生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-酵母RNA的分離、組分鑒定及含量分析ppt課件

1、 1 1、掌握稀堿法分別酵母、掌握稀堿法分別酵母RNARNA的原理與操作過程。的原理與操作過程。 2 2、了解、了解RNARNA的組分并掌握定性鑒定的詳細(xì)方法。的組分并掌握定性鑒定的詳細(xì)方法。 3 3、學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定核酸含量的原理、學(xué)習(xí)紫外分光光度法測定核酸含量的原理 和操作方法。和操作方法。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 1. 核酸分別核酸分別 原理原理 酶促水解酶促水解 化學(xué)水解化學(xué)水解: : 酸水解酸水解: :堿基、核糖堿基、核糖/ /脫氧核糖和磷酸脫氧核糖和磷酸 堿水解堿水解:RNA:RNA存在存在2-OH2-OH，磷酸二酯鍵不穩(wěn)定，磷酸二酯鍵不穩(wěn)定， 得單核苷酸得單核苷酸 2. 2

2、. 組分鑒定組分鑒定 RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶堿和磷酸組成，提獲得的 RNA 中加 10% 硫酸煮沸即可得到這些組分的混合溶液 $，分別進(jìn) 展定性鑒定，以證明提取物能否為核酸。 原理原理 CHO CHOH CH2OH ()3 thick HCl O CHO CH3 HOOH F3+ Green substance 3. RNA含量測定含量測定 核酸核酸DNADNA和和RNARNA堿基的苯環(huán)構(gòu)造在紫外區(qū)有較強(qiáng)吸收，堿基的苯環(huán)構(gòu)造在紫外區(qū)有較強(qiáng)吸收， 吸收頂峰在吸收頂峰在260nm260nm波優(yōu)點(diǎn)，蛋白質(zhì)那么在波優(yōu)點(diǎn)，蛋白質(zhì)那么在280nm280nm波優(yōu)點(diǎn)。波優(yōu)點(diǎn)。 當(dāng)當(dāng)OD260OD2601

3、1時(shí)，時(shí)，dsDNAdsDNA濃度約為濃度約為50g / ml50g / ml ssDNA ssDNA濃度約為濃度約為37g / ml37g / ml RNA RNA濃度約為濃度約為40g / ml40g / ml 純純DNADNA：OD260/OD2801.8OD260/OD2801.8 ( (1.9,1.9,闡明有闡明有RNARNA污染；污染；1.61.6，闡明有蛋白質(zhì)、酚等污，闡明有蛋白質(zhì)、酚等污 染染 純純RNARNA：1.7 1.7 OD260/OD280OD260/OD2802.02.0 1.71.7時(shí)闡明有蛋白質(zhì)或酚污染時(shí)闡明有蛋白質(zhì)或酚污染, ,可以添加酚可以添加酚 / /氯仿

4、抽提氯仿抽提 OD260/OD280OD260/OD280的比值用于估計(jì)核酸的純度的比值用于估計(jì)核酸的純度,OD260/OD230,OD260/OD230估計(jì)去估計(jì)去 鹽的程度。鹽的程度。 對(duì)于對(duì)于RNARNA純制品，其純制品，其OD260/OD2802.0OD260/OD2802.0，OD260/OD230OD260/OD230應(yīng)大于應(yīng)大于2 2。 OD260/OD2302 OD260/OD2302闡明去鹽不充分闡明去鹽不充分, , 可以再次沉淀和可以再次沉淀和70%70%乙醇洗乙醇洗 滌。滌。 濃度計(jì)算：濃度計(jì)算： DNADNA樣品的濃度樣品的濃度g / lg / l:OD260:OD26

5、0稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)50/100050/1000 RNARNA樣品的濃度樣品的濃度g / lg / l：OD260OD260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)40/100040/1000 1 1提取提取 稱取干酵母粉稱取干酵母粉0.4g0.4g，放入試管中，參與，放入試管中，參與0.2% NaOH 3mL0.2% NaOH 3mL，然后放入沸，然后放入沸 水浴中提取水浴中提取15min15min。 2 2分別分別 用自來水冷卻用自來水冷卻, ,滴加滴加1-41-4滴醋酸，調(diào)滴醋酸，調(diào)pHpH至至6.06.0沉淀蛋白質(zhì)，裝入離沉淀蛋白質(zhì)，裝入離 心管配平，心管配平，3000r/min3000r/min離心離心3mi

6、n3min，使提取液與菌體殘?jiān)謩e。，使提取液與菌體殘?jiān)謩e。 3 3抽提抽提 搜集上清液，加等體積的氯仿，震蕩混勻，搜集上清液，加等體積的氯仿，震蕩混勻，3500r/min3500r/min離心離心5min5min。 4 4沉淀沉淀RNARNA 搜集上清，平均分裝入兩支離心管中，各加搜集上清，平均分裝入兩支離心管中，各加2 2倍體積無水乙醇，邊加倍體積無水乙醇，邊加 邊攪拌，配平，邊攪拌，配平，3500r/min3500r/min離心離心5min5min，得到，得到RNARNA沉淀。沉淀。 棄去上清液棄凈，一支離心管加棄去上清液棄凈，一支離心管加5mL5mL蒸餾水回溶，以備濃度測定；蒸餾水回

