VIG病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)

1、What are RNAi? RNAi現(xiàn)象早在1993年就有報道:將產(chǎn)生紫色素的基 因轉(zhuǎn)入開紫花的矮牽牛中,希望得到紫色更深的花, 可是事與愿違,非但沒有加深紫色,反而成了白色。 當(dāng)時認(rèn)為這是矮牽牛本來有的紫色素基因和轉(zhuǎn)入的 外來紫色素基因都失去了功能,稱這種現(xiàn)象是“共 抑制”。 直到1998年, Fire等的研究證明,在正義RNA阻斷了 基因表達(dá)的試驗中,真正起作用的是雙鏈RNA,使基 因“沉默”了。研究人員將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾 (RNA interference,RNAi)。研究者因此獲得了 2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。 What are RNAi? RNA干擾廣泛存在于生物界，在

2、不同物種中RNA干擾被 賦予不同的名稱: 在植物體中被稱為基因共抑制（co-suppression） 在真菌中被稱為基因阻抑（qulling） 在動物體內(nèi)被稱為RNA干擾（RNAi） 現(xiàn)今用于植物RNAi技術(shù)按導(dǎo)入方式的不同有粒子轟擊、 病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等方式。 Virus Induced Gene Silencing(VIGS) 病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS) 是指通過對已知植物病毒的改造，將目標(biāo)基因片 段整合入病毒載體中，然后侵染植物,誘發(fā)RNAi途 徑,隨著病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而特異性地誘導(dǎo)序列同 源基因mRN

3、A降解或被甲基化等修飾，從而引起植 物表型或生理指標(biāo)變化，實現(xiàn)對該功能基因的鑒 定。 VIGS原理原理 dsRNA:雙鏈RNA; Dicer酶:核糖核酸酶 (Ribonuclease, RNase ) 家族的成員; siRNA:小干擾RNA ; RISC:RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體 VIGS應(yīng)用的載體應(yīng)用的載體 利用植物病毒作為載體的優(yōu)點: 病毒能吸附到完整的植物細(xì)胞并將它們的核酸導(dǎo) 入到細(xì)胞中 感染的植物細(xì)胞產(chǎn)生大量的病毒，因此重組病毒 載體可以高效表達(dá)轉(zhuǎn)入的外源基因。 病毒感染可以蔓延整個植株 病毒感染快 VIGS應(yīng)用的載體應(yīng)用的載體 RNA病毒(最早最多) 1995,首次基于煙草花葉病毒TMV

4、載體構(gòu)建(攜帶八 氫番茄紅素脫氫酶PDS侵染煙草，上位葉片褪綠白化) 1998,馬鈴薯X病毒PVX(沉默PDS誘發(fā)白化效應(yīng)) 2001,煙草脆裂病毒TRV(因其具有病毒癥狀較輕、 沉默效率高、持續(xù)時間長、能夠侵染分生組織應(yīng)用， 目前應(yīng)用最廣泛VIGS載體) lPDS即八氫番茄紅素脫氫酶，是類胡卜素合成所必需的酶，具保護(hù)葉綠 素免受光漂白的作用，而PDS基因發(fā)生沉默后被侵染植物就會表現(xiàn)出光 漂白癥狀。 lPDS表型變異易于辨別，因此PDS基因成為VIGS體系評價的參照基因。 VIGS應(yīng)用的載體應(yīng)用的載體 DNA病毒(載體構(gòu)建簡便、無需體外轉(zhuǎn)錄、操作難度 低) 1998,基于雙生病毒番茄金色花葉病

5、毒TGMV的VIGS 體系成功建立(第一例DNA病毒載體) 2004,非洲木薯花葉病毒ACMV 2008,棉花皺葉病毒CLCrV 2010,水稻東格魯桿狀病毒RTBV(實現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo) 接種高效沉默水稻內(nèi)源基因PDS，第1例能夠通過農(nóng) 桿菌介導(dǎo)接種水稻的VIGS載體) VIGS應(yīng)用寄主應(yīng)用寄主 寄主范圍有限，針對不同的寄主植物往往需要開發(fā) 不同的病毒載體。 2002，大麥抑制PDS（大麥條紋花葉病毒BSMV，進(jìn) 一步在小麥上應(yīng)用） 2006，水稻、大麥和玉米（雀麥花葉病毒BMV 2006，大豆（多組分病毒菜豆莢斑駁病毒BPMV） 2010，大豆（改造后無需體外轉(zhuǎn)錄，增加沉默效 率） VIGS的應(yīng)

6、用的應(yīng)用 抗旱研究中相關(guān)基因的功能分析 2011，沉默小麥上S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 (SAMS)、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(SAMDC)、- 谷氨酰半胱氨酸合成更美基因(-ECS)三個基因。 沉默植株經(jīng)干旱脅迫后較正常植株在形態(tài)上有明顯 的變化，其葉片的卷曲萎蔫程度較為突出，說明這 三個基因在小麥抗干旱脅迫中具有重要功能。 VIGS的應(yīng)用的應(yīng)用 品質(zhì)改良相關(guān)基因的功能分析 2012，利用VIGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)高分子量谷蛋白亞基HMV- GS 1Bx14和小麥籽粒中麥谷蛋白聚合體合成有關(guān)。 這也是首次報道VIGS技術(shù)應(yīng)用于小麥穗子和籽粒相 關(guān)的基因功能，同時這個體系的建立將會對研究與 籽粒品質(zhì)和

7、在小麥漸成的籽粒中有關(guān)基因的功能起 到很大幫助作用。 VIGS優(yōu)點優(yōu)點 在未獲取全長序列甚至事先不知道序列的情況下 即可進(jìn)行VIGS分析。 操作簡便，能快速獲取表型。 無需構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株。這對于那些轉(zhuǎn)基因植株獲 取非常困難的植物種類來說至關(guān)重要 可用于突變致死的基因功能研究。 可用于功能冗余基因的功能研究。 可用于快速的不同植物種類間比較基因組學(xué)的研 究。 VIGS缺陷缺陷 VIGS引起目標(biāo)基因的沉默特征不具有遺傳性，以 致VIGS技術(shù)并不能徹底揭示基因的功能，這是此 種技術(shù)自身最大的局限性。 如何獲得目標(biāo)基因的系統(tǒng)性沉默仍然是VIGS技術(shù) 目前需要解決的問題。 沉默持續(xù)的時間問題。 病毒載體如何有效地接種入植物體內(nèi)，并產(chǎn)生較 強的沉默效果，是VIGS技術(shù)實驗操作中的關(guān)鍵性 步驟。 病毒誘導(dǎo)的基因沉默病毒誘導(dǎo)的基因沉默(V