紅茶菌膜菌種的篩選和制作

1、 微生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)紅茶菌膜菌種的篩選和制作 指導(dǎo)老師：王冬梅 系別：生物與化學(xué)工程系專業(yè)：生物工程班級(jí)：03151 姓名：馬偉強(qiáng)學(xué)號(hào)：15203052同組成員：李洪興 方文 楊云文 陳嶺 南陽理工學(xué)院生化系 2005.122006.1 目錄一摘要。二關(guān)鍵詞。三正文。31文獻(xiàn)綜述。 32實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?3實(shí)驗(yàn)儀器、材料。 34實(shí)驗(yàn)步驟。341 高產(chǎn)酵母菌的選育。342 高產(chǎn)醋酸菌的選育。343 高產(chǎn)乳酸菌的選育。344 紅茶菌的制作。35討論及分析。四參考文獻(xiàn)。 15一、摘要紅茶菌，俗稱海寶，是一種傳統(tǒng)的活菌飲料，其味酸甜爽口，遍及世界幾十個(gè)國家研究表明，紅茶菌是由醋酸菌、乳酸菌和酵母菌形成的共生

2、菌，它能調(diào)整人體的某些生理功能，增強(qiáng)體質(zhì)，具有良好的抗菌能力，無毒性，因而深受人們喜愛本文試從自然界中分離出紅茶菌含有的醋酸菌、乳酸菌和酵母菌，對(duì)其進(jìn)行純化，然后通過誘變及定性的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)選育出高產(chǎn)菌株。最后將三種高產(chǎn)菌株按不同的配比接入紅茶糖水（紅茶：糖：水=0.2:5:200）中,培養(yǎng)5-7天,觀察培養(yǎng)液的色澤,口味,及菌膜的厚度,找出最佳配比,制作紅茶菌膜菌種.abstract： the black tea fungus, whose popular name is haibao , is one kind of traditional live fungus drink.the tast

3、e of it is both acid and sweet ,so it is very delicious and prevalent through nearly one hundred countries. research indicates that the black tea fungus is symbiotic microbes including the acetic acid fungus、the lactic acid fungus and the saccharomycetes , it can adjust certain physiological functio

4、ns of the human body, enhance the superiority of the mans health.the black tea fungus is non-toxic and has a greatful antibacterial ability, thus it is deeply loved by so many people. in this article we try to separate from the nature the three kind of microbes: the acetic acid fungus、the lactic aci

5、d fungus and the saccharomycetes that are contained in the black tea fungus.cluture them in good conditions ,and then carry out some fermentation test after mutagenesis. though the fermentation test the excellent productive strains of each of three fungus was selected. finally ,inoculate the three k

6、inds of productive strains according to different allocated proportion into the culture solution turns (which is made from the black and sucrose, the black tea: sugar: water =0.2:5:200), raises for 5-7 day, the colour 、 taste and the morphology (the thickness of the symbiotic microbes membrane) is o

7、bserved. then find out the best allocated proportion to make excellent spawn of the symbiotic microbes.二、關(guān)鍵詞（key word）發(fā)酵茶 fermentation tea 紅茶菌black tea fungus 酵母菌saccharomycetes 醋酸菌acetic acid fungus 乳酸菌lactic acid fungus誘變 mutagenesis 分離isolation三、正文31 文獻(xiàn)綜述3.1.1紅茶菌研究歷史提到神奇的紅茶菌，大家也許有點(diǎn)“丈二和尚摸不著頭腦”，因?yàn)樽?/p>

8、為一種養(yǎng)生健身飲料，紅茶菌對(duì)大家來說并不十分陌生，可是它卻有著不同尋常的身世。紅茶菌湯是一種從先秦時(shí)期起就在我國民間流傳的家制飲料，具有提神解毒作用，有“神茶”的美名。在東晉末年，為了給倭國贊王醫(yī)治消化不良癥，紅茶菌經(jīng)朝鮮傳入日本。在19世紀(jì)初，紅茶菌又被東亞商人帶到沙皇俄國。俄羅斯人稱紅茶菌湯為茶葉酸酒（茶科瓦斯）。后來紅茶菌又經(jīng)沙皇俄國傳遍歐洲。在上世紀(jì)80年代初期，紅茶菌飲料曾經(jīng)紅極一時(shí)，被推崇為能醫(yī)治百病的萬靈藥。這種過分的夸大宣傳自然經(jīng)不起時(shí)間的考驗(yàn)，紅茶菌飲料很快就被人們遺忘了。但是，紅茶菌飲料能從先秦流傳到現(xiàn)在，除了它的味道醇香、酸甜可口外，其保健功能也起了重要的作用。從1852

