柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件

1、柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱柱 色色 譜譜 Column Chromatography 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 了了 解：解： 1. 柱色譜法分離有機(jī)物的原理。 2固定相和流動(dòng)相的選擇原則。 掌掌 握：握： 1. 色譜柱的填充方法。 2柱色譜分離的基本操作。 一、實(shí)一、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 目目 的的 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 色色 譜譜 法法 簡(jiǎn)簡(jiǎn) 介介 色譜法亦稱色層法，色譜法亦稱色層法， 層析法等，是層析法等，是分離，純化分離，純化 和鑒定和鑒定有機(jī)化合物的重要有機(jī)化合物的重要 方法之一，還可方法之一，還可定量分析定量分析。 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 色譜法分類色譜法分類 固定相、流動(dòng)相的物理狀態(tài)固定相、流動(dòng)相的物理狀態(tài)

2、 操作形式操作形式 分離原理分離原理 液液固色譜法固色譜法 氣氣固色譜法固色譜法 氣氣液色譜法液色譜法 液液液色譜法液色譜法 柱色譜法（柱色譜法（column chromatography） 薄層色譜法（薄層色譜法（TLC） 紙色譜法（紙色譜法（paper chromatographypaper chromatography） 氣相色譜（氣相色譜（GCGC） 高效液相色譜（高效液相色譜（HPLCHPLC） 吸附色譜法吸附色譜法 分配色譜法分配色譜法 離子交換色譜法離子交換色譜法 排阻色譜排阻色譜 操作形式操作形式 柱色譜法（柱色譜法（column chromatography） 二、實(shí)二、實(shí)

3、驗(yàn)驗(yàn) 原原 理理 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離示意圖柱色譜分離示意圖 混合物混合物 吸附劑吸附劑(固定相固定相) 洗脫劑洗脫劑(流動(dòng)相流動(dòng)相) 二、實(shí)二、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 原原 理理 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 二、實(shí)二、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 原原 理理 吸附劑的性質(zhì)：吸附劑的性質(zhì)：均勻、均勻、 表面積大、不反應(yīng)、表面積大、不反應(yīng)、 吸附能力不同吸附能力不同 化合物的結(jié)構(gòu)：化合物的結(jié)構(gòu)：化合化合 物的吸附性和它們的物的吸附性和它們的 極性成正比極性成正比 洗脫劑的極性：洗脫劑的極性：溶解溶解 度適中、不反應(yīng)、易度適中、不反應(yīng)、易 獲取回收獲取回收 影響分離效果主要因素影響分離效果

4、主要因素 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 和 和 在氧化鋁柱子上若分離下列各組混合物，哪一個(gè)組分先被洗脫下來(lái)？ 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容 裝柱裝柱加樣加樣洗脫洗脫收集收集鑒定鑒定 干法：干法：10g 硅膠硅膠 +乙醇 乙醇 先用乙醇先用乙醇 后用水后用水 操作操作 組分顏色組分顏色 組分顏色組分顏色 1mL樣品樣品 加樣操作加樣操作 0.5mL

5、2乙醇洗滌乙醇洗滌 柱色譜操作柱色譜操作： 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 步步 驟驟: 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 吸附劑裝填緊密，排除吸附劑裝填緊密，排除 氣泡。最終應(yīng)使吸附劑的上氣泡。最終應(yīng)使吸附劑的上 端平整，無(wú)凹凸面，無(wú)斷層。端平整，無(wú)凹凸面，無(wú)斷層。 u 干法裝柱干法裝柱 u 濕法裝柱濕法裝柱 裝裝 柱柱 三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 裝柱時(shí)應(yīng)該注意均勻，不能有氣泡，裂縫， 否則樣品可能順縫隙流動(dòng)而不吸附，影響 樣品的分離，應(yīng)用質(zhì)軟的物體如吸耳球等 輕輕敲擊柱身，促使吸附劑裝填緊密，排 除氣泡。最終應(yīng)使吸附劑的上端平整，無(wú) 凹凸面 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 樣品為液體，可直接加樣；樣品為固體，

