利用SSR標記鑒定香菇單核體及雜交后代匯總

1、微生物學(xué)通報microbiology chinatongbaofeb. 20, 2016, 43(2): 444- 455doi: 10.13344/j.microbiol.china.150335生物實驗室利用ssr標記鑒定香菇單核體及雜交后代巫萍1,2章爐隼張丹2尚曉冬2譚琦2宋春艷2foundation item: modern agriculture industry technical system, ministry of agriculture of china (no. cars-24);the seed special program, shanghai municipal

2、agriculture commission (no. 6-2012); shanghai scientific and technological talents program (no. 13xd1424700) corresponding author: tel: 86-21-62209760; e-mail: s62209760april 20, 2015; accepted: july 17, 2015; published online ( ): september 14, 2015現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金項目(no. cars-24);上海市農(nóng)委種業(yè)專項項目(no.滬農(nóng)科

3、種字(2012)第6號)；上海市科技人才計劃項目(no. 13xd1424700)tel: 86-21-62209760; e-mail : s622097602015-04-20;接受日期：2015-07-17;優(yōu)先數(shù)字出版日期() : 2015-09-14(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院江蘇南京210095)(2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室國家食用菌工程技術(shù)研究中心國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室上海201403)摘 要：【目的】研究簡單重復(fù)序列 (simple sequence repeat, ssr)分子標記方法用于香菇原生

4、質(zhì)體單核體、抱子單核體及其雜交后代的分離和鑒定?！痉椒ā坷没谙愎饺蚪M序列信息開發(fā)的ssr標記，分析由香菇品種“l(fā)808雙核菌絲制備的原生質(zhì)體單核體、抱子單核體及其雜交后代的ssr指紋?！窘Y(jié)果】對制備的原生質(zhì)體單核體的鑒定中，在不經(jīng)過雜交配對的情況下，鑒 定出“l(fā)808的兩種不同極性的原生質(zhì)體單核體，其分離比例為191:1,該鑒定結(jié)果得到 ssr標記、隨機擴增多態(tài)性 dna (random amplified polymorphismic dna , rapd)標記及傳統(tǒng)方法的驗證。另外，開發(fā)的香菇ssr標記還能以多位點組合的方式，用于對抱子單核體及其雜交后代的鑒定。【結(jié)論】應(yīng)用ssr標

5、記可加快香菇單核體的制備進程，并提高鑒定單核體及相關(guān)雜交菌株的準 確性，促進香菇遺傳育種研究。dna ,抱子單核體，雜交子關(guān)鍵詞：簡單重復(fù)序列，香菇，原生質(zhì)體單核體，隨機擴增多態(tài)性 鑒定identification of xianggu (lentinula edodes) monokaryons and hybrid progenies using ssr markerswu ping1,2 zhang lu-jun2 zhang dan2 shang xiao-dong2 tan qi2_ _ _9*song chun-yari(1. college of life sciences, n

6、anjing agriculture university, nanjing, jiangsu 210095, china)received:基金項目：*通訊作者:收稿日期:(2. key laboratory of edible fungi resources and utilization (south), ministry of agriculture, p . r. china; national engineering research center of edible fungi, national r&d center for edible fungi processing, k

7、ey laboratory of agriculture genetics and breeding of shanghai, institute of edible fungi, shanghai academy of agricultural sciences, shanghai 201403, china)巫萍等：利用ssr標記鑒定香菇單核體及雜交后代 457abstract: objective simple sequence repeat (ssr) molecule markers were used to separate and identify protoplast mono

8、karyons, sporulated monokaryons and their hybrid progenies of two xianggu (lentinula edodes) strains. methods ssr primers developed from the whole genome sequence of xianggu were used to identify the genotypes of different monokaryons and hybrids, and then to separate them according different genoty

9、pe information. results employing lefp-55 ssr markers, we obtained both protoplast monokaryons of strain l808 without matching crossing of monokaryons,and we found the segregation ratio of both protoplast monokaryons was high to 191:1. this result was confirmed by other ssr markers, random amplified

10、 polymorphismic dna (rapd) markers and tranditional method. in the identification of sporulated monokaryons and their hybrid progenies, cooperation of several ssr markers was able to identify numerous hybrids, and it was useful in genetic and breeding research. conclusion protoplast monokaryons sepa

11、ration would be fast and accurate by using ssr markers, which also can be used in identification of sporulated monokaryons and their hybrid progenies of xianggu in relevant genetic and breeding research.keywords: simple sequence repeat, lentinula edodes, protoplast monokaryons, random amplified poly