9、年起，在歐洲就開始了對(duì)紅茶菌湯功能的研究。20世紀(jì)初，在俄國就有飲紅茶菌湯能減輕頭痛和胃病的報(bào)道。第一次世界大戰(zhàn)期間，紅茶菌湯在歐洲被譽(yù)為俄國人的家制秘藥，這種神奇的飲料對(duì)調(diào)節(jié)士兵經(jīng)常發(fā)生的腸道功能失調(diào)特別有效。前蘇聯(lián)中央腫瘤研究所與俄羅斯聯(lián)邦科學(xué)院在1951年進(jìn)行的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，每天飲用紅茶菌湯具有很好的抗癌作用。在20世紀(jì)60年代進(jìn)行的研究再一次證明，紅茶菌湯有治療癌癥和解毒作用，長(zhǎng)期飲用能提高免疫力和促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生。施塔伊克勞斯等人在1996年報(bào)道，紅茶菌湯的抗幽門螺旋桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和腫脹膿桿菌作用主要是來源于發(fā)酵過程中生產(chǎn)的醋酸。3.1.2紅茶菌飲料的近期發(fā)展最近

10、，我國科學(xué)家運(yùn)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)研制出了“紅茶菌”茶飲料，以茶葉、低聚糖等為主要原料，最大特色是發(fā)酵型純天然，不加任何香精和酸味劑。 專家介紹，現(xiàn)代“紅茶菌”是由三種有益于人體健康的益生菌，即醋酸菌、酵母菌、乳酸菌組成的共生體系，它們通過自身特殊作用，將茶葉等原料經(jīng)過生物技術(shù)發(fā)酵工藝轉(zhuǎn)化為極其豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并賦予一種酸甜相宜、清香爽口的風(fēng)味。日本科學(xué)家坂田正義潛心研究多年后認(rèn)為，常飲紅茶菌，具有益于清理腸胃；降低血糖、血壓；有益于肝腎、排結(jié)石；有益于清肺、止咳、平喘；清心安神；抗衰老；抗癌癥等七大好處。美國營(yíng)養(yǎng)專家也認(rèn)為，紅茶菌對(duì)血壓具有雙向調(diào)節(jié)作用，還能夠提高t細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，

11、對(duì)關(guān)節(jié)疼痛、白發(fā)也有一定的功效。20世紀(jì)70年代曾經(jīng)風(fēng)靡一時(shí)，當(dāng)時(shí)民間把紅茶菌視為能治百病的神茶，吃了紅茶菌，有的高血壓患者血壓能保持穩(wěn)定;有的萎縮性胃炎顯著好轉(zhuǎn);有的長(zhǎng)期飲用便秘消失，更多的人飲用后感到精神充沛、疲勞消除、皮膚滋潤(rùn)、增強(qiáng)抗病能力,益處匪淺.3.1.3紅茶菌的功用與組成在民間被稱為海寶（在有些地方也叫胃寶）的紅茶菌是醋酸菌、乳酸菌與酵母菌的共生體，在用加糖茶水培養(yǎng)的過程中，隨著菌體的生長(zhǎng)，茶水也逐漸變酸。根據(jù)化學(xué)分析，已知發(fā)酵液的主要成分為醋酸、乳酸、d葡萄糖酸、葡萄糖酸內(nèi)酯、2羰基d葡萄糖酸、d葡萄糖二酸、地衣酸、乙醇和甘油。紅茶菌湯的多數(shù)功能也是來自它的酸性成分，紅茶菌湯的

12、解毒作用是由于葡萄糖醛酸能與毒素結(jié)合，有利于毒素排出體外，由毒素在體內(nèi)積累引起的痛風(fēng)和腎結(jié)石能以這種方式使癥狀得到緩解；重金屬或環(huán)境污染物質(zhì)在人體內(nèi)也可以通過葡萄糖醋酸化由腎排出體外。不過目前對(duì)這一解毒過程還有爭(zhēng)論，還有待做進(jìn)一步的研究。既然它對(duì)人體有這么多的好處，那么紅茶菌到底是一種什么東西？微生物學(xué)的研究揭開了這些秘密。紅茶菌培養(yǎng)物中，含有大量醋酸菌、酵母菌和乳酸菌。其中又以醋酸菌和酵母菌為主。紅茶菌中的酵母菌，主要是啤酒酵母，醋酸菌則主要是膠膜醋酸桿菌，乳酸菌主要是乳酸桿菌。此外，酵母菌中所含的酵母葡萄糖、無機(jī)鹽以及vb、ve對(duì)人體具有很強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)作用，特別是酵母菌的細(xì)胞壁能產(chǎn)生一種叫做b

