第七章 組織工程學(xué)概述

1、第七章 組織工程學(xué)概述 組織工程的概念組織工程的概念 組織工程三要素組織工程三要素 組織工程相關(guān)生物材料組織工程相關(guān)生物材料 組織工程研究方法組織工程研究方法 組織工程化皮膚及骨的應(yīng)用及展望組織工程化皮膚及骨的應(yīng)用及展望 1. 組織工程的概念組織工程的概念 Robert Langer教授和麻省理工大學(xué)教授和麻省理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院的臨床醫(yī)生醫(yī)學(xué)院的臨床醫(yī)生Joseph P Vcanti 正式提出組織工程的概念正式提出組織工程的概念 1987年，美國國家科學(xué)院基金會(huì)在年，美國國家科學(xué)院基金會(huì)在 加利福尼亞的加利福尼亞的Lake Tahoe舉行的專舉行的專 家討論會(huì)上明確了組織工程的定義家討論會(huì)上明確

2、了組織工程的定義 1984年華人學(xué)者馮元楨首次提出年華人學(xué)者馮元楨首次提出 組織工程的概念組織工程的概念 一）一）.提出提出 二）二）.組織工程學(xué)定義：組織工程學(xué)定義： 運(yùn)用工程科學(xué)和生命科學(xué)的原理及方運(yùn)用工程科學(xué)和生命科學(xué)的原理及方 法，從根本上認(rèn)識(shí)正常和病理的哺乳動(dòng)法，從根本上認(rèn)識(shí)正常和病理的哺乳動(dòng) 物組織和結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系，并研究生物物組織和結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系，并研究生物 學(xué)的替代物，以恢復(fù)、維持和改進(jìn)組織學(xué)的替代物，以恢復(fù)、維持和改進(jìn)組織 的生物替代物的一門科學(xué)。的生物替代物的一門科學(xué)。 三）. 組織工程基本原理 應(yīng)用工程學(xué)、生命科學(xué)和材料學(xué)的原理與方法，應(yīng)用工程學(xué)、生命科學(xué)和材料學(xué)的原理與

3、方法， 將在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的功能相關(guān)的活細(xì)胞種植于將在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的功能相關(guān)的活細(xì)胞種植于 多孔支架上，細(xì)胞在支架上增殖、分化，構(gòu)建生多孔支架上，細(xì)胞在支架上增殖、分化，構(gòu)建生 物替代物，然后將之移植到組織病損部位，達(dá)到物替代物，然后將之移植到組織病損部位，達(dá)到 修復(fù)、維持或改善損傷組織的功能。修復(fù)、維持或改善損傷組織的功能。 科學(xué)意義：不僅在于為解除病人痛苦提供了一種科學(xué)意義：不僅在于為解除病人痛苦提供了一種 新的治療方法，更重要的是提出了新的治療方法，更重要的是提出了復(fù)制復(fù)制“組織組織”、 “器官器官”的新思想，它標(biāo)志著的新思想，它標(biāo)志著“生物科技人體生物科技人體時(shí)時(shí) 代代”的到來，是的

4、到來，是“再生醫(yī)學(xué)再生醫(yī)學(xué)的新時(shí)代的新時(shí)代”，是，是“一一 場深遠(yuǎn)的醫(yī)學(xué)革命。場深遠(yuǎn)的醫(yī)學(xué)革命。 核心：構(gòu)件由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維復(fù)合體。核心：構(gòu)件由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維復(fù)合體。 三要素：三要素： 種子細(xì)胞種子細(xì)胞 生長因子生長因子 支架材料支架材料 2.組織工程的三要素組織工程的三要素 組織工程的三要素組織工程的三要素 假體 支架 種子細(xì)胞 生長因子 種子細(xì)胞干細(xì)胞 支架：細(xì)胞立腳點(diǎn)的支撐體。人工細(xì)胞外基質(zhì)稱 為細(xì)胞增殖和分化的“立腳點(diǎn)”，例如，立體海 綿狀骨膠原。 生長因子：讓細(xì)胞增殖和分化的因子。要確保必 須的細(xì)胞立腳點(diǎn)，必須讓細(xì)胞的數(shù)量大幅增加。 控制細(xì)胞分裂的是一種被稱為“細(xì)

