細胞融合的方法、過程和影響因素

1、 細胞融合概念 融合方法 融合過程 融合的影響因素 細胞融合 n細胞融合（細胞融合（cell fusioncell fusion）：又稱somatic hybridization or cell hybridization ，指在自然 條件下或人工方法使兩個或兩個以上的細胞通過無性 方式融合形成一個雜合細胞的過程。 它能重新組合兩個親本細胞的優(yōu)良遺傳信息，是研究 細胞間遺傳信息傳遞、基因在染色體定位、改良動物 遺傳特性及創(chuàng)造新的符合人類需要的新的細胞系極為 有效的手段。 自發(fā)融合：受精過程，成肌細胞融合，巨噬細胞融合， 體外培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞融合 誘發(fā)融合 一、 細胞融合的概念 19621962

2、年年OkataOkata發(fā)現仙臺病毒可誘發(fā)艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞體，開創(chuàng)發(fā)現仙臺病毒可誘發(fā)艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞體，開創(chuàng) 動物細胞融合的暫新領域。動物細胞融合的暫新領域。 Singer and Nicolsons Model of membrane structure: The fluid-mosaic model is the “central dogma” of membrane biology. The core lipid bilayer exists in a fluid state, capable of dynamic movement. Membrane prote

3、ins form a mosaic of particles penetrating the lipid to varying degrees. The Fluid Mosaic Model, proposed in 1972 by Singer and Nicolson, had two key features, both implied in its name. The chemical composition of membranes A. Membrane Lipids: The Fluid Part of the Model Phospholipids: Phosphoglycer

4、ide磷酸甘油酯and sphingolipids Glycolipids Sterols ( is only found in animals) vMembrane lipids are amphipathic. vThere are three major classes of lipids: An Overview of membrane functions 1. Define the boundaries of the cell and its organelles. 2. Serve as loci for specific functions. 3. provide for and

5、 regulate transport processes. 4. contain the receptors needed to detect external signals. 5. provide mechanisms for cell-to-cell contact, communication and adhesion 細胞融合機理 細胞融合的關 鍵：脂雙層的 接觸靠近, 細 胞橋形成, 胞 質滲透細胞 核融合。 膽固醇 磷脂 糖脂 寡糖 疏水a螺旋 鰲合蛋白 極性孔蛋白分子 Hydrophobic 疏水的 Hydrophilic 親水的 二、誘發(fā)細胞融合的方法 病毒 化學PEG電融

6、合 1.病毒促進細胞融合 病毒類融合劑是研究的最早的促融劑，一些 致癌、致病病毒如皰疹病毒、天花病毒、副流感 型病毒、副黏液病毒等，都能誘導細胞融合，但 由于毒性大，應用上收到很大限制。 n仙臺病毒（HVJ）是一類被膜病毒，誘導細胞融合 的不是仙臺病毒內部的RNA，而是。 n這一現象對你有何啟示？ HVJ促融機制： 當病毒位于兩個 細胞間時，病毒 表面spike上神經 氨酸酶降解細胞 膜上的糖蛋白， 使細胞膜局部聚 集在病毒周圍， 在高pH和Ca2+條 件下局部細胞膜 發(fā)生融合。 2.化學融合劑促進細胞融合 1975年Kao和Chayluk報道PEG(polyethylene glycol,P

7、EG)可促進細胞融合， Pontecorvo報 道PEG促融效率高于仙臺病毒100-300倍。 PEG是一種多聚化合物，商品名卡波蠟 Carbowax,分子量20020000，靠醚鍵的聯結 使其分子末端帶弱負電荷，目前已衍生達50多 種。 原理：PEG帶有大量的負電荷,和細胞膜表面的 負電荷在Ca2的連接下，形成靜電鍵，促使異 源的細胞膜間的粘著和結合，在高pH,高Ca2 溶液的作用下，將Ca2和與質膜結合的PEG分 子洗脫，導致電荷平衡失調并重新分配，使兩 種細胞膜上的正負電荷連接起來，進而形成具 有共同質膜的融合體。 注意事項注意事項 n1 PEG融合的關鍵是作用時間 n2 PEG規(guī)格和純

8、度與融合效率有關 n3 融合與細胞密度有關 n4 融合液中加入少量CaCl2，即維持一定電導率， 對細胞也有保護作用 3.電融合技術（Electroporation） 3 n1）對介質要求高，一般用高純度的蒸餾水并選用 適當的非電介質溶液，如甘露醇等配制等滲性介 質。 n2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強度 和時間，以防止細胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。 融合參數：主要包括交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電 場的處理時間；直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數等。 n融合率高，達7080，甚至100 融合率（融合組多核細胞的核數對 照組多核細胞的核數/對照組的全部細 胞數）100 n可在顯微

9、鏡下定向誘導細胞融合 n可直接挑選雜種細胞 n 原理：原理：兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細 胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細胞胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細胞。 n 1 1）親本）親本 n 2 2）同核體）同核體homokaryon homokaryon ：同源細胞融合體，它們的基因型和表現：同源細胞融合體，它們的基因型和表現 型完全一樣。型完全一樣。 n 3 3）異核體）異核體heterokaryon heterokaryon ：異源細胞的融合體，它們含有雙親細：異源細胞的融合體，它們含有雙親細 胞核和細胞質物質。胞核和細胞質物質。 n