13、古魯千的物質(zhì)，這種物質(zhì)是當(dāng)今世界各國公認(rèn)的治癌抗癌物質(zhì)；醋酸菌能吸收酵母菌分解出來的酒精，并分泌醋酸酶，把酒精氧化成醋酸和水，同時(shí)放出熱量，使得人體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)得到充分利用，促進(jìn)新陳代謝，抑殺腸道內(nèi)有害細(xì)菌；乳酸菌的存在破壞了細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在偏酸的情況下生長(zhǎng)受到抑制，直至死亡，乳酸菌具有抑殺腸道內(nèi)有害細(xì)菌，增強(qiáng)人體抵抗病毒的能力。因此篩選性發(fā)酵能力高的菌株具有很好的應(yīng)用前景。3.1.4 紅茶菌的食用機(jī)制紅茶菌的菌膜，是個(gè)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含上述3個(gè)菌種。膜多時(shí)，可以食用，生食似海蜇皮，烹調(diào)后食則如魚片（注：菌膜去酸，是先用水浸洗，并加熱以脫去酸味，最后再侵入風(fēng)梨糖漿中煮沸，即可由強(qiáng)韌菌膜變成

14、柔軟如洋菜或豆腐狀）。紅茶菌雖價(jià)廉，但具人參、鹿茸等補(bǔ)益之效，能益壽延年、抗老保健，而且能治療多種疾病。紅茶菌是自己能夠培養(yǎng)的良茶，又十分可口，這是其它保健藥所不及的。常飲紅茶菌能治病強(qiáng)身保健康。 紅茶菌是集飲用,藥用,食用為一體的復(fù)合菌群。紅茶菌發(fā)酵液中,含有30多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和人體不可缺少的八種氨基酸.。紅茶菌體呈海蜇狀，表面光滑.紅茶菌培養(yǎng)液可直接飲用,味似酸梅汁,果香氣濃郁,酸甜適宜.紅茶菌自身抗菌,殺菌力強(qiáng),菌體發(fā)酵快,酸化程度高,培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)單,容易進(jìn)入千家萬戶.紅茶菌富含乳酸菌,酵母菌,醋酸菌,有機(jī)酸,糖類,維生素b、c氨基酸及其他共三十多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).具有強(qiáng)身,美容,益壽

15、三大功效,在中國民間廣為流傳，名揚(yáng)四海。3.1.5紅茶菌的研究意義紅茶菌飲料為營(yíng)養(yǎng)保健珍品，不但酸甜可口，而且清涼解熱，獨(dú)具風(fēng)味，冠壓群芳。中國苗鄉(xiāng)紅茶菌（海寶、胃寶）,名揚(yáng)四海，它內(nèi)含乳酸菌、醋酸菌、酵母菌、茶、糖、維生素等約二千種天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其菌母晶瑩透亮，茶飲金黃飄香，用茶水和白糖再加上紅茶菌菌種培養(yǎng)能自然生長(zhǎng)變大，它比其它酸性飲料營(yíng)養(yǎng)更豐富，保健醫(yī)療功效更多，副作用更小，被專家譽(yù)為“飲料王”，是世界罕見的營(yíng)養(yǎng)保健自產(chǎn)自飲珍品。由于紅茶菌具有營(yíng)養(yǎng)、預(yù)防、保健、醫(yī)療、康復(fù)五大功效，又能防治癌癥、心臟、腦血管、腸胃、肝腎、肥胖、斑禿等28種疾病，紅茶菌不僅味道酸甜可口，如檸檬汁、楊梅湯、男