5、胞增殖因子” 的蛋白質(zhì)。 一）.種子細(xì)胞 種子細(xì)胞是組織工程研究的基礎(chǔ)，也是制約組種子細(xì)胞是組織工程研究的基礎(chǔ)，也是制約組 織工程發(fā)展的瓶頸。織工程發(fā)展的瓶頸。 主要原因：主要原因： 許多組織細(xì)胞（如軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）的供體來源許多組織細(xì)胞（如軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）的供體來源 和擴(kuò)增能力均非常有限，無法通過取少量組織體外擴(kuò)增細(xì)和擴(kuò)增能力均非常有限，無法通過取少量組織體外擴(kuò)增細(xì) 胞來構(gòu)建大塊組織，很難實(shí)現(xiàn)胞來構(gòu)建大塊組織，很難實(shí)現(xiàn)“小損傷修復(fù)大缺損小損傷修復(fù)大缺損”的組的組 織工程基本設(shè)想。織工程基本設(shè)想。 干細(xì)胞干細(xì)胞來源廣，增殖力強(qiáng)，又能定向誘導(dǎo)分化為多種來源廣，增殖力強(qiáng)，又能定向誘導(dǎo)分化為

6、多種 目的細(xì)胞并形成相應(yīng)組織，因此，應(yīng)用干細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)目的細(xì)胞并形成相應(yīng)組織，因此，應(yīng)用干細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn) “小損傷修復(fù)大缺損小損傷修復(fù)大缺損”的基本設(shè)想，這為解決組織工程種的基本設(shè)想，這為解決組織工程種 子細(xì)胞問題提供了良好機(jī)遇。子細(xì)胞問題提供了良好機(jī)遇。 二.）支架 1）定義 能與組織活體細(xì)胞結(jié)合并能植入生物體的三維結(jié) 構(gòu)體 2）支架材料最基本的特征 l 與活體細(xì)胞直接結(jié)合：羥基磷灰石（HAP）、聚乳 酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）網(wǎng)、尼龍網(wǎng) l 與生物系統(tǒng)結(jié)合：植入生物體的組織工程化軟骨、 骨、肌腱、牙、肺、肝、腎等組織與機(jī)體的結(jié)合 l 具備細(xì)胞相容性和組織相容性（統(tǒng)稱生物相容性） 3）

7、支架材料 材料：鈣磷材料、多聚物（合成的和自然的） 要求：微孔結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、可降解、力學(xué)性能 作用： 在結(jié)構(gòu)上加強(qiáng)缺損部位的強(qiáng)度； 阻礙周圍組織長入； 作為體外接種的細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增和增殖的支架； 利用與細(xì)胞整合素以及受體的相互作用，作為一 種可溶的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子； 作為細(xì)胞、生長因子和基因的生物載體。 三）.生長因子 1）定義）定義 在細(xì)胞間傳遞信息并對(duì)細(xì)胞生長具有調(diào)節(jié)功能的一些在細(xì)胞間傳遞信息并對(duì)細(xì)胞生長具有調(diào)節(jié)功能的一些 多肽類物質(zhì)，它可以促進(jìn)或者抑制細(xì)胞的增殖、分化、遷多肽類物質(zhì)，它可以促進(jìn)或者抑制細(xì)胞的增殖、分化、遷 移和基因的表達(dá)。移和基因的表達(dá)。 2）分類）分類 按受體的結(jié)構(gòu)分