12、morphismic dna, spore monokaryons, identification of hybridstel: e-mail: tongbao; 在食用菌的遺傳和育種研究中，單核體的獲取 是一項重要的基礎(chǔ)工作，通常用分離單核擔(dān)抱子和 原生質(zhì)體單核化的方法分別獲得抱子單核體和原 生質(zhì)體單核體。原生質(zhì)體單核體不經(jīng)過有性生殖過 程，直接將雙核體親本的兩個核通過物理手段和酶 處理的方式進行分離，更好地保持了親本的性狀， 其作為重要的遺傳和育種材料，在食用菌研究中運 用廣泛1-3。目前食用菌原生質(zhì)體單核體制備中的篩 選環(huán)節(jié)，通常都是通過光學(xué)顯微鏡觀察鎖狀聯(lián)合

13、來 排除雙核體菌絲，再通過單核體菌絲間配對雜交， 觀察出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合來確定獲得了雙核體中的兩個 不同極性的原生質(zhì)體單核體4。在整個制備過程中， 配對雜交和顯微觀察環(huán)節(jié)耗時最長、投入工作量最 多，并且容易出現(xiàn)誤檢，且該方法僅對香菇、平菇 等雙核體菌絲具有鎖狀聯(lián)合的食用菌有效，應(yīng)用范 圍受到限制。用一種快速、準確的方法取代原來的 顯微觀察方法將大大縮短原生質(zhì)體單核體制備的 時間并提高其準確性。抱子單核體由于經(jīng)過染色 體的交換和重組，親本的性狀在后代中分離變異， 形成帶有親本基因型各種組合的眾多后代，對其逐 一鑒定的難度相對較大 冏，可采用共顯性分子標記 對某些位點進行標記的方法研究其在后代中的分 布

14、規(guī)律及對雜交后代的影響。許占伍等證實特異 ssr標記h35在真姬菇 sief3133及其原生質(zhì)體單核體(交配型a2b2)、部分抱子單核體中有分布，并 能追蹤具有該標記單核體的雜交子7。ssr標記可根據(jù)不同單核體相同位點擴增片段 的大小差異或有無，準確地將單核體及其雙核體親 本分開。本文的ssr標記開發(fā)自香菇 (lentinulaedodes)全基因組序列，均勻分布于整個基因組中， 對香菇的基因組具有廣泛的代表性，并且具有共顯 性、穩(wěn)定性、易操作性、多態(tài)性高的特點，用于菌 種鑒定具有較大的優(yōu)勢8-9。本文利用ssr分子標 記方法鑒定不同核型的香菇原生質(zhì)體單核體；此 外，還研究了 ssr標記對抱子

15、單核體及其雜交后代 的鑒定，監(jiān)測多個位點在雜交后代中的傳遞等方面 的內(nèi)容，并對ssr標記在香菇遺傳和育種工作中的 作用和前景進行了探討。1材料與方法1.1 菌株香菇(l. edodes)栽培菌株“ l808和“ 18/保藏于 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心，菌 種保藏編號分別為 4627和4659?！?l808 的7 個抱子單核體 l808sm-9、 l808sm-34、l808sm-46、l808sm-52、l808sm-58、 l808sm-91和l808sm-120以及“1/勺7個抱子單 核體 18sm-9、18sm-34、18sm-46、18sm-52、 18sm-58、18

16、sm-91和18sm-120來自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所育種室。1.2 引物ssr引物開發(fā)自香菇全基因組序列，經(jīng)過多個 香菇栽培及野生菌株的多態(tài)性檢驗后選取具有多 態(tài)性且多拷貝的15對引物9, rapd引物來自上海 生工生物股份有限公司合成的隨機引物s1系列，本文所用引物序列見表 1。1.3 “ l808原生質(zhì)體單核體的制備原生質(zhì)體的制備參考文獻10的方法，并做以下修改：將制備好的原生質(zhì)體懸液涂布在pdms培養(yǎng)基（g/l , 土豆200,葡萄糖20,瓊脂20,蔗糖200, 定容至1 l）上,25 遮光培養(yǎng) 5 do待pdms培養(yǎng) 基上長出微小的（直徑1-2 mm）星芒狀菌落，則將整 個菌落

17、挑至pda培養(yǎng)基（g/l , 土豆200,葡萄糖20, 瓊脂20,定容至1 l）上培養(yǎng)。菌落擴大到直徑 為2-3 cm時進行單核體顯微鑒定，將沒有觀察到 鎖狀聯(lián)合的菌株當(dāng)作待鑒定的原生質(zhì)體單核菌株， 以l808pm-x的形式編號備用。1.4 ssr引物篩選選取兩株制備好的待鑒定原生質(zhì)體單核體l808pm-1、l808pm-203 及其親本 “l(fā)808菌株，采 用dna快速制備法獲得用于 pcr反應(yīng)的dna樣表1引物信息table 1 primers used in this studyprimer typenamerepeat motifprimer sequence (5 -3)ssrlef

