīng)器如圖11-3所 示，它的用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長 的細胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，細 胞的密度最高可達109/ml數(shù)量級。如果 控制系統(tǒng)不受污染，能長期運轉(zhuǎn)。已用 這種反應(yīng)器培養(yǎng)過的細胞型和生產(chǎn)的分 泌產(chǎn)物如表11-10所示。 生長的細胞型生長的細胞型 雜交瘤細胞、淋巴細胞、肝癌細胞、結(jié)腸癌細胞、胚胎細胞、乳 腺組織細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、成纖維細胞、垂體腫瘤細胞、 CHO細胞、BHK-2細胞、肺細胞等 分泌的產(chǎn)物分泌的產(chǎn)物IgG、IgM、IgA、干擾素、激素、尿激酶、蛋

28、白質(zhì)C、病毒蛋白、 乙型肝炎表面抗原、T抑制因子、促細胞生長素、白細胞介素等 空氣與空氣與CO2出口出口 空氣與空氣與CO2入口入口 中空纖維管生物反應(yīng)器已進入工業(yè)生產(chǎn)，中空纖維管生物反應(yīng)器已進入工業(yè)生產(chǎn)，主要用于主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆 抗體。（抗體。（重點掌握重點掌握） 3、通氣攪拌反應(yīng)器、通氣攪拌反應(yīng)器 通氣攪拌反應(yīng)器有哪些型式？ 問題問題 4、流化床生物反應(yīng)器、流化床生物反應(yīng)器 流化床生物反應(yīng)器的基本原理類似于 流態(tài)床化學(xué)反應(yīng)器，不同的是，流態(tài)化的 固體是帶有細胞細胞的微粒。培養(yǎng)液通過反應(yīng) 器垂直向上循環(huán)流動不斷提供給細胞必要 的營養(yǎng)成分，使細胞得以在微

29、粒中生長； 同時，不斷地加入新鮮的培養(yǎng)液，并不斷 地排除培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。圖11-7為生 產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應(yīng)器的示 意圖，這種反應(yīng)器的傳質(zhì)性能很好，并在 循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器膜氣體交換器，能快速提 供給高密度細胞所需的氧，同時排除代謝 產(chǎn)物；反應(yīng)器中的液體流速足以使細胞微 粒懸浮卻不會損壞脆弱的細胞。由于流化 床生物反應(yīng)器滿足了高密度細胞培養(yǎng)、使 高產(chǎn)量細胞長時間停留在所應(yīng)器中、優(yōu)化 細胞生長與產(chǎn)物合成的環(huán)境等細胞培養(yǎng)的 要求，流化床生物反應(yīng)器既可用于貼壁依 賴性細胞的培養(yǎng)，又可用于非貼壁依賴性 細胞的培養(yǎng)。表11-11為流化床生物反應(yīng)器 達到的細胞密度。 氣體交換氣

30、體交換 氧氣氧氣 回流回流 收獲收獲 營養(yǎng)液營養(yǎng)液 泵泵 反應(yīng)塔反應(yīng)塔 加熱器加熱器 PH 傳感器傳感器 T DO CO2 圖圖11-7 生產(chǎn)用生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生流化床生 物反應(yīng)器示意圖物反應(yīng)器示意圖 5、無泡沫攪拌生物反應(yīng)器（、無泡沫攪拌生物反應(yīng)器（了解了解） 表表11-11流化床生物反應(yīng)器與其它方法培養(yǎng)達到的細胞比較流化床生物反應(yīng)器與其它方法培養(yǎng)達到的細胞比較 培養(yǎng)類型培養(yǎng)類型細胞類型細胞類型細胞密度（個細胞密度（個/ml） 流化床雜交瘤0.3*108 貼壁依賴性細胞1.3*108 恒化器雜交瘤2*106 微載體攪拌釜貼壁依賴性細胞0.2*107-2*107 四、動物細胞培養(yǎng)

31、技術(shù) 動物細胞無論是貼壁培養(yǎng)或是懸浮培養(yǎng)，均可分為動物細胞無論是貼壁培養(yǎng)或是懸浮培養(yǎng)，均可分為分批式、流加式、半連續(xù)式、分批式、流加式、半連續(xù)式、 連續(xù)式連續(xù)式等多種培養(yǎng)方式。等多種培養(yǎng)方式。 1、分批式培養(yǎng)、分批式培養(yǎng) 定義 分批式培養(yǎng)是指先將細胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進行培分批式培養(yǎng)是指先將細胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進行培 養(yǎng)，細胞不斷生長，同時產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)養(yǎng)，細胞不斷生長，同時產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng) 后，終止培養(yǎng)。后，終止培養(yǎng)。 在細胞分批培養(yǎng)過程中，不向培養(yǎng)系統(tǒng)在細胞分批培養(yǎng)過程中，不向培養(yǎng)系統(tǒng) 補加營養(yǎng)物質(zhì)，而只向培養(yǎng)基通入氧，能夠補加營養(yǎng)物