8、類，成纖細(xì)胞生長因子（按受體的結(jié)構(gòu)分類，成纖細(xì)胞生長因子（FGF）、表）、表 皮細(xì)胞生長因子（皮細(xì)胞生長因子（EGF）和肝細(xì)胞生長因子（）和肝細(xì)胞生長因子（HGF）等）等 3）將生長因子用于組織工程技術(shù)中時(shí)，有兩種不）將生長因子用于組織工程技術(shù)中時(shí)，有兩種不 同的方式：同的方式： 生長因子直接復(fù)合到支架上或者在支架構(gòu)建之后再與其符生長因子直接復(fù)合到支架上或者在支架構(gòu)建之后再與其符 合；合； 在支架上同時(shí)移植能分泌生長因子的細(xì)胞。在支架上同時(shí)移植能分泌生長因子的細(xì)胞。 3.組織工程研究方法 1）研究的核心內(nèi)容：研究的核心內(nèi)容：合適的種子細(xì)胞來源、可供細(xì)胞粘合適的種子細(xì)胞來源、可供細(xì)胞粘 附生長的

9、生物支架附生長的生物支架(或細(xì)胞外基質(zhì)或細(xì)胞外基質(zhì))、用于促進(jìn)組織再生長、用于促進(jìn)組織再生長 因子和組織的相容性等問題。因子和組織的相容性等問題。 2）利用組織工程方法生成活體替代組織或器官常可 使用 細(xì)胞分離細(xì)胞分離 體外培養(yǎng)擴(kuò)增體外培養(yǎng)擴(kuò)增 種植到多孔支架種植到多孔支架 植入缺損部位植入缺損部位 生物活性肽生物活性肽 多孔支架多孔支架 策略策略2 策略策略1 微結(jié)構(gòu)微結(jié)構(gòu) 策略策略3 生物過程生物過程 PLA支架（支架（灰色）灰色）+間充質(zhì)干細(xì)胞（間充質(zhì)干細(xì)胞（綠色）綠色）激光共聚焦顯微鏡照片激光共聚焦顯微鏡照片 培養(yǎng)培養(yǎng)6天天 培養(yǎng)培養(yǎng)10天天 4.組織工程相關(guān)生物材料組織工程相關(guān)生物材

10、料 組織工程相關(guān)的生物材料主要有兩種： 天然的材料：膠原 合成聚合物：開始于20世紀(jì)80年代中期 優(yōu)點(diǎn)： 1）生物相容性 2）可復(fù)制性 3）可生物降解 4）通過與多聚物結(jié)構(gòu)一體化來連續(xù)地輸送營養(yǎng)和激素 各種各樣的可生物降解材料已用作組織支架，各種各樣的可生物降解材料已用作組織支架， 包括陶瓷和多聚物。包括陶瓷和多聚物。 陶瓷主要用于骨組織工程，再次運(yùn)用了羥基磷陶瓷主要用于骨組織工程，再次運(yùn)用了羥基磷 灰石多孔配方以承載來源于骨膜或骨髓的骨祖細(xì)胞?；沂嗫着浞揭猿休d來源于骨膜或骨髓的骨祖細(xì)胞。 多聚物支架的典型形式多聚物支架的典型形式：纖維網(wǎng)、多孔海綿或泡纖維網(wǎng)、多孔海綿或泡 沫、或是水合凝膠。

11、在纖維網(wǎng)和泡沫中更常使用的沫、或是水合凝膠。在纖維網(wǎng)和泡沫中更常使用的 多聚物包括線形聚酯，例如，聚乙酸（多聚物包括線形聚酯，例如，聚乙酸（PGA）、）、 聚乳酸（聚乳酸（PLA）和聚已內(nèi)酯（）和聚已內(nèi)酯（PCL）；聚乙二醇）；聚乙二醇 （PEG）以及天然聚合物如膠原和透明質(zhì)酸。）以及天然聚合物如膠原和透明質(zhì)酸。 5.組織工程化皮膚及骨的應(yīng)用及展望 目前組織工程技術(shù)可應(yīng)用于復(fù)制各種組織，如肌肉、骨 骼、軟骨、腱、韌帶、人工血管和皮膚；生物人工器 官的開發(fā)，如人工胰臟、肝臟、腎臟等；人工血液的 開發(fā)；神經(jīng)假體和藥物傳輸?shù)确矫妗?一）組織工程化皮膚一）組織工程化皮膚 皮膚損傷主要是熱損傷，僅在美國