18、p-41-1aggattccttgaagttccgggtcg tgccaggttgtggtctagclefp-56-1aggatcaiiigaggicigcgccigggtgtgaagacccagtgatglefp-95-1aaatagcaccggtccgcaaacattccggaaacaccctcgaaagglefp-7aactcattacaagcccccgatagtcattacaagcccccgataglefp-8catcgaaaatttgcccaaacgaga aggacaiiicggatgactcglefp-43atggtgciciiigcacccicaacciccagcagtctcc

19、tcttggctclefp-55tccaaacacaaggacaagggcagaacgccaaaacgtacattcclefp-56tgttcgaacgaccaaactctcctgcctcgcattcgtagacttclefp-76gaaagcaggtcagagcaggttcaccgagagcagagtcgagaglefp-83gaggtacggaggtccaagacaaagciiigatcatcgcattcalefp-95gaacaatcatctgtcgtgaaccgcgaactcgacgtaccctctclefp-116tgaacccgggggaatctatagtg gcgctgagaii

20、ictgaatcclefp-126atgagcgctagcttcgacattctcgccttctctctciiiigglefp-157tctgcggagcgatcttcagttaccaggaaaagtaccttgcggalefp-167attatgtgctgacagcctccagtgtacattcgggtcctcctcrapds1456s1480aacgggcgtcttgaccccag品11。采用14對具多態(tài)性的ssr引物進行引物篩 選，以選擇在“l(fā)808兩個核中具有多態(tài)性的引物用 于單核體的鑒定，供篩選引物包括lefp-41-1、lefp-56-1、lefp-95-1、lefp-8、lefp

21、-43、lefp-55、 lefp-56、lefp-76、lefp-83、lefp-95、lefp-116、 lefp-126、lefp-157 和 lefp-167。pcr 擴增體系： ddh2o 3.7 慰 10xpc骸沖液 1 八 25 mmol/l mgcl 2 1 l 2.5 mmol/l dntps 0.2, taq dna酶(promega) 0.1, 10mol/l ssre向和反向弓i物各為1 0dna模板2 plpcr反應(yīng)條件：94 c 5 min ; 94 c 1 min 55 c 1 min 72 c 1 min 35個循環(huán)；72 c 7 min將10 l pcr產(chǎn)物與

22、 6 l1加樣緩沖液混勻，置于95 沐浴中變性5 min ,變性結(jié)束后迅速置于冰水混合物中冷卻 5 min,隨后取3科度性產(chǎn)物于6%變性聚丙烯酰胺 凝膠上電泳。電泳緩沖液為 1 x tbe電壓1 000 v , 電流120 ma ,電泳時間45 min。電泳結(jié)束后將膠 板置于0.1% agno3溶液中染色8 min,隨后于4% naoh和甲醛溶液中顯色至條帶清晰可見，清水沖 洗晾干后用于帶型統(tǒng)計。原生質(zhì)體單核體與親本“ l80解型可區(qū)分的引物對即可用于單核體的鑒定。1.5 “ l808原生質(zhì)體單核體的鑒定將1.4中篩選獲得的多態(tài)性ssr引物中的lefp-55作為原生質(zhì)體單核體鑒定用引物，對所有

23、 待鑒定原生質(zhì)體單核體菌株進行快速dna制備后進彳t pcr擴增，pcr擴增體系和反應(yīng)程序同1.4中描述。對擴增結(jié)果進行條帶統(tǒng)計，計算經(jīng)顯微鑒定 后的原生質(zhì)體單核體菌株中誤檢的雙核體菌株所 占的比例以及兩種單核體菌株之間的比例。1.6 “ l808原生質(zhì)體單核體的驗證為了驗證ssr分子標記方法鑒定結(jié)果的準確 性，以及能否采用其他分子標記進行單核體鑒定工 作，從經(jīng)鑒定的原生質(zhì)單核體菌株中選取鑒定結(jié)果 為雙核體以及兩個不同核的單核體菌株，以親本“l(fā)808為對照進彳t多個 ssr標記、rapd標記以及 傳統(tǒng)方法的驗證。ssr標記選用9對經(jīng)過多態(tài)性驗 證的引物對，pcr擴增及電泳方法同1.4; rap

24、d 標記選取兩個引物(s1456和s1480)進彳t pcr擴增， 反應(yīng)體系包括ddh2。4.7內(nèi)110 x pc骸沖液1科125 mmol/l mgcl 2 1 &l 2.5 mmol/l dntps 0.2 ，科 l taq dna 酶(promega) 0.1,10 科 mol/l rapdi物1 門 dna模板2 9pcr反應(yīng)程序：94 c 3 min； 92 c 1 min 37 c 1 min 72 c 2 min 35個循環(huán)；72 c 5 min電泳方法同1.4中描述。通過傳統(tǒng)鏡檢、對峙培養(yǎng)方法對ssr標記鑒定的原 生質(zhì)體單核體進行驗證。1.7 “ l808和 18子單核體雜交后

