primer3 攻略

1、-作者xxxx-日期xxxxprimer3 攻略【精品文檔】開始之前：其實非常簡單，不需要你下載任何軟件，但是你得有一臺電腦能上網(wǎng)。當然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本次討論范圍。另外，要先對PCR目的序列的長度有個大致估計，好了，馬上開始吧：第一步：找到Primer3的站點。你不用記住這個站點，但是要記住“Primer3”這個詞，然后打開GOOGLE首頁，輸入Primer3，跳出來的第一個項目就是了“Primer3 Input 0.4.0 ”，網(wǎng)址是。第二步：貼上模板序列。進入Primer3站點，可以看到一個引物設計的界面。（如下圖）在“Paste s

2、ource sequence below (5-3”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進去。注意是5-3方向的，數(shù)字或者空格都沒關(guān)系，軟件會自動過濾的。第三步：重要參數(shù)設定。首先是“Product Size Ranges ”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調(diào)整的就是這個參數(shù)。默認的參數(shù)實際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預期，盡可能把范圍改小，比如480-500，具體看情況調(diào)整。第二個參數(shù)是“Primer Size”，默認值一般可以用，但是，當你用熟了這個軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個參數(shù)是“Primer Tm ”這個和Primer Size差

3、不多。第四步：Pick primers： 點一下這個按鈕，符合你大小預期的primer就出來了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer出來了，而且有primer在序列上的位置比對圖，還要primer本身的信息，包括位置，長度，Tm，GC含量，任何位置互補堿基數(shù)，3端互補堿基數(shù)，以及引物序列，（注意，下游引物是5-3），還要產(chǎn)物大小，兩引物間任意互補堿基數(shù)，兩引物間3端互補堿基數(shù)等。如果引物尚在參數(shù)設定的范圍內(nèi)，但還不是最佳，將會給出警告。比如（隨便舉例，本人在做一個超長引物）：WARNING: Left primer is unacceptable: High 3

4、 stabilityOLIGO start len tm gc% any 3 seq LEFT PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCE SIZE: 1388INCLUDED REGION SIZE: 1388第五步：引物設計檢驗：可以僅僅設計一對引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的

5、勾勾掉一個就可以。也可以自己定義引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的書寫反向仍然是5-3）如果符合設定的條件，軟件將對給出引物評分，同時給出警告信息，根據(jù)警告信息可以適當對自定義引物做些調(diào)整即可，警告信息也讓你做實驗的時候心中有數(shù)。對于文獻發(fā)表的引物，最好都要檢查一下，這樣就可以避免被別人有意無意誤導。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。實際做引物的時候，要把內(nèi)含子都去掉，僅僅把外顯子序列放入源序列框中，并且通過自定義引物設計的方法，使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內(nèi)含子和外顯子以及電子PCR，將另做說明。至于設計出來的引物的實際效果，根據(jù)我的經(jīng)驗，一般情況下都能做到PCR