12、每年大約就有250 萬人燒傷，其他原因包括慢性潰瘍、創(chuàng)傷、皮膚腫瘤 切除或其他皮膚疾病。 傳統(tǒng)的修復(fù)方法有：自體植皮、同種異體植皮、異種 植皮和人工合成代用品的應(yīng)用。但存在供區(qū)不足、免 疫排斥及傳播疾病等缺點(diǎn)。 目前，一種生長因子和幾種皮膚替代物已經(jīng)投放市場， 作為治療難愈性潰瘍的二線選擇。 l皮膚的解剖生理學(xué) 皮膚依構(gòu)造可分為表皮、 真皮及皮下組織,如圖所 示。 表皮最主要的成分是角化 細(xì)胞，它們由細(xì)胞橋粒形 成互相結(jié)合的重疊結(jié)構(gòu)， 使得細(xì)胞與細(xì)胞互相粘連。 真皮的主要細(xì)胞是成纖維 細(xì)胞，產(chǎn)生和維持大部分 細(xì)胞外基質(zhì)。 顆粒層 棘層 基底層 （生發(fā)層） 乳頭層 網(wǎng)織層 角質(zhì)層 透明層 表皮

13、真皮 皮下組織 l組織工程皮膚 組織工程皮膚:由活性細(xì)胞接種在支架材料上形成的 組織工程化皮膚，有真皮層或同時(shí)具有真皮層和表皮層， 因此是一種活性生物敷料。 工程化皮膚結(jié)構(gòu)需要復(fù)制的關(guān)鍵特性有： 一種具有恰當(dāng)幫助真皮修復(fù)和支持表皮生長能力的真 皮或者間質(zhì)成分； 一層具有容易使創(chuàng)面達(dá)到生物覆蓋能力表皮； 一層可以使屏障特性快速重建的表皮； 一個(gè)準(zhǔn)許免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng)生長的環(huán)境； 一種能在結(jié)構(gòu)和附加功能（例如降低長期瘢痕形成和 色素重建）方面正?；慕M織。 組織工程皮膚的臨床應(yīng)用 組織工程皮膚是美國FDA批準(zhǔn)最早用于臨床的 產(chǎn)品。 第一代產(chǎn)品為單層上皮細(xì)胞移植，雖然愈合較快，但瘢 痕較多

14、，且易發(fā)生瘢痕攣縮。 第二代產(chǎn)品則研制成功了真皮層，成為具有雙層結(jié)構(gòu)的 新一代產(chǎn)品，其臨床效果也得到明顯改善。其代表產(chǎn)品 有Dermagraft-TM，Dermagraft-TC和Apligraff（TM）。 1.)表皮替代物表皮替代物和支持基質(zhì) 重建表皮重建表皮的方法:細(xì)胞懸液全層皮膚替代物。例如： 聚硅氧烷膜、活的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞 1975年，Rheiwald和Green等以3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層采用 共培養(yǎng)的方法培養(yǎng)出人類表皮角朊細(xì)胞獲得成功。 1981年，OConnor等首次應(yīng)用CEA法在體外培養(yǎng)出適 于移植的人自體表皮細(xì)胞膜片，表皮細(xì)胞膜片附著良好。 盡管CEA技術(shù)是大面積燒傷治療的一

