酶活性的測定

1、過氧化物酶過氧化物酶( () )活性的測定活性的測定 愈創(chuàng)木酚法愈創(chuàng)木酚法 一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 過氧化物酶催化過氧化氫氧化酚類的反過氧化物酶催化過氧化氫氧化酚類的反 應(yīng)，產(chǎn)物為醌類化合物。應(yīng)，產(chǎn)物為醌類化合物。 實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚為過氧化物酶的底物。實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚為過氧化物酶的底物。 在此酶存在下，在此酶存在下，H H2 2O O2 2 將愈創(chuàng)木酚氧化生成將愈創(chuàng)木酚氧化生成 茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470nm 470nm 有最大光吸有最大光吸 收，故可通過收，故可通過470nm470nm處的吸光度變化測定過處的吸光度變化測定過 氧化物酶的活性。氧化物酶的活性。 二、材料和設(shè)備

2、二、材料和設(shè)備 、材料、材料 ：馬鈴薯塊莖：馬鈴薯塊莖 、儀器設(shè)備：、儀器設(shè)備：751 751 型分光光度計(jì)、離心機(jī)、研型分光光度計(jì)、離心機(jī)、研 缽、缽、25ml 25ml 容量瓶、量筒、試管、吸量管。容量瓶、量筒、試管、吸量管。 、試劑：、試劑：0.05ml/L0.05ml/L愈創(chuàng)木酚溶液，愈創(chuàng)木酚溶液， 0.05ml/L0.05ml/L的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液(pH5.5)(pH5.5)， 2%H 2%H2 2O O2 2，0.1mol/L0.1mol/L兒茶酚溶液，兒茶酚溶液， 20%20%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液 三、實(shí)驗(yàn)步驟三、實(shí)驗(yàn)步驟 、酶液的制備、酶液的制備 取取5.0g5.0g

3、洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放 入研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻入研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻 漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于3000g3000g 水中離心水中離心10min10min，上清液轉(zhuǎn)入，上清液轉(zhuǎn)入25ml 25ml 容量瓶容量瓶 中。沉淀用中。沉淀用5ml5ml磷酸緩沖液再提取次，上磷酸緩沖液再提取次，上 清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下 保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?、過氧化物酶活性的測定、過氧化物酶活性的測定 酶活性測定的反應(yīng)體系包括酶活性測定的反應(yīng)體系包括:2.9ml :

4、2.9ml 0.05mol/L0.05mol/L磷酸緩沖液、磷酸緩沖液、1.0ml 2%H1.0ml 2%H2 2O O2 2、 1.0ml 0.05mol/L 1.0ml 0.05mol/L 愈創(chuàng)木酚和愈創(chuàng)木酚和0.1ml0.1ml酶液。酶液。 以在沸水中加熱以在沸水中加熱5min5min的酶液為對的酶液為對 照，做二組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系加入酶液照，做二組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系加入酶液 后，立即于后，立即于3737水浴中保溫水浴中保溫15min15min，然后迅，然后迅 速轉(zhuǎn)入冰浴中，并加入速轉(zhuǎn)入冰浴中，并加入2.0ml 20%2.0ml 20%三氯乙三氯乙 酸終止反應(yīng)。然后，過濾酸終止反應(yīng)。然

5、后，過濾( (或或5000g 5000g 離心離心 10min),10min),濾液適當(dāng)稀釋，用濾液適當(dāng)稀釋，用751751型分光光度型分光光度 計(jì)在計(jì)在470nm470nm波長下測定反應(yīng)體系的吸光度。波長下測定反應(yīng)體系的吸光度。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以每以每minmin內(nèi)內(nèi)A A470 470變化 變化0.010.01為為1 1個過氧化物酶活力個過氧化物酶活力 單位單位 酶活力酶活力=D D 酶的比活力酶的比活力=D D 式中，式中， A A為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W W為馬鈴為馬鈴 薯鮮重（薯鮮重（g g）；）；t t為反應(yīng)時間（為反應(yīng)時間（minmin）

6、；）；D D為稀釋倍數(shù)，為稀釋倍數(shù)， 即提取的總酶液為反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)酶液的倍數(shù)即提取的總酶液為反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)酶液的倍數(shù) A 0.01t A 0.01Wt CATCAT過氧化氫酶活性測定方法過氧化氫酶活性測定方法 過氧化氫酶過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)(Hydrogen Peroxidase) 又名觸酶又名觸酶(Catalase(Catalase，CAT)CAT)，是一類以鐵卟，是一類以鐵卟 琳為輔基的結(jié)合酶，由琳為輔基的結(jié)合酶，由4 4個亞基組成，分子個亞基組成，分子 量為量為240 000240 000。存在于動植物組織與細(xì)胞中。存在于動植物組織與細(xì)胞中 的氧化還原酶類，它專