16、女老幼有常飲不厭之感，因而它功效卓著，優(yōu)于目前的微生物藥劑。國家科委、全國新產(chǎn)品新技術(shù)辦公室均列為98重點(diǎn)計(jì)劃推廣項(xiàng)目， 紅茶菌生物工程的科技論文載入世界名醫(yī)文獻(xiàn)庫、英國世界名醫(yī)論文經(jīng)典。紅茶菌由于富有以上多種有益于人體的微生物，經(jīng)常飲之，確實(shí)能起到防病治病、延年益壽的保健作用，因而被稱為奇茶。3.1.6紅茶菌飲料的市場(chǎng)分析1、茶飲料市場(chǎng)中國國內(nèi)茶飲料雖然起步較晚，但發(fā)展卻極為迅速，短短幾年內(nèi)，便由起步階段邁向高速發(fā)展期。1997年全國茶飲料生產(chǎn)僅20萬噸，1999年即達(dá)200萬噸，增長(zhǎng)了l0倍。雖然冰茶仍占主導(dǎo)地位，但所占比列已經(jīng)開始下降，純茶比例明顯上升，這與消費(fèi)者所倡導(dǎo)的純天然、保健型的

17、綠色飲料的趨勢(shì)是一致的。從目前整個(gè)飲料市場(chǎng)采看，茶飲料所占比例仍比較小，人均則更少，茶飲料在中國的市場(chǎng)潛力非常巨大。就國際飲料發(fā)展情況來看，純茶飲料也是茶飲料發(fā)展的一個(gè)主要方向，市場(chǎng)前景十分廣闊。2、紅茶菌飲料市場(chǎng)依靠著茶飲料在國內(nèi)和世界市上的迅速發(fā)展，紅茶菌飲料做為一種綠色的茶飲料也在世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中占據(jù)了一定的席位。21世紀(jì)的發(fā)展方向?yàn)榫G色和環(huán)保，于是紅茶菌飲料做為目前來說最為合格的綠色茶飲料閃亮登場(chǎng)。盡管目前來說，紅茶菌飲料并沒能代替?zhèn)鹘y(tǒng)飲料在人們飲食結(jié)構(gòu)中的地位，但是隨著時(shí)間的推移它就會(huì)越來越貼近我們的生活，并依賴其保健及藥用功能占據(jù)飲料的主流。32實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.2.1 紅茶菌基本菌的篩

18、選紅茶菌是由酵母菌、醋酸菌、乳酸菌三種基本微生物組成的，故先在自然界用各自分離篩選培養(yǎng)基篩選出三種菌株，然后用紫外線進(jìn)行誘變篩選出高產(chǎn)菌株。3.2.2紅茶菌的制作紅茶菌是有以上三種微生物按照不同比例混合，以發(fā)酵茶產(chǎn)生速率，菌膜厚度和風(fēng)味.色澤為衡量標(biāo)準(zhǔn)，挑選出發(fā)酵速率快而且菌膜厚且透明度高，風(fēng)味獨(dú)特，口感好，色澤純正的為合適菌株，純化保藏。33實(shí)驗(yàn)儀器、材料331儀器ldzx-401型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠gnp-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司dhg-9146型電熱隔溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司721分光光度計(jì) 上海國營(yíng)長(zhǎng)江科學(xué)儀器廠85

19、-1磁力攪拌器 江蘇醫(yī)療儀器廠xsp-3c型單筒顯微鏡；超凈工作臺(tái)、電子天平、剪刀、培養(yǎng)皿、試管、白瓷盤、白瓷缸、玻璃棒、酒精燈、接種環(huán)、三角瓶、吸管、搖床332材料出發(fā)菌：土壤梯度稀釋溶液取5g土壤(自然界土層表面2cm以下新鮮土壤)，放在裝有45ml無菌水和玻璃珠的三角瓶中，搖勻，洗取1ml于9ml的無菌水試管中即稀釋倍數(shù)為10-1，逐級(jí)稀釋到10-2，10-3.10-6，10-7。34實(shí)驗(yàn)步驟 341 高產(chǎn)酵母菌的選育1. 酵母菌的分離和純化1.1 材料:土壤梯度稀釋溶液培養(yǎng)基：酵母菌分離培養(yǎng)基：10 g大麥芽粉65度糖化，經(jīng)碘化鉀試紙檢驗(yàn)，試紙不變藍(lán) .瓊脂10g.蒸餾水500ml酵母

