大鼠胰腺發(fā)育過程中Munc13(一).doc

1、大鼠胰腺發(fā)育過程中Munc13(一)作者：袁慶新，劉超，滕麗萍，劉翠萍，周錦勇，郭靖，程梅，德偉【關(guān)鍵詞】胚胎胰腺發(fā)育EffectofMunc131oninsulinsecretionduringpancreaticdevelopmentinrats【Abstract】AIM:ToinvestigatetheexpressionofMunc131duringvariousstagesofembryonicpancreaticdevelopmentinratsanddefinetheeffectofMunc131oninsulinsecretion.METHODS:Pancreataofrate

2、mbryonicday12.5（ E12.5 ） ,E15.5,E18.5,newborn,21dafterbirth （ P21 ）andadultratsweredissectedundermicroscoperespectively.Inaddition,theanimalmodelsofintrauterinegrowthretardation(IUGR)inratsweremadeby50%calorierestrictioninpregnantratsfromgestationalday15untilterm.AfterabstractionoftotleRNAandprotein

3、,thetechniquesofRTPCR,realtimePCR,WesternblotandELISAwereusedtostudytheexpressionofMunc131andinsulinsecretion.R ESULTS:ThegenesofinsulinandMunc131begantobeexpressedfromE12.5and E15.5respectivelyandtheirexpressionswereincreasedasthefetusgrew.Theres ultofWesternblotshowedthattheexpressionofMunc131wasl

4、owatE15.5andE 18.5andincreasedlater.BloodinsulinlevelwasdetectedatE18.5andincreasedr apidlythereafter.ThebloodinsulinlevelandtheexpressionofMunc131werered ucedsimultaneouslyinIUGRmodelscomparedwithnormalnewbornrats.CON CLUSION:TheexpressionofMunc131isaccordanttobloodinsulinlevelandplaysanessentialro

5、leininsulinexocytosis.【Keywords】Munc131;insulin/secretion;embryonicpancreaticdevelopment;diabetesmellitus;IUGR【摘要】目的：研究大鼠胰腺發(fā)育不同階段Munc131基因及蛋白表達(dá)的變化及 Munc131 在胰島素釋放過程中的作用.方法：應(yīng)用顯微分離及提取技術(shù)獲得大鼠胚胎發(fā)育12.5d（E12.5）,E15.5,E18.5,新生大鼠 ,出生后 21d（P21）及成年大鼠胰腺組織；另外，從大鼠胚胎發(fā)育15d 開始給予孕鼠半量飲食，造成宮內(nèi)發(fā)育遲緩動物模型，提取其新生大鼠胰腺組織 .采用 RT

6、PCR,RealtimePCR和 Westernblot 技術(shù)確定 Munc131 的表達(dá)情況，并測定不同發(fā)育時期血中胰島素濃度.結(jié)果：胰島素基因從E12.5 開始出現(xiàn)， Munc131 基因從 E15.5 開始表達(dá)，隨著胎齡的增長，二者表達(dá)量皆增多 .E15.5和 E18.5時 munc131 蛋白表達(dá)量較少，以后明顯增多 .自 E18.5 即檢測到血中胰島素的存在，隨著胚胎的發(fā)育，血胰島素濃度逐漸升高 .宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠血胰島素濃度低，同時 Munc131 基因及蛋白表達(dá)量亦比正常對照組明顯減少.結(jié)論：Munc131 在胰島素釋放過程中的作用，隨著胚胎發(fā)育期胰島素分泌的增

7、多表達(dá)也增加， 宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠胰島素分泌減少時，Munc131的表達(dá)亦減少 .【關(guān)鍵詞】 Munc131；胰島素 / 分泌；胚胎胰腺發(fā)育；糖尿??；宮內(nèi)發(fā)育遲緩0 引言胰島素在細(xì)胞內(nèi)合成后，以分泌顆粒的形式貯存在大致密囊泡中，在營養(yǎng)物質(zhì)（葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等）、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等刺激下，進入血循環(huán)，完成其調(diào)節(jié)體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)生長發(fā)育，控制血糖動態(tài)平衡的生理作用 1-2.業(yè)已證實，胞吐過程是涉及許多蛋白因子的復(fù)雜過程，可溶性N 甲基馬來酰胺融合蛋白附著蛋白受體(solublenethylmaleimidesensitivefusionproteinattachmentproteinr

