001-經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)方法-改良寇氏法

1、WORD格式整理急 性 毒 性 試 驗(yàn) 方 法改良寇氏法Krber法由Krber于1931提出，后經(jīng)Finney改進(jìn)，顧漢頤作過(guò)改進(jìn)，1963年孫瑞元教授對(duì)該法進(jìn)一步改進(jìn)，改進(jìn)后的計(jì)算方法稱(chēng)為點(diǎn)斜法或?qū)O氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD50及全部有關(guān)參數(shù)與正規(guī)概率單位法相近。改良寇氏法（Kber）試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原則是：各組劑量按等比級(jí)數(shù)；各組動(dòng)物數(shù)相等：大致有一半組數(shù)的動(dòng)物死亡率在10%50%之間，另一半在50%100%之間，最好出現(xiàn)0 %和100 %的劑量組。一、劑量選擇及分組1、劑量選擇 劑量設(shè)計(jì)是否合理是急性毒性試驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵。探求外源化學(xué)物的急性毒性，測(cè)定其LD50

2、或LC50時(shí)，應(yīng)首先廣泛查閱文獻(xiàn)資料，了解該化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，如結(jié)構(gòu)式、分子量、溶解度、揮發(fā)度、純度及雜質(zhì)含量等，其次確定測(cè)定LD50的計(jì)算方法，然后設(shè)計(jì)劑量。2、預(yù)試驗(yàn)：總的原則是先用少量動(dòng)物，以較大的劑量間距染毒，求出粗略的致死劑量范圍，即確定受試動(dòng)物全部致死的最小劑量（b）和全部不致死的最大劑量（a），即求出待測(cè)化學(xué)物0 %100 %的大致致死劑量范圍，然后在這個(gè)劑量范圍內(nèi)按幾何級(jí)數(shù)的間距設(shè)計(jì)57個(gè)劑量組，組間劑量呈等比級(jí)數(shù)（r），其比值為1.21.5。進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。用于急性毒性試驗(yàn)時(shí)，動(dòng)物的體重為：大鼠180200g，小鼠1822g，豚鼠200250，家兔22.5kg，犬10

3、12 kg。用于實(shí)驗(yàn)的同一批動(dòng)物體重變異范圍不得超過(guò)所用動(dòng)物平均體重的20%。仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原則。當(dāng)預(yù)試中發(fā)現(xiàn)化學(xué)物的毒性有明顯的性別差異時(shí)，則需要選用雌、雄兩種性別的動(dòng)物分別進(jìn)行試驗(yàn)，求出各自的LD50。通過(guò)預(yù)試，找出受試化學(xué)物引起動(dòng)物死亡的大致劑量范圍，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組。按下式設(shè)計(jì)劑量組： 式中：r相鄰兩組劑量的比值，一般為1.21.5，b最低全致死劑量量，a最高不致死劑量，n設(shè)計(jì)的組數(shù)。分組恰當(dāng)與否也是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的條件之一。因?yàn)榻M數(shù)過(guò)多，需要消耗較多的動(dòng)物，還可能出現(xiàn)較大劑量組動(dòng)物死亡率低于較小劑量組；組數(shù)過(guò)少，不能較精確求出LD50。3、根據(jù)公比(

4、r)計(jì)算各組劑量各組劑量分別為：第一組：a第二組：a r 第三組：a r2 第四組：a r3第五組：a r4 第六組：a r5 二、受試物溶液配制1、溶劑的選擇 毒理學(xué)試驗(yàn)中，常用的劑型有液體劑型、固體劑型。液體劑型中有溶液劑、混懸劑、乳化劑等。選擇溶劑的原則是不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不改變化學(xué)物的毒性，故應(yīng)根據(jù)受試物的理化性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般而言，水溶性化學(xué)物可選擇蒸餾水或生理鹽水，以水為溶劑，既經(jīng)濟(jì)、方便、易吸收，又無(wú)毒副作用。脂溶性化學(xué)物多選用植物油，如花生油、橄欖油。不溶于水而溶于油的化學(xué)物常用吐溫-80或吐溫-60配制成乳化劑。既不溶于水又不溶于油脂的化學(xué)物可選擇淀粉液、明膠液