25、代鑒定分別將“180濟口 “1唬一個抱子單核體菌塊相距1 cm接種到同一 pda平皿中央，待兩者菌落長 到一起，并顯微觀察到鎖狀聯(lián)合后，分別在 “l(fā)808 ” 與“18包子單核體菌落的兩個外側(cè)各挑出一個菌塊 轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)皿上，分別將兩個雜交后代命名為 l18-x 和18l-x ,部分平皿因只在 “l(fā)808或“1/勺 一側(cè)觀察到鎖狀聯(lián)合，因此只挑取了一個雜交后代，命名方式同上。如“l(fā)808包子單核體l808sm-9與“18包子單核體18sm-9進行配對雜交，在平皿的l808sm-9側(cè)挑取到具鎖狀聯(lián)合的雜交子編為l18-9,在18sm-9側(cè)挑取的雜交子則編為 18l-9。對挑取的雜交子與其兩個抱

26、子單核體親本，以及抱子單核體獲得的親本“l(fā)808和“1噴株用隨機挑選的3個ssr標記進行1.4所述方法的pcr擴增及擴 增產(chǎn)物的凝膠電泳，對電泳結(jié)果進行統(tǒng)計分析。鑒 定雜交后代是否完成對應(yīng)抱子單核體的雜交過程， 觀察ssr標記在親本到抱子再到雜交子中的傳遞， 并用ssr標記的帶型組合來區(qū)分不同的雜交子。2結(jié)果與分析2.1 “ l808原生質(zhì)體單核體的制備“ l808原生質(zhì)再生菌株經(jīng)純化培養(yǎng)與顯微 觀察，將無鎖狀聯(lián)合的菌株編號備用，共得到了 203株待鑒定的原生質(zhì)體單核體候選菌株，命名為 l808pm-1 - l808pm-203。2.2 ssr引物篩選所用的14對ssr引物對“ l8081f其

27、原生質(zhì)體單核體 l808pm-1、l808pm-203 擴增結(jié)果顯示 （圖1）,除引物lefp-167以外，其余13對引物在單核體上只擴增出“l(fā)808的部分條帶，可以推測“ l808的另一個細胞核攜帶了剩余部分的ssr譜帶，這種存在差異的引物代表著“l(fā)808的兩個核上在t% ssr位點存在多態(tài)性，可用于原生質(zhì)體單核體的鑒定，如兩個原生質(zhì)體單核體l808pm-1和l808pm-203均擴增出其雙核體親本一條相同的譜帶，可以判斷這兩個單核體來源于“l(fā)808甲的同一個細胞核。因此，供篩選的 14對引物中，有13對在“ l808的兩個核上均存在多態(tài)性，多態(tài)性比例達到92.9%。另外，不能排除引物 le

28、fp-167在另一核 上沒有條帶而形成的多態(tài)性，但為了確保單核體鑒 定的成功，不選用此引物。2.3 “ l808原生質(zhì)體單核體的 ssr鑒定在篩選的ssr引物中，所有引物的擴增條帶都很清晰、單一，選取其中的引物對lefp-55對獲得的203株待鑒定單核體菌株及對照“ l808進行基因型鑒定，圖2為一部分菌株的擴增圖譜，該引物在 對照“l(fā)808上能擴增出兩個條帶 55-1和55-2。其中 l808pm-2 只擴增出 55-1 條帶；l808pm-22、 l808pm-45、l808pm-47、l808pm-48、l808pm-49 和l808pm-57能擴增出與對照“l(fā)808相同的兩條條帶；其他

29、多數(shù)菌株則只能擴增出55-2條帶；極少數(shù)菌株未擴增出條帶（快速制備的dna含量低），重 新檢測擴增出55-2條帶。因此可以初步確定，l808pm-22、l808pm-45、l808pm-47、l808pm-48、 l808pm-49和l808pm-57為顯微誤檢的雙核體菌 株，再次鏡檢確定這些菌株為雙核體菌株；只有擴 增出條帶55-1的l808pm-2菌株為含有 “ l808m中 一個核的原生質(zhì)體單核體；大部分菌株具有條帶55-2的則為含有“l(fā)808另一個核的原生質(zhì)體單核體。利用引物lefp-55對“l(fā)808的203株候選原生a bode fg h ijk i m nbp m 1 2 3 2

30、3 i 2 3 i 2 3 i 2 3 1 2 3 1 2 3 j 2 3 12 3 1 2 3 2 3 l 2 3 1 2 3 l 2 3700600 fnn juu450400350圖1 ssr引物在“l(fā)808原生質(zhì)體單核體上的篩選figure 1 screening of ssr primers on l808 and its protoplast monokaryonsnote: m: 50 bp ladder dna marker. a - n: ssr primer pairs lefp-41-1, lefp-56-1, lefp-95-1, lefp-8, lefp-43, le