20、菌選擇培養(yǎng)基：酵母膏 5g .蛋白胨 10g .葡萄糖 10g .瓊脂 10g .蒸餾水 500ml1.2 酵母菌分離篩選流程：土壤溶液稀釋選擇性培養(yǎng)鏡檢純化斜面保藏1.3 具體步驟 1.3.1 將各種稀釋梯度的菌懸液各取1ml，注入盛有分離培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)稀釋梯度做兩個(gè)平板，置于30度下生長(zhǎng)2d3d，觀察菌落的形態(tài)。1.3.2 挑選6個(gè)乳白色，圓形，表面光滑，大且厚的菌落進(jìn)行鏡檢。鏡檢結(jié)果如表一:表一 酵母菌特征和鏡檢結(jié)果菌株形狀邊緣表面色澤隆起鏡檢形狀（16*40倍）芽孢染色（16*100油鏡）1#圓形不整齊光滑乳白微凸臘桿狀可見綠色芽孢2#圓形整齊光滑乳白微凸球狀可見綠色芽孢3#圓

21、形整齊光滑乳白隆起球狀可見綠色芽孢4#圓形整齊光滑乳白平坦球狀可見綠色芽孢5#圓形不整齊光滑乳白微凸臘桿狀可見綠色芽孢6#圓形不整齊光滑乳白隆起橢球狀可見綠色芽孢以上六個(gè)單獨(dú)菌落，挑選出菌落特征比較明顯的3#進(jìn)行斜面培養(yǎng)1.3.3 酵母菌種的純化取2環(huán)菌種，置于10ml無菌水中即為10-1，逐級(jí)稀釋到10-3各取1ml菌液，注入盛有分離培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2d，觀察菌落形態(tài)，根據(jù)生長(zhǎng)狀況結(jié)合鏡檢篩挑選出單菌落酵母菌菌株。同時(shí)將以上單菌落轉(zhuǎn)接到裝有選擇培養(yǎng)基的試管斜面培養(yǎng)，待用2. 酵母菌的誘變2.1原理:紫外線主要作用是使dna雙鏈之間或同一條鏈上兩個(gè)相鄰的嘧啶形成二聚體，從而引起突變。2.

22、2 具體步驟:2.2.1 取培養(yǎng)48小時(shí)的豐滿酵母菌斜面，用10ml左右的無菌生理鹽水洗滌，用接種針輕輕刮兩次，再倒入放有磁針的無菌的三角瓶中，將其在磁力攪拌器上攪拌30s。2.2.3 將選擇培養(yǎng)基融化，倒27個(gè)平板凝固后待用。2.2.4 將紫外線開關(guān)打開預(yù)熱20min，取直徑9cm取的平皿兩套，分別加入上述菌液5ml，并放入一跟大頭針。將上述兩套平皿先后放在磁力攪拌器上，打開板蓋，在距離為30cm功率為30w的紫外燈下照射20s 和35s，蓋上皿蓋，關(guān)閉紫外燈。2.2.5分別取1ml菌液，逐級(jí)稀釋成倍數(shù)分別為10-1，10-2.10-6酵母菌種懸液。每個(gè)稀釋度涂三個(gè)平板，每套平板加稀釋菌液0

23、.2ml用無菌涂棒均勻的涂滿整個(gè)平板表面。同樣的操作，取未經(jīng)紫外線誘變的稀釋菌液涂布作為對(duì)照。2.2.6將以上平板放在暗箱中，30度下培養(yǎng)24h。2.2.7分別挑選20s和35s中菌落圓形，乳白 ，大且厚，表面光滑的各三個(gè)進(jìn)行試管斜面培養(yǎng).同樣在未誘變的對(duì)照組中挑選一個(gè)菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng).3. 高產(chǎn)酵母菌選育3.1酵母菌發(fā)酵能力的測(cè)定3.1 .1 由于表觀糖度直觀的表現(xiàn)出了發(fā)酵速率，通過糖度的測(cè)量其外觀糖度，得出起發(fā)酵速度3.1.2 取待測(cè)的7支菌株，分別接一環(huán)于裝有20ml 3.5bx 的麥芽汁的試管中，在25度恒溫培養(yǎng)24小時(shí)。3.1.3以上試管的軍種分別接入裝有350ml 3.5bx的麥芽

24、汁的小三角瓶中，經(jīng)過四天發(fā)酵. 酵母菌發(fā)酵液的表觀糖度如表二 表二 酵母菌發(fā)酵液的表觀糖度1#2#3#4#5#6#7#表觀糖度（bx）1.41.91.92.21.82.42.03.2 選擇高產(chǎn)菌株由此可見發(fā)酵能力1#最大， 6#最小 。故選取1#酵母菌菌株置于裝有酵母菌選擇性培養(yǎng)基的試管斜面活化保藏，作為后續(xù)紅茶菌的組成待用。342 高產(chǎn)醋酸菌的選育1. 醋酸菌的分離和純化1.1 材料:土壤梯度稀釋溶液培養(yǎng)基:分離培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g、酵母膏 10 g、碳酸鈣 20 g、瓊脂 15 g、蒸餾水 1000 ml、ph=6.8選擇培養(yǎng)基：葡萄糖50 g、酵母膏 10 g、瓊脂 5 g、蒸餾水

