熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)1 擴(kuò)增目的片段擴(kuò)增包含靶基因與mirna互補(bǔ)位點(diǎn)的3utr序列以及mutant序列，上下游引物5端各含有不同的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基（如pme i，spe i）；電泳檢測目的條帶，看大小是否正確，然后用試劑盒純化pcr產(chǎn)物備用。主要采用了2 種方法進(jìn)行序列突變及擴(kuò)增，如下圖所示：第一種方法：第二種方法：1.2 取1-2 g純化的目的片段或pmir-report載體，按酶切反應(yīng)體系配制混合液進(jìn)行酶切（加0.01% bsa），酶切3h后，80滅活5 min，冰上降溫。酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。 酶切體系連接體系component v olume (l) component

2、v olume (l) h2o 16-x h2o 8-m-n vector or dna x vector mneb buffer i或iv 2 dna nspe i 1 10t4 ligase buffer 1pme i 1 t4 dna ligase 1total voloume 20 total voloume 101.3 配制連接反應(yīng)混合液（dna和plasmid的molar ratio為3:1到6:1），16連接過夜或室溫連接10 min。連接完畢后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌（熱激法）。amp（100 g/ml）抗性培養(yǎng)板篩選陽性克隆，菌落pcr鑒定目的片段，送3個(gè)樣本測序，提

3、取質(zhì)粒酶切鑒定等。并擴(kuò)繁陽性克隆。重組luc-3utr 質(zhì)粒主要元件和組成如下圖所示（重組luc-3utr-mut 原理相同）：pluc-met 3utr 熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建4.接種對數(shù)生長期的hek293細(xì)胞（10% fbs+90% dmem培養(yǎng)）于96孔板，3103個(gè)/孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，37，5% co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；5.根據(jù)lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，配制轉(zhuǎn)染液，轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞；a 液b液pluc-3utr 0.1 g lipofectamine 2000 0.5 lprl-sv40 0.05 g opti-mem 25 lmimic

4、/nc 100 nm終濃度opti-mem 25 l6 轉(zhuǎn)染48 h后，吸除96孔板中的培養(yǎng)液，用ddh2o稀釋passive lysis buffer至1濃度，在96孔板中加入1passive lysis buffer，20 l/孔，用移液槍反復(fù)吸打裂解細(xì)胞；7 在白色不透明的96孔板中加入100 l/孔的luciferase assay substrate；8 從每孔裂解好的細(xì)胞懸液中吸出11.5 l加入luciferase assay substrate中混勻；9 在酶標(biāo)儀500 ms條件下檢測，并記錄數(shù)據(jù)；10 用stop & glo? buffer稀釋stop & glo? substrate至1使用濃度；11 在第7步完成后，加入stop & glo? substrate 1