32、質(zhì)，而只向培養(yǎng)基通入氧，能夠 控制的參數(shù)只有控制的參數(shù)只有PH、溫度和通氣量，因此、溫度和通氣量，因此 細胞所處的生長環(huán)境隨著營養(yǎng)物的消耗和產(chǎn)細胞所處的生長環(huán)境隨著營養(yǎng)物的消耗和產(chǎn) 物、副產(chǎn)物的積累時刻都在發(fā)生變化，不能物、副產(chǎn)物的積累時刻都在發(fā)生變化，不能 使細胞自始至終處于最優(yōu)的條件下，因而分使細胞自始至終處于最優(yōu)的條件下，因而分 批培養(yǎng)并不是一種很好的培養(yǎng)方式。分批培批培養(yǎng)并不是一種很好的培養(yǎng)方式。分批培 養(yǎng)過程的持征如圖養(yǎng)過程的持征如圖11-8所示。所示。 0 時間 分批 圖11-8 分批式培養(yǎng)過程的特征 營養(yǎng)物營養(yǎng)物 廢產(chǎn)物廢產(chǎn)物 PH、溫度、溫度、DO 0 培養(yǎng)時間（d） 細胞密度

33、 圖11-9分批式培養(yǎng)的生長曲線 對數(shù)生長期對數(shù)生長期 減速期減速期 平穩(wěn)期平穩(wěn)期衰退期衰退期 延滯期延滯期 為什么說采用分批式培養(yǎng)細胞效果不佳？ 問題問題 細胞分批式培養(yǎng)的生長曲線如圖11-9所示。在分批式培養(yǎng)過程中，細胞的生長可 分為延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期等五個階段。 2、流加式培養(yǎng)（、流加式培養(yǎng)（補料分批式） 定義 流加式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜的條流加式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜的條 件下接種細胞，進行培養(yǎng)，使細胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，而在件下接種細胞，進行培養(yǎng)，使細胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，而在 此過程中隨著營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消

34、耗，不斷地向系統(tǒng)中補充新的營養(yǎng)此過程中隨著營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補充新的營養(yǎng) 成分，使細胞進一步生長代謝，直到整個培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。成分，使細胞進一步生長代謝，直到整個培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。 流加式培養(yǎng)只是向培養(yǎng)系統(tǒng)補加必要的營養(yǎng)成分，以維持營養(yǎng)物質(zhì)的濃度流加式培養(yǎng)只是向培養(yǎng)系統(tǒng)補加必要的營養(yǎng)成分，以維持營養(yǎng)物質(zhì)的濃度 不變。由于流加式培養(yǎng)能控制更多的環(huán)境參數(shù)（不變。由于流加式培養(yǎng)能控制更多的環(huán)境參數(shù)（ ），使得細胞生長和產(chǎn)物生），使得細胞生長和產(chǎn)物生 成容易維持在優(yōu)化狀態(tài)。成容易維持在優(yōu)化狀態(tài)。 流加式培養(yǎng)有何特點？流加式培養(yǎng)有何特點？ （P219） 問題問題 0 時間 流加 圖

35、圖11-11 流加式培養(yǎng)過程的特征流加式培養(yǎng)過程的特征 PH、溫度、溫度、DO 廢產(chǎn)物廢產(chǎn)物 營養(yǎng)物營養(yǎng)物 根據(jù)流加控制方式不同，有兩種流加式培養(yǎng)方式根據(jù)流加控制方式不同，有兩種流加式培養(yǎng)方式：無反饋控制流加無反饋控制流加和和有反有反 饋控制流加饋控制流加。無反饋控制流加包括定流量加和間斷流加等；有反饋控制流加一般是。無反饋控制流加包括定流量加和間斷流加等；有反饋控制流加一般是 連續(xù)或間斷地測定系統(tǒng)中限制性營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，并以此為控制指標(biāo)來調(diào)節(jié)流加速連續(xù)或間斷地測定系統(tǒng)中限制性營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，并以此為控制指標(biāo)來調(diào)節(jié)流加速 率或流加液中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度等。率或流加液中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度等。 3、半連續(xù)