25、1000 ml1.2 醋酸菌分離篩選流程：土壤稀釋液稀釋分離產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)初篩復(fù)篩斜面保藏1.3 具體步驟:1.3.1 吸取土壤梯度溶液10-4、10-5、10-6濃度，取各濃度稀釋液0.2ml，用涂布法接種于醋酸菌分離培養(yǎng)基平板上，30培養(yǎng)48h.1.3.2 在葡萄糖、酵母膏培養(yǎng)基上菌落呈油脂狀，顏色灰白，表面隆起平滑，邊緣整齊，培養(yǎng)基內(nèi)不產(chǎn)生色素, 挑取透明圈大、菌落豐厚且占生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的單菌落進(jìn)行鏡檢。1.3.3 革蘭氏染色原理：革蘭氏染色是建立在由于革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌間細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的不同所引起的差異上的。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁富含類脂質(zhì)，面肽聚糖含量很少，酒精可穿過細(xì)胞壁，溶解結(jié)晶

26、紫碘液，使細(xì)胞保持無色。相反，革蘭氏陽性菌細(xì)胞的細(xì)胞壁含有大量 的肽聚糖，脂肪含量則很少，因此，肽聚糖的厚度及酒精對(duì)它的水解使灑精不能進(jìn)入細(xì)胞，從而使細(xì)胞保持由結(jié)晶紫碘液染成的紫色或深藍(lán)色。操作：標(biāo)本涂片的制備：取一滴無菌生理鹽水放在潔凈的載玻片上，用接種針或接種環(huán)直接從醋酸菌固體培養(yǎng)基上取出小環(huán)菌落菌體，在生理鹽水中混勻，自然干燥，在火焰上固定2-3次。冷卻后，進(jìn)行染色。染色：在已固定的標(biāo)本涂片上滴幾滴結(jié)晶紫溶液，反應(yīng)2分鐘后用水沖洗。滴1-2滴路哥氏碘溶液，反應(yīng)30秒后用水沖洗，并用濾紙吸干。滴幾滴蕃紅復(fù)染液，反應(yīng)10秒鐘后用水沖洗，并用濾紙吸干。用油鏡觀察。結(jié)果：細(xì)胞短桿狀，染成紅色,革

27、蘭氏陰性，成對(duì)或成鏈,初步認(rèn)定此細(xì)菌為醋酸菌。1.3.4 產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)：將上述斜面菌種分別接種于含3%（v/v）乙醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30靜置淺層培養(yǎng)72h后，取5ml除去菌體的培養(yǎng)基，以2.5mol/lnaoh溶液中和至ph7.0，加入5%fecl3溶液56滴，形成紅褐色沉淀者為產(chǎn)醋酸細(xì)菌。1.3.5初篩：把以上分離得到的單菌落菌株，在碳酸鈣平板培養(yǎng)基上進(jìn)一步分離、培養(yǎng)，繼續(xù)觀察確認(rèn)是形態(tài)一致的單菌落后，根據(jù)其透明圈直徑與菌落直徑之比的hc值大小進(jìn)行初篩，將hc值明顯大于其他菌株的單菌落菌株篩選出來，進(jìn)行下一步復(fù)篩試驗(yàn)。1.3.6復(fù)篩：將上述初篩菌株分別接種于分離培養(yǎng)基，于30靜置淺層培養(yǎng)。

28、把此復(fù)篩后的菌株做為始發(fā)菌株。2. 醋酸菌的誘變2.1原理及流程:紫外線主要作用是使dna雙鏈之間或同一條鏈上兩個(gè)相鄰的嘧啶形成二聚體，從而引起突變誘變篩選流程：始發(fā)菌株紫外線誘變處理分離純化產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)初篩復(fù)篩菌種鑒定斜面保藏2.2 具體步驟:2.2.1取培養(yǎng)48小時(shí)的豐滿醋酸菌斜面，用10ml左右的無菌生理鹽水洗滌，用接種針輕輕刮兩次，再倒入放有磁針的無菌的三角瓶中，將其在磁力攪拌器上攪拌30s。2.2.2將選擇培養(yǎng)基（加入2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳酸鈣）融化，倒27個(gè)平板凝固后待用。2.2.3將紫外線開關(guān)打開預(yù)熱20min，取直徑9 mm的平皿兩套，分別加入上述菌液5ml，并放入一跟大頭針。將上