31、fp-55, lefp-56, lefp-76, lefp-83, lefp-95, lefp-116, lefp-126, lefp-157 and lefp-167. 1: strain l808 ” ; 2: l808pm-1; 3: l808pm-203.450圖2 ssr引物lefp-55對部分菌株的鑒定圖譜figure 2 ssr profile of partial monokaryons using primer pair lefp-55note: 1 - 65: l808pm-1 - l808pm-65; 66: strain l808 ” ; m: 50 bp ladder

32、 dna marker.質(zhì)體單核體的鑒定中，191株為含有“l(fā)808的一個 相同核（命名為a核）的單核體菌株，有11株為顯微 誤檢的雙核體菌株，僅l808pm-2為“l(fā)80附一核（命名為b核）的單核體菌株。ssr鑒定結(jié)果表明， 在本試驗中將雙核體顯微觀察誤檢為單核體的比率為5.42 %，而“ l808兩個不同核的原生質(zhì)體單核 體偏分離比率高達191:1。在如此高的偏分離比率下，用傳統(tǒng)的配對雜交方法從眾多a核的單核體中鑒定出b核比采用分子標記的方法困難很多，并且還存在誤檢的雙核體干擾。2.4 原生質(zhì)體單核體鑒定的ssr標記驗證為了進一步用更多ssr引物驗證單核體的鑒定結(jié)果，選取 l808pm-6

33、、l808pm-35、l808pm-53 （3個a核）、l808pm-2 （1個b核）以及誤檢的雙核 體菌株 l808pm-22 和 l808pm-45 ,以 “ l808為對 照，用另外 9 對 ssr 弓i物 lefp-8、lefp-43、lefp-56、 lefp-76、lefp-83、lefp-95、lefp-116、lefp-126 和lefp-157進行驗證。結(jié)果如圖3所示，誤檢的雙 核菌株l808pm-22和l808pm-45擴增出的帶型均 與 “l(fā)808完全相同；a 核的 l808pm-6、l808pm-35 和l808pm-53菌株均擴增出 “ l808的一部分條帶， b核的

34、l808-pm2菌株則擴增出“ l808的另一部分 條帶，這兩部分條帶重疊在一起即為完整的“l(fā)808擴增帶型。因此，通過9個ssr標記的驗證可以確 定菌株l808pm-22和l808pm-45為雙核體；菌株 l808pm-6、l808pm-35 和 l808pm-53 含有 “ l808 的a核；菌株 l808-pm2則含有 “l(fā)808的b核。2.5 原生質(zhì)體單核體鑒定的 rapd標記驗證為了排除同一分子標記方法對原生質(zhì)體單核體鑒定的局限性及增加鑒定的準確性， 取a核的菌 株l808pm-6 和b 核的菌株 l808pm-2 及對照“l(fā)808,”采用rapd分子標記的方法進行驗證，選 用的引物

35、為s1456和s1480,是從上海生工生物股 份有限公司隨機引物 s1系列中篩選出的對“l(fā)808擴增效果較穩(wěn)定的 rapd引物。鑒定結(jié)果如圖4所 示，菌株 l808pm-2和l808pm-6各自具有 “ l808 的一部分擴增條帶，兩者疊加可組成“l(fā)808的帶型，從基因型上可將 l808pm-2和l808pm-6確定 為“ l808的兩個不同核的原生質(zhì)體單核體。2.6 原生質(zhì)體單核體鑒定的傳統(tǒng)方法驗證為進一步確定 ssr標記鑒定不同核型原生質(zhì) 體的可靠性，選 l808pm-2、14株含a核的原生質(zhì) 體單核體（以下統(tǒng)稱l808pm-a）、l808進行傳統(tǒng)方 法驗證。將16株菌株轉(zhuǎn)接到瓊脂糖培養(yǎng)皿

36、上（l808pm-2、l808 各接 3 個培養(yǎng)皿，l808pm-a 各 接一個培養(yǎng)皿），待菌落生長14 d時進行鏡檢觀察 是否存在鎖狀聯(lián)合，并記錄菌落大小、菌落特征。將 l808pm-1、l808pm-2 分別與 l808pm-a 對峙培 養(yǎng)，鏡檢檢驗 l808pm-2與l808pm-a 的核型。圖5為部分菌株在培養(yǎng)皿上的形態(tài)，表 2為菌 落長14 d的半徑記錄。由圖5和表2可知， l808pm-a 平均生長速度明顯快于 l808pm-2 ,而圖3 鑒定結(jié)果的ssr標記驗證圖譜figure 3 ssr profile of partial tested strains using 9 pri