5、、羧甲基纖維素鈉液（0.5-1% CMC）等助懸劑配制成混懸液。如用有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)設(shè)溶劑對(duì)照組，有機(jī)溶劑所用比例不宜超過(guò)10%，溶解后，再用水稀釋?zhuān)匾獣r(shí)可加入增溶劑，如吐溫-80、聚乙二醇等，以提高溶液劑的濃度。2、配制方法 受試化學(xué)物的配制方法有等濃度稀釋法和等容量稀釋法。等濃度稀釋法 將受試物配制成一種濃度，不同劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重所給受試物的體積不同，劑量越高，所用的體積越大；劑量越低，所用的體積越小。比如某受試物的試驗(yàn)劑量分別為100、200、400和800mg/kg，受試物配制成10 mg/ml，每組動(dòng)物每10g體重分別給與0.1、0.2、0.4和0.8 ml。等容量稀釋法

6、將受試物配制成不同濃度，不同劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重所給受試物的體積相同，劑量越大，受試化學(xué)物配制的濃度越高。上例中，若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,則應(yīng)配制成4個(gè)不同濃度,即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml。灌胃體積依所選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而定，一次灌胃的體積為：小鼠0.10.4ml/10g b.w，每只不超過(guò)1ml；大鼠0.51ml/100g，每只不超過(guò)4ml;家兔在5ml/kg之內(nèi);犬不超過(guò)50ml/kg；為避免操作誤差，等容量稀釋的傳統(tǒng)方法常采用1K系列稀釋法。該法操作簡(jiǎn)便、濃度精確、節(jié)約受試化學(xué)物。a、 確定各劑量組所需受試液濃度如已知最高劑量組劑

7、量為2000mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法給予受試藥液，即0.2ml/10g b.w.，相當(dāng)于20ml/1000g b.w.，故最高劑量組所需受試液的濃度（母液濃度）為2000 mg/20ml，即10.0%（C1）。b、 確定每組所需受試液的量（m ml）按每只鼠體重25g計(jì)算（將損耗也計(jì)算在內(nèi)），給藥量為0.2ml/10g b.w.，則每組10只動(dòng)物所需受試液的量為5ml；c、 確定母液總量配制時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求確定最高劑量組所需受試化學(xué)物的濃度和總體積，配制母液。設(shè)母液濃度為C1，各組所需要的量為m ml，母液應(yīng)配制的總量M用下述公式計(jì)算： 式中， K為各組劑量的比值，K=1/r

8、。d、 配制母液選擇適當(dāng)?shù)娜軇┡渲茲舛葹镃1的受試液，取M ml作為母液，從母液中取出m ml供最高劑量組染毒用；然后取m ml溶劑加入剩余的母液中，混勻，稀釋后的母液濃度為C2（C1 ：C2=1：k= r），即次高劑量組所要求的濃度，從中取出m ml供次高劑量組染毒用（第2組），然后再加入m ml溶劑，其稀釋后的濃度為C3（C2 ：C3=1.2），取出m ml供第3組動(dòng)物染毒用。依此類(lèi)推，可配制成按1K遞減的各劑量組不同濃度的試液。三、染毒各組小鼠分別按等容量方法給予相應(yīng)濃度的受試藥液，即0.2ml/10g b.w.。四、觀察指標(biāo)與試驗(yàn)期限急性中毒癥狀及出現(xiàn)時(shí)間，死亡數(shù)量、時(shí)間。大體剖檢變化

9、。試驗(yàn)期限為7-14天五、結(jié)果及LD50的計(jì)算采用寇氏法計(jì)算LD50及其95%可信限1、試驗(yàn)結(jié)果列表表 試驗(yàn)結(jié)果組別劑量（mg/kg）試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)死亡動(dòng)物數(shù)死亡率（p）存活率（q）1102103104105102 計(jì)算LD50當(dāng)急性毒性試驗(yàn)的最大劑量死亡率為100%，最小劑量的死亡率為0%；各組動(dòng)物數(shù)相等；各劑量組的組距等比或劑量對(duì)數(shù)等差時(shí)，用下述基本公式計(jì)算LD50：當(dāng)不含0%和100%死亡率時(shí)，用下式計(jì)算LD50：以上各式中：i組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)劑量之差Xm最大劑量對(duì)數(shù)P各劑量組死亡率(死亡率均用小數(shù)表示)Pm最高死亡率q各組劑量存活率，q=1-pPn最低死亡率p各劑量組死亡率之和n各