6、可選樣品為液體，可直接加樣；樣品為固體，可選 擇合適溶劑溶解為液體再加樣。加樣時(shí)，要沿管擇合適溶劑溶解為液體再加樣。加樣時(shí)，要沿管 壁慢慢加入至柱頂部，勿使壁慢慢加入至柱頂部，勿使樣品攪動(dòng)吸附劑表面樣品攪動(dòng)吸附劑表面。 加加 樣樣 三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 洗洗 脫脫 在柱頂不斷加入洗脫劑，使 洗脫劑永遠(yuǎn)保持有適當(dāng)?shù)牧?，?要讓洗脫劑表面流干，使流動(dòng)相 流速適當(dāng)。 三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 洗脫時(shí)應(yīng)注意： （1）向柱內(nèi)加入95%乙醇溶液洗脫（可以通過(guò)注射器沿管壁或安 裝滴液漏斗）在恒壓或加壓條件下進(jìn)行洗脫?？刂屏鞒鏊俣?滴/秒。 逐漸出現(xiàn)色層

7、帶分離。 （2）第一色層帶到達(dá)色譜柱底部時(shí)，立即用錐形瓶收集第一色層 的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脫時(shí)切勿使溶劑流干！ （3）然后，改用水溶液作為洗脫劑，當(dāng)?shù)诙珜訋У竭_(dá)色譜柱底 部時(shí)，立即收集第二色層的的溶液，直到其完全被洗出。 （4）用量筒分別量取所分離出來(lái)的兩種溶液的體積后，倒入指定 的回收瓶中。 （5）分離結(jié)束后，應(yīng)先讓溶劑盡量流干，然后倒置，用吸耳球從 活塞 向管內(nèi)擠壓空氣，將吸附劑從柱頂擠壓出。使用過(guò)的吸附劑倒 入垃圾桶里。 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 試樣有色試樣有色，在層析柱上可直接觀察。洗脫后，在層析柱上可直接觀察。洗脫后 分別收集各個(gè)組分。分別收集各個(gè)組分。 收收 集集 試

8、樣無(wú)色，試樣無(wú)色，收集洗脫液時(shí)，多采用等份收收集洗脫液時(shí)，多采用等份收 集，每份洗脫劑的體積隨所用吸附劑的量及試樣集，每份洗脫劑的體積隨所用吸附劑的量及試樣 的分離情況而定。收集的每份洗脫劑的體積越小，的分離情況而定。收集的每份洗脫劑的體積越小， 分離效果越好。分離效果越好。 三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容 鑒鑒 定定 試樣有色試樣有色 依據(jù)顏色直接鑒定依據(jù)顏色直接鑒定 試樣無(wú)色試樣無(wú)色 可結(jié)合薄層色譜結(jié)果可結(jié)合薄層色譜結(jié)果 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 玻砂防堵塞 裝柱需緊密 加壓不可大 溶劑勿流干 四、注四、注 意意 事事 項(xiàng)項(xiàng) 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件

9、 色譜法在有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用: u分離混合物 u精制提純化合物 u利用比移值(Rf)鑒定化合物 u跟蹤反應(yīng)進(jìn)程 小小 結(jié)結(jié) 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 色譜法的特點(diǎn): u分離效率高 復(fù)雜混合物,同系物,異構(gòu)體等。 u靈敏度高 可以檢測(cè)出g g-1(10-6)級(jí)甚至ng g-1(10-9) 級(jí)的物質(zhì)量。 u分析速度快 幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試 樣分析。 小小 結(jié)結(jié) 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 柱色譜法分離甲基橙和甲基藍(lán)柱色譜法分離甲基橙和甲基藍(lán) 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 甲基橙和亞甲基藍(lán)均為指示劑,它們的結(jié)構(gòu)式如下所示: 甲基橙甲基橙 亞甲基藍(lán) 由于甲基橙和亞甲基藍(lán)的由于甲基橙和亞甲基藍(lán)的結(jié)構(gòu)