37、mer pairsnote: m: 50 bp ladder dna marker. a - i: ssr primer pairs lefp-8, lefp-43, lefp-56, lefp-76, lefp-83, lefp-95, lefp-116, lefp-12 and lefp-157. 1 - 7: l808pm-6, l808pm-35, l808pm-53,“ l808 ” , l808pm-2, l808pm-22, l808pm-45.圖4 鑒定結(jié)果的rapd標記驗證圖譜figure 4 rapd profile of partial tested strains us

38、ing 2 random primersnote: a: s1456; b: s1480. 1: m: 50 bp ladder dna marker.l808 ” ; 2: l808pm-6; 3: l808p圖5 l808pm-a、l808pm-2、l808在瓊脂糖培養(yǎng)基上 菌落形態(tài)figure 5 colony morphologies of l808pm-a, l808pm-2 and l808 on the agarose mediumnote: a: l808pm-a; b: l808pm-2; c: l808.l808比兩者更快，14 d已經(jīng)長滿整個平板，差異顯著（p0.01）。

39、在瓊脂糖培養(yǎng)皿上，l808pm-2菌落稀 薄，顏色淺；l808pm-a氣生菌絲旺盛，菌落濃密、 較白；l808菌落不及l(fā)808pm-a濃密，菌落有明 顯的紋理。圖6為部分菌株電鏡顯微圖片， l808pm-2和 l808pm-a 均未觀察到鎖狀聯(lián)合，而 l808在顯微 視野中觀察到較多的鎖狀聯(lián)合（箭頭所指），說明l808pm-2和l808pm-a 確為單核體（圖6a）。l808pm-2和l808pm-a對峙培養(yǎng)均出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合,l18-91、18l-120與l18-120為5對選自配對單核可知l808pm-2與l808pm-a是不同核型的單核體 （圖6b）。l808pm-1與其余l(xiāng)808pm-a對

40、峙培養(yǎng)不 能產(chǎn)生鎖狀聯(lián)合，為同一核型單核體（圖6c）。經(jīng)過傳統(tǒng)方法驗證，可確定 l808pm-2是含有b核的 l808單核體，其余大部分為含a核的原生質(zhì)體單核體，進一步3證了 ssr標記鑒定原生質(zhì)體單核體 的準確性。2.7 ssr標記對抱子單核體及雜交后代的鑒定 分別用7個“180濟口 “18勺抱子單核體進行雜 體兩側(cè)的雜交后代，在雜交的過程中，通過核遷移 使兩側(cè)的雜交后代擁有相同的兩個細胞核但其細 胞質(zhì)與挑取側(cè)一方的親本相同，另外 2個菌株 18l-34和l18-52則是只選自一側(cè)的雜交后代。選取了 3又ssr引物對抱子單核體親本及其雜 交后代進行 pcr擴增，以“l(fā)808和“18菌株為對

41、照，電泳結(jié)果如圖7所示。以引物lefp-7對抱子單 核體l808sm-9和18sm-9及其雜交后代 18l-9和 l18-9的擴增結(jié)果為例，“l(fā)808r增出的2個位點交，獲得了 12個雜交子，其中 l18-9與18l-9、18l-46 與 l18-46、18l-58 與 l18-58、18l-91 與 的條帶編為 7-l-1與7-l-2 ,抱子單核體 l808sm-9只含有“ l808的其中一個位點條帶 7-l-2;相同的，表 2 l808pm-a、l808pm-2、l808生長速度1234l808pm-192.002.602.702.602.50l808pm-210.450.650.700.

42、550.59l808pm-221.201.101.101.001.10l808pm-272.502.602.602.402.50l808pm-373.303.203.503.503.40l808pm-412.002.001.902.002.00l808pm-532.802.502.602.502.60l808pm-642.402.502.602.402.50l808pm-781.901.801.701.701.80l808pm-851.701.701.501.801.70l808pm-1331.801.701.601.701.70l808pm-1452.902.803.203.103.00l8

43、08pm-1582.803.202.902.903.00l808pm-1612.802.702.802.802.80l808pm-21.000.980.890.920.95l808pm-20.840.880.920.950.90l808pm-20.600.530.570.540.56l8084.304.204.204.204.20l8084.204.304.304.404.30l8084.204.304.304.304.30table 2 growth rates of l808pm-a, l808pm-2 and l808菌株平均半徑菌落半徑radius of the colonies (c

44、m)注：1-4:菌落4個相互垂直方向的半徑note: 1 - 4: the radius of the coloniesfour perpendicular directions.“18也擴增出兩個位點的條帶編為7-18-1與 7-18-2，抱子單核體18sm-9也只含有“ 1照一個位 點條帶18-7-1 ;雜交后代18l-9和l18-9,都擴增 出了 18-7-1和l-7-2兩個位點的條帶，因此可以確 定菌株 18l-9 和 l18-9 為 l808sm-9 和 18sm-9 雜 交子，雜交成功，并且雜交后代擁有不同于親本“l(fā)808和“1照新的基因型。同理，通過同樣的帶 型分析，所有雜交后代