10、組動(dòng)物數(shù)Sx50logLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤LD50 的95 %可信限=log-1(log LD501.96Sx50) 改進(jìn)Krber法的優(yōu)點(diǎn)是計(jì)算簡(jiǎn)便、結(jié)果精確，實(shí)用性大。我國(guó)新獸藥一般毒性試驗(yàn)技術(shù)要求規(guī)定用此法計(jì)算新獸藥的LD50。舉例：給小鼠口服某藥進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，測(cè)定LD50。選擇體重1824g健康小鼠（雌雄各半），按隨機(jī)方法將動(dòng)物分為5個(gè)組，每組10只。經(jīng)預(yù)試找出死亡率在0100%的劑量范圍大約為300600mg/kg b.w. 。（1)預(yù)試（略）（2） 計(jì)算公比 r= 5-1 600/300 =4 2 =1.189 1.2 ?（3） 根據(jù)公比(r)計(jì)算各組劑量因而各組劑量分別為：第一組

11、：a=300mg/kg b.w.第二組：a r =3001.2 = 360mg/kg b.w.第三組：a r2 =3001.2 2 = 432mg/kg b.w.第四組：a r3 =3001.2 3 = 518mg/kg b.w.第五組：a r4 =3001.2 4 = 622mg/kg b.w.（4） 受試液配制采用1：K系列稀釋法配制不同濃度的受試液。（K1/r）a、 確定各劑量組所需受試液濃度：已知最高劑量組劑量為622mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法給予受試藥液，即0.2ml/10g b.w.，相當(dāng)于20ml/1000g b.w.，故最高劑量組所需受試液的濃度（母液濃度）為622

12、 mg/20ml，即3.11%（C1）；b、 確定每組所需受試液的量按每只鼠體重25g計(jì)算（將損耗也計(jì)算在內(nèi)），給藥量為0.2ml/10g b.w.，則每組10只動(dòng)物所需受試液的量為5ml；c、 確定母液總量各組動(dòng)物需用本組濃度受試液的用量為5 ml（m）；各劑量組之比為0.833（k=1/ r），則母液應(yīng)配制的總量為（ml）：=29.999930（ml）51-0.833d、 配制母液選擇適當(dāng)?shù)娜軇┡渲茲舛葹?.11%（C1）的受試液，取30 ml作為母液，從母液中取出5ml供第五組（最高劑量組）接毒用，然后取5 ml溶劑加入25ml母液中混勻，稀釋后的母液濃度為2.59%（C2）（C1 ：C

13、2=1：k=1.2），即第四組（次高劑量組）所要求的濃度，從中取出5 ml供第四組接毒用，然后再加入5 ml （n ml）溶劑，其稀釋后的濃度為2.16%（C3）（C2 ：C3=1.2），即第三組所需的濃度。依此類(lèi)推，可配制第二組、第一組所需濃度的受試液，分別為1.80%、1.50%（5） 接毒各組小鼠分別按等容量方法給予相應(yīng)濃度的受試藥液，即0.2ml/10g b.w.。（6） 觀察指標(biāo)（7） 結(jié)果及LD50的計(jì)算采用寇氏法計(jì)算LD50及其95%可信限a、將試驗(yàn)結(jié)果列入下表，按改良寇氏法進(jìn)行計(jì)算；表 試驗(yàn)結(jié)果組別劑量（mg/kg）試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)死亡動(dòng)物數(shù)死亡率（p）存活率（q）130010001.023601020.20.834321050.50.545181070.70.3562210101.00b、按下列公式計(jì)算：即：logLD50=Xm-d（p-0.5）Xm=log622=2.7938i=log 1.2=0.0792p=0+0.2+0.5+0.7+1.0=2.4代入公式：logLD50= 2.7938-0.0792（2.4-0.5）=2.6433c 查反對(duì)數(shù)求出