10、不同結(jié)構(gòu)不同,極性不同極性不同,吸附劑對(duì)它們吸附劑對(duì)它們 的吸附能力不同的吸附能力不同,洗脫劑對(duì)它們的解析速度也不同洗脫劑對(duì)它們的解析速度也不同,極性小、吸附能極性小、吸附能 力弱力弱、解析速度快的解析速度快的亞甲基藍(lán)先被洗脫下來(lái)亞甲基藍(lán)先被洗脫下來(lái)，而，而極性大、吸附能力強(qiáng)極性大、吸附能力強(qiáng)、 解析速度慢的解析速度慢的甲基橙后被洗脫下來(lái)甲基橙后被洗脫下來(lái)，從而使兩種物質(zhì)得以分離。本實(shí)，從而使兩種物質(zhì)得以分離。本實(shí) 驗(yàn)以硅膠為吸附劑，驗(yàn)以硅膠為吸附劑，95%乙醇作為洗脫劑，先洗出亞甲基藍(lán)，再用蒸乙醇作為洗脫劑，先洗出亞甲基藍(lán)，再用蒸 餾水作洗脫劑把甲基橙洗脫下來(lái)。餾水作洗脫劑把甲基橙洗脫下來(lái)。

11、 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容 裝柱裝柱加樣加樣洗脫洗脫收集收集鑒定鑒定 干法：干法：10g 硅膠硅膠 +乙醇 乙醇 先用乙醇先用乙醇 后用水后用水 操作操作 組分顏色組分顏色 組分顏色組分顏色 1mL樣品樣品 加樣操作加樣操作 0.5mL2乙醇洗滌乙醇洗滌 柱色譜操作柱色譜操作： 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 步步 驟驟: 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 儀器和試劑儀器和試劑 1.儀器 錐形瓶、玻璃漏斗、色譜柱 2.試劑 柱層析硅膠、脫脂棉、乙醇（95%）甲 基橙、亞甲基藍(lán)。 H2O 95 %乙醇 = 1 1 (A 液) 0. 2mol L -1HCl 95 %乙醇 = 1 1 (B 液) 柱色譜分

12、離實(shí)驗(yàn)課件 裝置圖裝置圖 裝柱裝柱 洗脫洗脫 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 裝柱裝柱： 1、裝色譜柱： （1）取一支色譜柱，在柱子的收縮部塞一小團(tuán)脫脂棉花將色譜柱垂 直固定在鐵架臺(tái)上。 (2) 關(guān)閉活塞，向柱中倒入蒸餾水（也是洗脫劑，至柱體積的 1/2） （3）填吸附劑：稱取10g 硅膠于小燒杯中 ,加入 15mL 蒸餾水 ,用玻 璃棒調(diào)好通過(guò)漏斗慢慢裝入玻璃柱, 使其逐漸沉入底 部。用洗耳球敲打柱身使硅膠裝填緊密，打開(kāi)活塞，用小錐型 瓶承接, 控制滴速為1 滴秒,裝完后在上面加一層脫脂棉（ ，操作時(shí)要注意吸附劑始終不能露出液面）。 柱色譜分離實(shí)驗(yàn)課件 實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)） 加樣：加樣：當(dāng)液面剛好流至脫脂棉平面相切時(shí)，立刻關(guān)閉活塞， 加入 5mL左右的A 液 ,當(dāng) 硅膠面又將要露出時(shí) ,關(guān)緊活塞 ,用量筒準(zhǔn)確加入 0. 50mL 以 A 液做溶劑的混合液(含甲 基橙和亞甲基藍(lán)各為 0. 400 g L -1) 。 洗脫：洗脫：