29、述兩套平皿先后放在磁力攪拌器上，打開皿蓋，在距離為30cm功率為30w的紫外燈下照射15s 和30s，蓋上皿蓋，關(guān)閉紫外燈。2.2.4分別取1ml菌液，逐級(jí)稀釋到10-4、10-5、10-6濃度的醋酸菌種懸液。每個(gè)稀釋度涂三個(gè)平板，每套平板加稀釋菌液0.2ml用無菌涂棒均勻的涂滿整個(gè)平板表面。同樣的操作，取未經(jīng)紫外線誘變的稀釋菌液涂布作為對(duì)照。2.2.5將以上平板放在暗箱中，30下培養(yǎng)24h。2.2.6分別挑選15s和30s中菌落圓形，灰白 ，菌落大且豐厚，透明圈直徑與菌落直徑之比的hc值大的菌落各三個(gè)進(jìn)行試管斜面培養(yǎng).同樣在未誘變的對(duì)照組中挑選一個(gè)菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng).2.2.7菌種鑒定：細(xì)胞短

30、桿狀，革蘭氏陰性，成對(duì)或成鏈。在葡萄糖、酵母膏培養(yǎng)基上菌落呈油脂狀，顏色灰白，表面隆起平滑，邊緣整齊，培養(yǎng)基內(nèi)不產(chǎn)生色素。2.2.8分離篩選：誘變處理后的分離純化、初篩和復(fù)篩等操作同前述方法。3. 高產(chǎn)醋酸菌選育3.1醋酸菌發(fā)酵能力的測(cè)定產(chǎn)酸量的測(cè)定：在始發(fā)菌株、誘變15 s的菌株和誘變30 s的菌株試管中各挑取2環(huán)分別接入盛有10 ml液體培養(yǎng)基的7個(gè)試管中，加入3滴0.5 %酚酞試劑，用標(biāo)定的0.1 mol/lnaoh溶液滴定至淺粉色。由耗用的naoh溶液的體積計(jì)算樣品中的含酸量（以醋酸計(jì)）。結(jié)果如表三表三 三種菌株的產(chǎn)酸量結(jié)果 g/l菌株號(hào)始發(fā)菌株誘變15 s的菌株誘變30 s的菌株1#

31、2#3#4#5#6#7#產(chǎn)酸量3.2 選擇高產(chǎn)菌株表三結(jié)果表明：經(jīng)誘變篩選后的產(chǎn)酸量明顯高于始發(fā)菌株的產(chǎn)酸量，其中產(chǎn)酸量最好的菌株是343 高產(chǎn)乳酸菌的選育1. 乳酸菌的分離和純化1.1 材料:土壤梯度稀釋溶液培養(yǎng)基:乳酸菌的分離培養(yǎng)基：mrs培養(yǎng)基蛋白棟10.0g 酵母提取物5.0g 酵母膏10.0g 吐溫80 1ml 葡萄糖 20.0g k2hso4 2.0g mgso47h2o 0.25g 乙酸鈉 5.0g 檸檬酸二銨2.0g 0.2%溴甲酚紫 1ml 蒸餾水 1l 調(diào)ph 6.26.4乳酸菌培養(yǎng)基牛肉膏5g 酵母膏5g 蛋白胨 10g 葡萄糖 10g 乳糖果5g 氯化鈉 5g 水100

32、0ml 121攝氏度濕熱滅菌20min ph 6.8蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨 10g 氯化鈉 5g 水 1000ml ph 7.27.4 121攝氏度濕熱滅菌20min糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基1000ml ,1.6%溴甲酚紫乙醇溶液12ml ,ph7.6, 20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各 10ml制法：1)將上述含指示劑的蛋白胨水培養(yǎng)基（ph：7.6）分裝于試管中，在每管內(nèi)放 一倒置的小玻璃管（durhem tube）,使充滿培養(yǎng)基。2)將已分裝好的蛋白胨水培養(yǎng)基和20%的各種糖溶液分別滅菌，蛋白胨水培養(yǎng)基121攝氏度滅菌20min,糖溶液112攝氏度滅菌30min。3) 滅菌后，每管以無菌