45、都能成功雜交，并能追溯到 相對應(yīng)的抱子單核體親本及抱子單核體產(chǎn)生的菌 株。因為細胞核遷移速度遠大于細胞質(zhì)遷移速度， 所以理論上取自同一雜交配對兩側(cè)的成對雜交后 代的核遺傳物質(zhì)相同，細胞質(zhì)不同。本實驗取自同一雜交配對兩側(cè)的成對雜交后代用這3對ssr引物不能作區(qū)分，都擴增出了相同的帶型，這也證明了 所用的ssr標記只能用于區(qū)分核基因組有差異的 菌株，不能用于反應(yīng)細胞質(zhì)的遺傳差異。另外對于同一對引物而言，不同雜交子的帶型 可能會相同，比如引物 lefp-7對18l-9、18l-46和 18l-34 ,弓 i物 lefp-43 對 18l-9、18l-34 和 l18-52 等的擴增帶型都相同，表明這

46、些不同雜交子之間在 同一個ssr位點有相同的基因型，因此一個 ssr 位點不足以將眾多雜交子都區(qū)分開來，但用幾個位 點的帶型組合就能加以區(qū)分，如上述 lefp-7對 18l-9、18l-46 和 18l-34 不能區(qū)分時，lefp-43 位圖6 l808pm-a、l808pm-2、l808及對峙培養(yǎng)菌絲的電子顯微結(jié)構(gòu)figure 6 mycelial structure of l808pm-a, l808pm-2, l808 and hybrids under electron microscope注：a : l808pm-a、l808pm-2、l808 菌絲的電子顯微結(jié)構(gòu)，a 為 l808p

47、m-a , b 為 l808pm-2 , c 為 l808 ; b : l808pm-a 與 l808pm-2對峙培養(yǎng)菌絲的電子顯微結(jié)構(gòu)；c: l808pm-1與其余l(xiāng)808pm-a對峙培養(yǎng)菌絲的電子顯微結(jié)構(gòu).note: a: electron microscopic structure of l808pm-a, l808pm-2, l808, a belongs to l808pm-a, b belongs to l808pm-2, c belongs tol808; b: confront culture results of l808pm-a and l808pm-2; c: confr

48、ont culture results of l808pm-1 and other l808pm-a.點能用于區(qū)分18l-9和18l-46 , lefp83位點都能區(qū) 分 18l-9 和 18l-34; lefp-43 對 18l-9、18l-34 和l18-52不能區(qū)分時，lefp83位點都能區(qū)分 18l-9和 18l-34, lefp-7 位點能區(qū)分 18l-9 和 l18-52。因此 在選用的ssr位點足夠多的時候就能用不同位點 組合的方式將絕大多數(shù)雜交后代鑒定和區(qū)分。3討論在原生質(zhì)體單核體的制備中，單核體的鑒定常 采用顯微觀察鎖狀聯(lián)合的方式進行，雖然可根據(jù)生長速度和顯微觀察淘汰雙核體，

49、但部分雙核體菌株也存在生長速度較慢、鎖狀聯(lián)合形成較晚的現(xiàn)象，導(dǎo)致發(fā)生誤檢的可能。 另外，鏡檢過程耗時、費力, 并且在確認單核體后需要經(jīng)過配對雜交來確定兩個不同的親本核型，尤其是在兩個核出現(xiàn)嚴重偏 分離的菌株中，雜交配對的工作將會大量增加。本 文選用的香菇品種“ l808兩個原生質(zhì)體單核體的偏分離比率高達 191:1,在前人的研究中也出現(xiàn)過 類似的高比例12,造成這種結(jié)果的原因可能是帶有 a核的原生質(zhì)體單核體萌發(fā)速度、生長速度快，掩m 1 2 3 4 5 6 7 fi 9 101112 13 1415 1617 1s1920 212223 2425262728293031323334353637

50、3339409008007-l-17-18-l7-1r-2700w- 7-l-2圖7 ssr標記對“l(fā)808和“18抱子單核體及其雜交子的擴增圖譜figure 7 ssr profile of sporulated monokaryons of l808 and 18 and their hybrids by 3 primer pairsnote: m: 50 bp ladder dna marker; a: primer pair lefp-7; b: primer pair lefp-43; c: primer lefp-83; 1-40 are strains: 18l-9, l18-9

51、,18sm-9, l808sm-9,“18 ,“ l808 ，18l-34, 18sm-34, l808sm-34,“18 ,“ l808 ，18l-46, l18-46, 18sm-46, l808sm-46,l18-52, 18sm-52, l808sm-52,“18 ,“ l808 ，18l-58, l18-58, 18sm-58, l808sm-58,“18 ,“ l808 ，18l-91, l18-91, 18sm-l808sm-91,“18 ,“l(fā)808” , 18l-120, l18-120, 18sm-120, l808sm-120,“18 ,“ l808 ” .蓋了萌發(fā)慢、生