15、大進(jìn)步，但單純 CEA移植技術(shù)存在一些缺點(diǎn)： 如耗時(shí)長； 細(xì)胞膜片菲薄易碎，難以操作； 移植到創(chuàng)面后，接受率低，極易造成移植物脫失； 即使在上皮化后，新生表皮不耐摩擦，容易發(fā)生水泡， 造成殘余創(chuàng)面。 2.)真皮替代物真皮替代物和支架材料 真皮替代物的研究是隨著CEA的發(fā)展而不斷引起人們的 關(guān)注的。 研究進(jìn)展：人尸體皮膚（發(fā)生免疫排斥反應(yīng)、引發(fā)潛 在感染的可能、移植物的來源以及原料質(zhì)量的差異性） 去細(xì)胞的真皮乳頭層深（部真皮和更表淺得乳頭層真 皮在結(jié)構(gòu)上存在不同）較深層的網(wǎng)狀真皮 組織工程已經(jīng)研究了通過使用支架和活細(xì)胞支架和活細(xì)胞來引起肉芽 組織形成的可能性。 1980年，Yannas和Burk

16、e制成一種人工真皮替代物，網(wǎng) 狀皮片的獲得率也提高到85%95%。 Integra Artificial Skin、Biobrane、Dermagraft 、 Dermagraft-TC等人工真皮人工真皮相繼產(chǎn)生。 3.)復(fù)合人工皮膚: 既含有表皮層表皮層又含有真皮層真皮層的組織工程化皮 膚 復(fù)合人工皮膚復(fù)合人工皮膚:用組織工程方法對(duì)所取小量皮膚組 織進(jìn)行消化、分離,表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分別培養(yǎng)和表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分別培養(yǎng)和 擴(kuò)增、達(dá)到一定細(xì)胞數(shù)量后重組成全層皮膚組織（包括擴(kuò)增、達(dá)到一定細(xì)胞數(shù)量后重組成全層皮膚組織（包括 表皮層及結(jié)締組織）。表皮層及結(jié)締組織）。 組織工程皮膚包括兩種活的細(xì)胞

17、成分：位于表 層的表皮細(xì)胞表皮細(xì)胞和位于真皮層的成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞，不僅具有正 常皮膚的部分功能，種植后不易變形，而且具有良好的 修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的作用。 Apligraft(又稱作Graftskin)是第一種商品化的既含有表皮 層又含有真皮層的組織工程化皮膚，這種由 Organogenesis公司注冊(cè)生產(chǎn)的產(chǎn)品已在加拿大和美國獲 準(zhǔn)用于臨床治療靜脈性潰瘍。 .組織工程皮膚展望 用組織工程皮膚移植物作為常規(guī)手段治療皮膚 創(chuàng)面已經(jīng)變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，有著極其巨大的社會(huì)和商 業(yè)價(jià)值以及廣闊的研究和臨床應(yīng)用前景。 現(xiàn)有的幾種組織工程化皮膚雖然在治療燒傷及 慢性潰瘍上取得了長足進(jìn)步，但對(duì)組織工程皮 膚的研究著重于

18、對(duì)表皮和真皮的研究，對(duì)毛囊 和皮脂腺的研究相對(duì)較少。 二）骨組織工程 目前骨組織工程的研究主要 包括： 種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)； 細(xì)胞種植基質(zhì)材料的研究 開發(fā)；組織培養(yǎng)中各種因 子的調(diào)控作用 骨主要由3部分構(gòu)成： 骨膜、骨質(zhì)、骨髓 松質(zhì)骨 骨膜 骨密質(zhì) 骨髓 1）種子細(xì)胞）種子細(xì)胞 來源：皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨、骨膜、骨髓、骨外組織 以及胚胎干細(xì)胞。 皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨、骨膜來源的成骨細(xì)胞能表達(dá)成 骨細(xì)胞表型且骨膜中含有較多的骨原細(xì)胞,而骨原 細(xì)胞具有分化潛能，可以分化為成骨細(xì)胞。但它 們的成骨細(xì)胞存在較多的缺陷,如取材困難、來源 有限、擴(kuò)增能力有限及免疫排斥等。 胚胎干細(xì)胞具有分化為三個(gè)胚層的能力，體外培