8、eceptors,SNARE)復(fù)合體是胞吐過程所必須的分子構(gòu)件；Munc，Synaptotagmin，Rab 等蛋白家族的不同成員是其重要的調(diào)節(jié)因子.這些因子在神經(jīng)遞質(zhì)胞吐中研究得較多，但他們在胰島素分泌過程中的確切作用及其精細(xì)功能如何尚無定論 3-5.我們運用基因芯片技術(shù)，已建立了大鼠不同發(fā)育階段基因表達(dá)譜，初步明確了胰島素釋放的完善過程中相關(guān)基因的表達(dá)情況，在此基礎(chǔ)上，我們重點從胰島素釋放關(guān)鍵因子之一Munc131 入手，探討正常及異常胰腺發(fā)育情況下Munc131 表達(dá)的變化，闡述其在胰島素釋放過程中所起的重要作用，以期尋找糖尿病治療的新靶點 .1 材料和方法1.1 材料 SD大鼠由南京醫(yī)

9、科大學(xué)實驗動物中心提供.18：00 將雌雄鼠合籠 ，次日晨 檢測有 陰栓者 定為孕0.5d （ E0.5），分 別于受 精后12.5d(E12.5),15.5d(E15.5),18.5d(E18.5)，經(jīng)頸椎脫臼處死孕鼠，剖腹取出孕子宮，分離胚胎，取出胰腺（E12.5,E15.5 胚胎胰腺需在解剖顯微鏡下分離），新生鼠出生后， 立即與母體分離， 迅速取出其胰腺 .出生后21d 鼠和成年鼠在低溫條件下迅速取出胰腺6.部分孕鼠于 E15 開始給予正常卡路里的50%，直至出生，造成宮內(nèi)發(fā)育遲緩動物模型，待新生鼠出生后， 立即取出其胰腺 .所有標(biāo)本置液氮中速凍后-70凍存?zhèn)溆?分別取 E12.5 胚胎

10、胰腺 100 只、E15.5胚胎胰腺 30 只，E18.5 胚胎胰腺 10 只（來自 3 只孕鼠）,新生鼠 3 只（來自 3 只孕鼠），用 RneasyMiniKit（Qiagen公司）抽提并純化總 RNA.總 RNA分裝后 -70凍存，用于 RTPCR和 RealtimePCR.1.2 方法 RTPCR和 RealtimePCRRTPCR操作過程按試劑盒（日本 Toyoko 公司）提供常規(guī)步驟 .目的基因及內(nèi)參照引物序列如下： G3PDHforward:5ACCACAGTCCATGCCATCAC3,reverse:5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3.Insulinforward:5

11、CCGTCGTGAAGTGGAG3,reverse:5CAGTTGGTAGAGGGAGCAG3.PDX1forward:5GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAA3,reverse:5CCAGTCTCGGTTCCATTCG3 .Munc131forward:5TGTGGAACAAGGGTCTCATCTGG3 .reverse:5GGCTGCGAAGTCGTGTAGTAAGG3.Munc131RealtimePCR探針設(shè)計如下：unc13h1fam:CCAAGCCATGACCCACTTTGCCTG，unc13h1fp:CGCTATGGCGTTGAATCCA，unc13h1rp:TGCGTAGTAGGCGTTGATGTTG分別. 取E15.5 的 胰 腺100只,E18.5的胰腺 20 只,新生大鼠胰腺6 只,出生后 21d 大鼠 6 只、成年大鼠 6 只 （ 雌 雄 各 3 只 ）， 分 別 按 15 （ m/V ） 加 裂 解 液（ 50mmol/LTrisCl,150mmol/LNaCl,1g/LSDS,100mg/LPMSF,10g/LNP40,10g/LTritonX100,10g/L蛋白酶抑制劑 cocktail），冰上勻漿，然后 300W 超聲4s 14（間隔時間） 6次（保護、工作復(fù)位） ，靜置 1h 后， 21500g 離心 15min，提取上清為總蛋白，用 Br