7、溶，以備濃度測定； 另一支離心管參與另一支離心管參與5mL 10%5mL 10%的的 H2SO4, H2SO4,然后轉(zhuǎn)入然后轉(zhuǎn)入50mL50mL三角瓶中，待用。三角瓶中，待用。 操作步驟操作步驟 留意配平、對(duì)稱放置離心管留意配平、對(duì)稱放置離心管 RNARNA的酸解的酸解 將裝有待測將裝有待測RNARNA的三角瓶，在電爐上加熱，至溶液透明為的三角瓶，在電爐上加熱，至溶液透明為 止，得到止，得到RNARNA的水解液，期間不?；蝿?dòng)，以使受熱均勻。的水解液，期間不停晃動(dòng)，以使受熱均勻。 留意留意 RNARNA加熱酸解時(shí)，一定留意察看，本步很容易加熱過度，加熱酸解時(shí)，一定留意察看，本步很容易加熱過度，

8、使透明溶液變成黑褐色，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。使透明溶液變成黑褐色，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。 5.RNA5.RNA的組分鑒定的組分鑒定 檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)項(xiàng)目 嘌呤嘌呤 核糖核糖 磷酸磷酸 水水 解解 液液1mL1mL1mL1mL1mL1mL 試試 劑劑 NHNH3 3HH2 2O 2mL O 2mL AgNOAgNO3 3 1mL 1mL 苔黑苔黑-FeCl-FeCl3 3 1mL 1mL 定磷試劑定磷試劑 1mL 1mL SnClSnCl2 2 1-2 1-2滴滴 反應(yīng)條件反應(yīng)條件 不振動(dòng)不振動(dòng) 觀察現(xiàn)象觀察現(xiàn)象 沸水浴約沸水浴約10min10min 振蕩混勻振蕩混勻 室溫放置室溫放置 現(xiàn)現(xiàn) 象象 白色絮狀沉淀

9、白色絮狀沉淀 鮮綠色鮮綠色 蘭色蘭色 組分鑒定組分鑒定 加蒸餾水將水解液稀釋至加蒸餾水將水解液稀釋至5mL5mL，然后按下表檢驗(yàn)，然后按下表檢驗(yàn) 工程所需的量分裝三支試管中，進(jìn)展組分鑒定。工程所需的量分裝三支試管中，進(jìn)展組分鑒定。 待測樣品適當(dāng)稀釋如量取待測樣品適當(dāng)稀釋如量取100L RNA100L RNA水溶液，加水溶液，加2900L 2900L 蒸餾水混勻，用紫外分光光度計(jì)分別測定其蒸餾水混勻，用紫外分光光度計(jì)分別測定其230nm230nm、 260nm 260nm 和和280nm 280nm 的吸光度值。的吸光度值。 可根據(jù)本人的樣品濃度調(diào)整稀釋倍數(shù)?？筛鶕?jù)本人的樣品濃度調(diào)整稀釋倍數(shù)。

10、黑體透射調(diào)零黑體透射調(diào)零 蒸餾水透射調(diào)蒸餾水透射調(diào)100100 吸收調(diào)零吸收調(diào)零 6.RNA6.RNA含量測定含量測定 留意維護(hù)石英比色皿，輕拿輕放！留意維護(hù)石英比色皿，輕拿輕放！ 配平：含液離心管與外套鐵管在一同兩組配平先選兩個(gè)配平：含液離心管與外套鐵管在一同兩組配平先選兩個(gè) 外套鐵管分量接近對(duì)稱放于離心機(jī)的鐵套中。外套鐵管分量接近對(duì)稱放于離心機(jī)的鐵套中。 設(shè)置：閉蓋，選離心機(jī)設(shè)置鍵設(shè)置：閉蓋，選離心機(jī)設(shè)置鍵“亮點(diǎn)在轉(zhuǎn)速和時(shí)間的亮點(diǎn)在轉(zhuǎn)速和時(shí)間的 選擇上：可經(jīng)過三角符號(hào)移位，然后再增減，設(shè)置數(shù)都選擇上：可經(jīng)過三角符號(hào)移位，然后再增減，設(shè)置數(shù)都 完成后再按確認(rèn)鍵。完成后再按確認(rèn)鍵。 啟動(dòng)：使啟動(dòng)：使“亮點(diǎn)回到測定位置，按啟動(dòng)鍵。轉(zhuǎn)動(dòng)期間蓋亮點(diǎn)回到測定位置，按啟動(dòng)鍵。轉(zhuǎn)動(dòng)期間蓋 子打不開。子打不開。 假設(shè)聲音很大異常。立刻按停頓鍵。假設(shè)聲音很大異常。立刻按停頓鍵。 離心機(jī)的運(yùn)用離心機(jī)的運(yùn)用 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)景象闡明鑒定的結(jié)果，由結(jié)果進(jìn)一步闡明經(jīng)過實(shí)驗(yàn)景象闡明鑒定的結(jié)果，由結(jié)果進(jìn)一步闡明 他的提取物是什么？他的提取物是什么？ 計(jì)算計(jì)算RNARNA溶液濃度及酵母溶液濃度及酵母RNARNA得率，并判別樣品純度。得率，并判別樣品純度。 將組分定性鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果交教師過目評(píng)分，然后清將組分定性鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果交教師過目評(píng)分，然后清 洗離心管，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)，器具歸位，