19、養(yǎng)后可分化為腸上皮細(xì)胞(內(nèi)胚層) 、軟骨、骨、 平滑肌、橫紋肌(中胚層) 及神經(jīng)細(xì)胞(外胚層) 等, 可以大量擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)為具體干細(xì)胞，但是存 在免疫排斥較強(qiáng)的缺陷。 2）細(xì)胞種植基質(zhì)）細(xì)胞種植基質(zhì) 作用： 種子細(xì)胞提供了粘附、增殖、分化的空間結(jié)構(gòu)和 生長模板 引導(dǎo)組織再生,控制組織或器官的性狀。 分類方法： 以形態(tài)分：纖維狀、海綿狀、凝膠狀等； 以來源分：天然生物材料和人工合成生物材料。 天然生物材料主要有膠原、膠原、脫鈣骨基質(zhì)及經(jīng)物理 化學(xué)高溫處理的動(dòng)物骨、纖維蛋白、硫酸軟骨素、 殼聚糖、藻酸鹽幾丁質(zhì)等。 人工合成生物材料可以分為人工合成無機(jī)材料無機(jī)材料和 人工合成可降解有機(jī)高分子材料可

20、降解有機(jī)高分子材料。 理想的支架材料具有的特征： 三維多孔的連接網(wǎng)絡(luò)，有利于細(xì)胞生長、養(yǎng)分傳 輸和代謝產(chǎn)物的排放； 生物相容性和可降解性好，降解速度和吸收速度 可以調(diào)控，以適應(yīng)細(xì)胞或組織在體內(nèi)體外的生長； 化學(xué)表面適合細(xì)胞的粘附、增殖和分化； 機(jī)械性能與所植入組織的要求相匹配。 仿生學(xué)材料就是近年發(fā)展的趨勢，RGD 序列或基因與支架整合后可提高細(xì)胞的粘 附與增生。 3）生長因子）生長因子 作用： 具有誘導(dǎo)和刺激細(xì)胞增殖，維持細(xì)胞存活等生物 效應(yīng)的蛋白類物質(zhì)； 促進(jìn)細(xì)胞增殖，組織或血管的修復(fù)和再生。 在骨創(chuàng)傷早期，生長因子主要啟動(dòng)成骨細(xì)胞活性， 促進(jìn)成骨，后期作用逐漸減弱，但也參與骨的生 長調(diào)節(jié)

21、。 髓基質(zhì)中含有多種生長因子：骨形態(tài)發(fā)生蛋白骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子、酸性成纖維生長因子、 類胰島素生長因子和、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因 子、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素-1等。 目前，用組織工程骨修復(fù)骨缺損的研究， 已從取材、體外培養(yǎng)、細(xì)胞到支架材料復(fù) 合體形成等都得到了成功。 例如：用自體骨髓、珊瑚和rhBMP-2復(fù)合 物修復(fù)兔下頜骨缺損，結(jié)果表明：術(shù)后3 個(gè)月，單獨(dú)珊瑚組及空白對(duì)照組缺損未完 全修復(fù)；珊瑚-骨髓組和珊瑚-rhBMP-2組 及單獨(dú)骨髓組已基本修復(fù)了缺損；而骨髓、 珊瑚和rhBMP-2復(fù)合物組在2個(gè)月時(shí)缺損 即可得到修復(fù)。 帶血管蒂的骨組織工程：將骨細(xì)胞種植于 預(yù)制帶管蒂的生物支架材料上，將它作為 一種細(xì)胞傳送裝置。 組織工程骨的構(gòu)建分為：體內(nèi)構(gòu)建和體外構(gòu) 建兩種形式。 體內(nèi)構(gòu)建：將成骨細(xì)胞-支架復(fù)合物植入體內(nèi)， 修復(fù)骨缺損。 體外構(gòu)建：通過體外組織培養(yǎng)的方法應(yīng)用水 降解支架材料，接種成骨細(xì)胞，構(gòu)建骨組