33、操作分別加入20%的糖溶液0.5 ml ，則成1%的濃度。有關(guān)溶液：1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫1.6g溶于100ml水中，貯存于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?0.2%溴甲酚紫溶液：溴甲酚紫0.2g溶于100ml水中，貯存于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?吲哚試劑：對(duì)二甲基氨基苯甲醛8g ，95%乙醇760ml ，濃鹽酸160ml1.2乳酸菌分離篩選流程：土壤稀釋液稀釋分離產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)初篩復(fù)篩斜面保藏1.3 具體步驟131 吸取土壤梯度溶液10-4、10-5、10-6濃度，取各濃度稀釋液0.2ml，用涂布法接種于乳酸菌分離培養(yǎng)基平板上，28-30培養(yǎng)48h.132 觀察在平板上出現(xiàn)了圓形稍扁平的黃色菌落，周

34、圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，取出少量在顯微鏡下觀察其形態(tài)。133 革蘭氏染色 原理與操作步驟如上 結(jié)果：細(xì)胞鏈球狀，染成紫色,革蘭氏陽性，初步認(rèn)定此細(xì)菌為乳酸菌。134乳酸菌的鑒定實(shí)驗(yàn)吲哚實(shí)驗(yàn)：1） 試管標(biāo)記：取裝有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管3支，分別標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì)照。2） 接種培養(yǎng)：以無菌操作分別接種少量菌苔到標(biāo)記乳酸菌的試管中，標(biāo)記有空白對(duì)照的不接種，置37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。觀察記錄：在培養(yǎng)基中加入乙醚12ml，經(jīng)充分振蕩，使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的表面，此時(shí)沿管壁慢加入510滴吲哚試劑，如有吲哚存在，乙醚呈玫瑰色，此為吲哚試驗(yàn)陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。3）結(jié)果：

35、加入菌種的試管無任何變化，證明為陰性反應(yīng)。說明該菌不具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力。也說明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)榇竽c桿菌的吲哚試驗(yàn)為陽性。糖發(fā)酵試驗(yàn)1） 試管標(biāo)記：取分別裝有葡萄糖，蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各3支，每種糖發(fā)酵試管中分別標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì)照。2） 接種培養(yǎng)：以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對(duì)照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置試管中，置37攝氏度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。3） 觀察記錄：與對(duì)照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反映結(jié)果為陰性；如果培養(yǎng)液呈黃色，反映結(jié)果為陽性，培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性

36、反應(yīng)。4） 結(jié)果：在加入葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，且杜氏小管內(nèi)無氣泡。加入蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后的反應(yīng)結(jié)果也為陽性且杜氏小管內(nèi)無氣泡。證明該菌種能分解葡萄糖和蔗糖而產(chǎn)酸。杜氏小管內(nèi)沒有氣泡，說明該菌種分解糖后不產(chǎn)氣。也證明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)槿绻谴竽c桿菌除了產(chǎn)酸反應(yīng)結(jié)果為陽性外，而且杜氏小管內(nèi)會(huì)有氣泡，因?yàn)榇竽c桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣的能力。135乳酸的檢測(cè) 操作：選用已經(jīng)分離的菌種做小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，取發(fā)酵的上清液約10ml于試管中，加入10%硫酸1ml，再另2%高錳酸鉀1ml，此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，把事先在含氨的硝酸銀溶液中浸泡的濾紙條搭在試管口中，微火加熱試管至沸，觀察濾紙變化。 結(jié)果：通過濾紙條變黑，說明有乳酸存在。因?yàn)樵诎l(fā)酵的上清液中加入10%硫酸1ml和2%高錳酸鉀1ml后，此時(shí)上清液中的乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，另熱后使乙醛揮發(fā)，因此使濾紙條變黑。以上種種特征均符合乳酸菌的特征。鏈球狀的即為乳酸菌中的乳鏈球菌。136 挑選此菌株進(jìn)行連續(xù)6次以上的傳代，以達(dá)到提純，同時(shí)將以上單菌落轉(zhuǎn)接到裝有選擇培養(yǎng)基的試管斜面培養(yǎng)，待用。2. 乳酸菌的誘變21誘變?cè)砑胺椒ㄈ缟纤觯ㄕT變所用選擇培養(yǎng)基加指示劑為0.2%溴甲酚紫）