基因工程 比較TALEN技術(shù)與ZFN技術(shù)

1、-作者xxxx-日期xxxx基因工程 比較TALEN技術(shù)與ZFN技術(shù)【精品文檔】比較TALEN技術(shù)與ZFN技術(shù)重組鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）技術(shù)與轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)是可以對基因組進行定點修飾的基因編輯技術(shù)，可精確地定位到基因組的某一位點上并剪斷靶標DNA片段從而插入新的基因片段，從而對原基因組進行“編輯”。ZFN技術(shù)依賴于特異性識別并結(jié)合DNA的鋅指蛋白和FokI核酸內(nèi)切酶可剪切結(jié)構(gòu)域組成的融合蛋白，可切割特異DNA序列并引起DNA雙

2、鏈斷裂（double-strand breaks，DSB），DSB激活細胞的DNA修復(fù)機制，從而定點修飾基因組。TALEN是由轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）代替ZF與FokI核酸內(nèi)切割域組成的基因編輯工具。一、結(jié)構(gòu)與原理ZFN技術(shù)中，鋅指結(jié)構(gòu)域通常由3-6Cys2-His2型鋅指單元串聯(lián)而成，他們借助一個Zn2+形成構(gòu)象，其中螺旋中的-1，+3，+6位的三個氨基酸直接與靶DNA的三聯(lián)堿基相互作用。這三個殘基中的任一殘基的改變都會影響ZF對目標堿基的識別。根據(jù)目的基因設(shè)計8-10個鋅指結(jié)構(gòu)域并與FokI結(jié)合可構(gòu)成靶向特定位點的ZFNs，在FokI切割域的二聚化作用下完成對目的基因的編輯。TAL

3、E蛋白包括三部分：N端序列、C端序列、由高度保守的重復(fù)單元組成的中心重復(fù)區(qū)。每個重復(fù)單元中除12、13位氨基酸可變外其余幾乎相同，12、13位的兩個氨基酸被稱為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（repeat varible di-residues，RVDs）。RVD與A、T、C、G之間有著嚴格的對應(yīng)關(guān)系，即NI-A；NG-T； HD-C；NN-G。構(gòu)建TALE時，根據(jù)靶DNA序列變換RVDs并串聯(lián)重復(fù)單元并與FokI切割結(jié)構(gòu)域結(jié)合，TALE與靶位點結(jié)合，二聚化的FokI對其進行切割，完成基因編輯操作。二、ZFN、TALEN異同點比較與ZFN相比，TALEN的優(yōu)勢是十分明顯的。第一，TALEN簡化了ZFN

4、復(fù)雜的篩選過程，在簡單的分子克隆條件下就可構(gòu)建出高效的TALEN；第二，TALEN結(jié)合DNA序列更為嚴格，打靶效率高于ZFN；第三，TALEN降低了脫靶的可能性，從而降低了對受體細胞的毒性。詳細比較如下：共同點1. 二者均為人工改造的核酸內(nèi)切酶，由特異性識別靶DNA的識別域和非特異性剪切dsDNA的切割域，他們配合著行使功能，缺一不可。2. ZFN、TALEN中的FokI是源于黃單胞桿菌的一種限制性核酸內(nèi)切酶，它只有形成二聚體時才對dsDNA具有剪切活性。3. FokI切割DNA后的修復(fù)機制相同：在兩個靶位點之間剪切DNA，在DSB處誘發(fā)DNA的同源重組修復(fù)機制和非同源末端連接修復(fù)機制，從而達

5、到定點修飾。不同點1. 開發(fā)時間：最早的ZFN出現(xiàn)在18年前，而TALEN技術(shù)才于2007年問世。2. 靶DNA序列的識別：ZF結(jié)構(gòu)域識別的是三聯(lián)堿基，而TALEN結(jié)構(gòu)域識別的是某特定的核苷酸。例如：某蛋白包括兩個鋅指結(jié)構(gòu)域，可識別六個堿基；而當它包括兩個TALEN結(jié)構(gòu)域時即兩個RVD，僅能識別兩個堿基。此外，TALEN的RVD與堿基之間的對應(yīng)關(guān)系與物種、細胞、DNA序列無關(guān)，并且設(shè)計簡單，成本低，與ZFN相比活性更高。3. 上下文依賴效應(yīng)：ZFN在識別DNA序列時，重復(fù)氨基酸之間會產(chǎn)生相互作用，也就是上下文依賴效應(yīng)，從而使得識別的特異性發(fā)生了改變，影響基因修飾效率。還未見TALEN上下文依賴

6、效應(yīng)的相關(guān)報道。4. 對細胞的毒性效應(yīng)：鋅指酶切割DNA時易產(chǎn)生脫靶現(xiàn)象，對細胞產(chǎn)生了毒副作用。TALEN脫靶情況較少，毒性小。例如：通過點對點地比較二者對人細胞內(nèi)源基因CCR5的刪除效果，發(fā)現(xiàn)在效率大體相同的情況下，目前實驗數(shù)據(jù)顯示TALE所產(chǎn)生的細胞毒性比ZFN小得多。5. 靶向基因序列長度：與ZFN相比，TALEN可以識別更長的靶基因序列。三、存在的問題與展望目前，ZFN技術(shù)還存在以下困惑：鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合的特異性、親和性有待提高；如何讓解決ZFN的高效導(dǎo)入、可調(diào)控切、瞬時表達問題；ZFN對細胞的潛在綜合作用需進行綜合評價，并對引起的潛在免疫反應(yīng)，尤其是針對于源于細菌的FokI結(jié)構(gòu)域的客觀評價。同樣地，TALEN技術(shù)還存在以下問題：設(shè)計識別20個堿基含有1000多個氨基酸的TALEN蛋白，會引起機體的免疫應(yīng)答，降低了其在細胞中的打靶效率；TALEN同樣會產(chǎn)生脫靶的現(xiàn)象，可能由于細胞中染色體的狀態(tài)引起，如TALEN技術(shù)對于異染色質(zhì)化的基因無效； TALEN技術(shù)的應(yīng)用主要集中在基因敲除方面，但是否適合大片段基因的插入尚不明確。ZFN、TALEN技術(shù)為人們定向改造基因提供了基礎(chǔ)，但相關(guān)應(yīng)用還處于初級階段，但他們在轉(zhuǎn)基因動、植物的研究方面尤其