52、長速度慢的b核原生質(zhì)體單核體。在這種情況下，以配對雜交的方式進行無疑將事倍 功半，需探索新的原生質(zhì)體鑒定方法。目前，在食用菌中對于單核體及雜交子的鑒 定，在香菇中曾用its序列分析進行鑒定13,在黑 木耳中采用熒光核染和酯酶同工酶技術(shù)來進行“用，在草菇中利用核特征 scar標記對雙核體的2個核 進行鑒定15,上述4種方法中，its序列分析對種 內(nèi)不同菌株分辨率低，熒光核染通過觀察菌絲形態(tài) 與核的分布規(guī)律來區(qū)分不同的單核體，這種方法容 易受菌絲表型的影響，并且在經(jīng)過重組的抱子單核 體后代中很難采用，酯酶同工酶技術(shù)則存在多態(tài)性 低的問題，而核特異性scar標記的開發(fā)難度較大， 并且同樣對經(jīng)過重組的

53、抱子后代利用價值不大。因 此，采用分子標記的方法進行單核體的區(qū)分既經(jīng)濟 又高效，kazuhiro等采用rapd標記對抱子單核體 后代進行了篩選，在 56對引物中獲得了 135個用 于區(qū)分單核體后代的標記16。利用分子標記技術(shù)進行單雙核區(qū)分及兩個不 同核型的鑒定具有優(yōu)勢和實用價值。操作簡單、帶型穩(wěn)定的分子標記結(jié)合快速的dna制備方法11可實現(xiàn)對兩種原生質(zhì)體單核體及抱子單核體的快速、 準確鑒定，與傳統(tǒng)的鏡檢再雜交的方法相比，可縮 短鑒定時間，提高鑒定的準確率，并且在利用這些 單核體進行遺傳或育種研究時還能用相同的分子 標記來追蹤相關(guān)基因型在后代中的傳遞。本研究用16株原生質(zhì)體進行傳統(tǒng)方法驗證時共用

54、了15 d檢測出不同核型的l808原生質(zhì)體單核體，而采用ssr 分子標記結(jié)合快速 dna提取法（僅需0.01 g菌絲）， 可在1 d內(nèi)完成dna制備、pcr擴增、聚丙烯酰 胺凝膠電泳檢測。當(dāng)待測原生質(zhì)體數(shù)量提高時，優(yōu) 勢更加明顯。在分子標記的選擇上， 本文用ssr標 記以及rapd標記同時進行了驗證， 都能準確地將 親本和兩個核區(qū)分開來，ssr標記較rapd標記帶 型穩(wěn)定，成功率高，且操作相對簡單17。在應(yīng)用前景上，部分二極性和絕大多數(shù)四極性的食用菌種類 都是雜交種，兩核之間的遺傳差異較大，因此大多 數(shù)分子標記都能容易地將兩個核以及眾多的抱子 單核體區(qū)分開來，自交育種在食用菌中雖有應(yīng) 用，但總

55、體數(shù)量少，且自交一二代也僅僅使一部分 位點發(fā)生純合，用分子標記來區(qū)分的可能性還是相 業(yè)一p 二人。單核體在食用菌育種的應(yīng)用中，雜交是最常用 的方法，常用的對稱雜交 （單單雜交）與不對稱雜交 （單雙雜交）中都要用到單核體，獲得的雜交后代中 同時具有兩個親本的部分遺傳物質(zhì)，這些遺傳物質(zhì) 從親本到單核體，再到雜交后代中的傳遞也有采用 分子標記進行研究的報道7,本文所用的ssr標記 證實其能準確地追蹤多個位點在各代中的傳遞，可 在育種工作中發(fā)揮重要的作用。育種中常使用原生 質(zhì)體融合技術(shù)進行新品種選育18-19,在原生質(zhì)體融 合前，對原生質(zhì)體進行遺傳標記是融合后檢測融合 是否成功的最有效方式，在分子標記沒有被廣泛使 用前，選用營養(yǎng)缺陷型或代謝突變型原生質(zhì)體或采 用原生質(zhì)體失活20的方法進行，本文在使用多個 ssr標記進行原生質(zhì)體鑒定的同時也對該原生質(zhì)體 進行了標記，可使后續(xù)的遺傳、育種研究順利進行。 另外，kwan等3與au等21分別用rapd分子標記 方法、低密度測序方法，以香菇菌株“l(fā)-54的抱子單核體群體構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，本文采用的ssr標記在香菇“l(fā)808兩個核上具有豐富的多態(tài)性，也 可用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，并且ssr標記的穩(wěn)