36、式培養(yǎng)、半連續(xù)式培養(yǎng) 半連續(xù)式培養(yǎng)又可稱為反復(fù)分批式培養(yǎng)，是指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)半連續(xù)式培養(yǎng)又可稱為反復(fù)分批式培養(yǎng)，是指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ) 上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并重新補充加入等量的新鮮培養(yǎng)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并重新補充加入等量的新鮮培養(yǎng) 基，從而使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變的培養(yǎng)方式。基，從而使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變的培養(yǎng)方式。 定義 4、連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng) 連續(xù)式培養(yǎng)是指將細胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)，連續(xù)式培養(yǎng)是指將細胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)， 一方面新鮮的培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)器液連續(xù)一方面新鮮的培養(yǎng)液不

37、斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)器液連續(xù) 不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。 定義 與分批式培養(yǎng)和半連續(xù)式培養(yǎng)不同，連續(xù)式培養(yǎng)可以保持細胞所處的環(huán)與分批式培養(yǎng)和半連續(xù)式培養(yǎng)不同，連續(xù)式培養(yǎng)可以保持細胞所處的環(huán) 境條件長時間地穩(wěn)定，可以使細胞維持在優(yōu)化的狀態(tài)下，促進細胞的生長和境條件長時間地穩(wěn)定，可以使細胞維持在優(yōu)化的狀態(tài)下，促進細胞的生長和 產(chǎn)物的形成。由于連續(xù)式培養(yǎng)過程中連續(xù)不斷地收獲產(chǎn)物，并能提高細胞密產(chǎn)物的形成。由于連續(xù)式培養(yǎng)過程中連續(xù)不斷地收獲產(chǎn)物，并能提高細胞密 度，在生產(chǎn)上已被應(yīng)用于培養(yǎng)非貼壁依賴性細胞。度，在生產(chǎn)上已被應(yīng)用于培養(yǎng)非貼壁

38、依賴性細胞。 請比較半連續(xù)式培養(yǎng)和連續(xù)式培養(yǎng)？請比較半連續(xù)式培養(yǎng)和連續(xù)式培養(yǎng)？ 問題問題 圖圖11-14 細胞灌注培養(yǎng)系統(tǒng)細胞灌注培養(yǎng)系統(tǒng) 實例實例 液位控制液位控制 細細 胞胞 懸懸 液液 細細 胞胞 新鮮培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)基 收液收液 過濾器過濾器 細胞培養(yǎng)系統(tǒng)細胞培養(yǎng)系統(tǒng) 動物細胞的連續(xù)培養(yǎng)一般是采用動物細胞的連續(xù)培養(yǎng)一般是采用灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng)。灌注培養(yǎng)是把細胞接種后進行培。灌注培養(yǎng)是把細胞接種后進行培 養(yǎng)，一方面連續(xù)向反應(yīng)器中注入新鮮的培養(yǎng)基，同時又連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)養(yǎng)，一方面連續(xù)向反應(yīng)器中注入新鮮的培養(yǎng)基，同時又連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng) 液，但是過程中液，但是過程中不取出細胞，細胞

39、仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細胞處于一種營養(yǎng)不不取出細胞，細胞仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細胞處于一種營養(yǎng)不 斷的狀態(tài)斷的狀態(tài)。當(dāng)高密度培養(yǎng)動物細胞時，必須確保補充給細胞以足夠的營養(yǎng)以及除。當(dāng)高密度培養(yǎng)動物細胞時，必須確保補充給細胞以足夠的營養(yǎng)以及除 去有素毒的代謝物。灌注培養(yǎng)時用新鮮的培養(yǎng)液進行灌注，可以確保上述目的的實去有素毒的代謝物。灌注培養(yǎng)時用新鮮的培養(yǎng)液進行灌注，可以確保上述目的的實 現(xiàn)。通過調(diào)節(jié)灌注速度，可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢代謝物低于抑制水平的現(xiàn)。通過調(diào)節(jié)灌注速度，可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢代謝物低于抑制水平的 狀態(tài)下。灌注培養(yǎng)過程的特征如圖狀態(tài)下。灌注培養(yǎng)過程的特征如圖11-13所示。所示。 0 時間 灌注 圖11-13 灌注培養(yǎng)過程的特征 PH、溫度、溫度、DO 廢產(chǎn)物廢產(chǎn)物營養(yǎng)物營養(yǎng)物 表表11-12不同培養(yǎng)方式對不同培養(yǎng)方式對CHO細胞細胞 生產(chǎn)