10、 4 4）多核體：含有雙親不同比例核物質的融合體）多核體：含有雙親不同比例核物質的融合體 n 5 5）異胞質體：具有不同胞質來源的雜合細胞。）異胞質體：具有不同胞質來源的雜合細胞。 n 6 6）核質體：有細胞核而帶有少量細胞質的亞原生質體）核質體：有細胞核而帶有少量細胞質的亞原生質體 第二節(jié) 融合細胞的篩選 n1 1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細胞對：利用生物細胞對 藥物敏感性差異篩選雜種細胞。藥物敏感性差異篩選雜種細胞。 n親本親本A A：對氨芐青霉素敏感，對卡那霉素不：對氨芐青霉素敏感，對卡那霉素不 敏感敏感 n親本親本B B：對卡那霉素敏感，對氨芐青霉素不：對卡那霉素

11、敏感，對氨芐青霉素不 敏感敏感 n雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基 上生長上生長 n2 2）營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)：營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)：細胞在缺乏一種或幾細胞在缺乏一種或幾 種營養(yǎng)成分時，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷種營養(yǎng)成分時，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷 型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原 理可以篩選雜種細胞。理可以篩選雜種細胞。 n親本親本A A：色氨酸缺陷型：色氨酸缺陷型 n親本親本B B：蘇氨酸缺陷型：蘇氨酸缺陷型 n雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng) 基上培養(yǎng)，而親本細胞均會

12、死亡。基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。 n3 3）溫度敏感突變型溫度敏感突變型雜種細胞的篩選：一般的雜種細胞的篩選：一般的 培養(yǎng)細胞能在培養(yǎng)細胞能在3737度范圍內生長，但溫度敏感度范圍內生長，但溫度敏感 突變型的細胞能在高溫或低溫下生長。由此突變型的細胞能在高溫或低溫下生長。由此 篩選雜種細胞。篩選雜種細胞。 n親本一：具有卡那霉素抗性但只能在親本一：具有卡那霉素抗性但只能在3737度左度左 右生長。右生長。 n親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡那霉親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡那霉 素。素。 n雜種細胞能在高溫和含卡那霉素的培養(yǎng)基上雜種細胞能在高溫和含卡那霉素的培養(yǎng)基上 生長。生長。 4

13、 具有所需性狀具有所需性狀雜種細胞的篩選雜種細胞的篩選 HAT選擇系統(tǒng)基于酶缺陷型細胞和藥物抗 性所建立的雜種篩選 nHATHAT是含一定濃度是含一定濃度次黃嘌呤（次黃嘌呤（Hypoxanthine,HHypoxanthine,H）、氨基喋呤氨基喋呤 （ AminopterinAminopterin，A A ）及及胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（ThymidineThymidine，T T）的一種的一種選擇選擇 性培養(yǎng)基性培養(yǎng)基，其中三種成分與細胞，其中三種成分與細胞DNADNA合成有關。合成有關。 nDNADNA合成途徑有兩種合成途徑有兩種: : 需兩種酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶: （催化胸腺嘧

14、啶核苷產生脫氧胸苷酸） 次黃嘌呤磷酸核苷轉移酶HGPRT酶: （催化次黃嘌呤產生肌苷） 主要途徑由氨基酸和其他小分子化 合物合成核苷酸，進而合成DNA， 葉酸是必不可少的媒介，參與嘌呤 和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制 FH2活性，阻斷FH2到FH4合成。 n雜交瘤技術中，常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸 核糖轉移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細胞或胸 腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞 為親本之一。 nHPRT-細胞的嘌呤只能由全合成途徑產生； nTK- 細胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。 n含氨基喋呤A培養(yǎng)基抑制了細胞內嘌呤和嘧 啶的全合成途徑。 基于基于HAT培養(yǎng)基的篩選系統(tǒng)培養(yǎng)基的篩選系統(tǒng) H（H

15、ypoxanthine次黃嘌呤）應急途徑中所提供之外源核苷酸前體 A（Aminopterin，氨基喋呤）阻斷核苷酸的從頭合成 T（Thymidine，胸腺嘧啶）應急途徑中所提供之外源核苷酸前體 HGPRT酶缺陷型細胞株 （長期培養(yǎng)系） 不能在HAT培養(yǎng)液中生長 正常細胞 體外生存能力有限，最終也將死亡 融合細胞 最后，只有融合細胞在HAT 培養(yǎng)液中存活 第三節(jié) 融合細胞克隆化 n利用單個細胞培養(yǎng)技術選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的利用單個細胞培養(yǎng)技術選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的 細胞系。細胞系。 n在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜

16、交瘤 生長的飼養(yǎng)細胞，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺生長的飼養(yǎng)細胞，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺 細胞等。細胞等。 n方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、 應用熒光激活分選儀等。應用熒光激活分選儀等。 通過適當的稀釋達到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的 1）取出陽性孔內的細胞進行計數 2）用培液將其稀釋到例如每毫升內10個細胞。 3）如果在96孔板內每孔加0.1ml，每孔內將為一個細胞 4）加入一定數量的飼養(yǎng)細胞，經過812天后， 可觀察到有集落生長的孔。 5）根據檢測的陽性結果再次進行克隆化。 有限稀釋法 在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內鋪上

17、一層在加入飼養(yǎng)細胞的無菌平皿內鋪上一層0.50.5的的 瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞的 0.250.25的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管的軟瓊脂。待細胞長成集落后，用毛細管 吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的吸出移種于含飼養(yǎng)細胞的9696孔板內?？装鍍取?軟瓊脂培養(yǎng)法 n1 1）基因定位基因定位 不同種屬的細胞融合時，常會出現一個親本細胞不同種屬的細胞融合時，常會出現一個親本細胞 的染色體被優(yōu)先排除，而另一個親本的染色體被的染色體被優(yōu)先排除，而另一個親本的染色體被 選擇性留下，即選擇性留下，即染色體分離染色體分離的現象。由此，可根的現象。由此，可根 據表型和與表型特征相