7、一性地將細(xì)胞代謝的氧化還原酶類，它專一性地將細(xì)胞代謝 產(chǎn)生的過氧化氫分解成產(chǎn)生的過氧化氫分解成H H2 2O O和和0 02 2，避免了，避免了H H2 20 02 2 在體內(nèi)積累，從而可維持體內(nèi)正常的活性在體內(nèi)積累，從而可維持體內(nèi)正常的活性 氧水平。是最早發(fā)現(xiàn)的與種子活力有關(guān)的氧水平。是最早發(fā)現(xiàn)的與種子活力有關(guān)的 氧化酶類之一氧化酶類之一. . 過氧化氫酶的應(yīng)用：過氧化氫酶的應(yīng)用： 被用于食品包裝，防止食物被氧化。被用于食品包裝，防止食物被氧化。 在紡織工業(yè)中，被用于除去紡織物上的過氧化氫，以保證成品是不含在紡織工業(yè)中，被用于除去紡織物上的過氧化氫，以保證成品是不含 過氧化物的。過氧化物的。

8、 它還被用在它還被用在隱形眼鏡隱形眼鏡的清潔上：眼鏡在含有過氧化氫的清潔劑中浸泡的清潔上：眼鏡在含有過氧化氫的清潔劑中浸泡 后，使用前再用過氧化氫酶除去殘留的過氧化氫。后，使用前再用過氧化氫酶除去殘留的過氧化氫。 近年來，過氧化氫酶開始使用在美容業(yè)中。一些面部護(hù)理中加入了該近年來，過氧化氫酶開始使用在美容業(yè)中。一些面部護(hù)理中加入了該 酶和過氧化氫，目的是增加酶和過氧化氫，目的是增加表皮表皮上層的細(xì)胞氧量。上層的細(xì)胞氧量。 植物細(xì)胞中的過氧化物酶體參與了植物細(xì)胞中的過氧化物酶體參與了光呼吸光呼吸（利用氧氣并生成（利用氧氣并生成二氧化碳二氧化碳） 和共生性氮固定（將和共生性氮固定（將氮?dú)獾獨(dú)?N2

9、(N2）解離為活性氮原子）。細(xì)胞被）解離為活性氮原子）。細(xì)胞被病原體病原體 感染時，過氧化氫可以被用作一種有效的抗感染時，過氧化氫可以被用作一種有效的抗微生物微生物試劑。試劑。 其活性也與糧食品質(zhì)之間有一定的相關(guān)性，是一項(xiàng)衡量谷物品質(zhì)的其活性也與糧食品質(zhì)之間有一定的相關(guān)性，是一項(xiàng)衡量谷物品質(zhì)的 重要指標(biāo)。重要指標(biāo)。 過氧化氫酶的測定： 化學(xué)測定法：高錳酸鉀滴定法，碘量法。 光度法：紫外分光光度法，熒光分析法，化學(xué)發(fā)光法。 電化學(xué)法：極譜氧電極法，電流測定法，電泳一染色法。 放射化學(xué)測定法。 簡易氣量測定法。 高錳酸鉀滴定法： 過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過 氧化氫分解為

10、水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過 氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。 據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。 在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反 應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2 。 即可求出消耗的H2O2的量。 酶活性用每克鮮重樣品酶活性用每克鮮重樣品1min1min內(nèi)分解內(nèi)分解H H2 2O O2 2的毫克數(shù)的毫克數(shù) 表示：表示： 酶活酶活(mgH(mgH2 2O O2 2/gFWmin)=/gFWmin)= 式中式中 A A對照對照KMnOKMnO4 4滴定毫升數(shù)；滴定毫升數(shù)； B B酶反應(yīng)后酶反應(yīng)后KMnOK

11、MnO4 4滴定毫升數(shù)；滴定毫升數(shù)； V VT T酶液總量（酶液總量（mlml）；）； V V1 1反應(yīng)所用酶液量（反應(yīng)所用酶液量（mlml）; ; W W樣品鮮重（樣品鮮重（g g）；）； 1.71ml 0.1mol/L 1.71ml 0.1mol/L的的KMnOKMnO4 4相當(dāng)于相當(dāng)于 1.7mg H1.7mg H2 2O O2 2。 紫外分光光度法紫外分光光度法: : H H2 2O O2 2在在240nm240nm波長下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化波長下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化 氫，使反應(yīng)溶液吸光度氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A(A240 240) )隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)

12、測 隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)測 量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。 以以1min1min內(nèi)內(nèi)A A240 240減少 減少0.10.1的酶量為的酶量為1 1個酶活單位（個酶活單位（u u）。）。 過氧化氫酶活性過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=(u/gFW/min)= 式中式中 A A240 240 = A = AS0 S0 A AS0 S0 加入煮死酶液的對照管吸光值；加入煮死酶液的對照管吸光值； A AS1 S1, A , AS2 S2 樣品管吸光值；樣品管吸光值； Vt Vt粗酶提取液總體積（粗酶提取液總體積（mlml）；）； V

13、V1 1測定用粗酶液體積（測定用粗酶液體積（mlml）；）； FW FW樣品鮮重（樣品鮮重（g g）；）； 0.1A 0.1A240 240每下降 每下降0.10.1為為1 1個酶活單位（個酶活單位（u u）；）； t t加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間（加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間（minmin）。）。 方法比較：方法比較： 研究認(rèn)為，化學(xué)滴定法重復(fù)性差、緊密度 低、操作繁瑣、檢測線低，不適于大批量 的樣品測定。其優(yōu)點(diǎn)是不需要任何特殊的 儀器，適用性比較廣泛。 紫外分光光度法具有重現(xiàn)性好，操作簡單、 快速、檢測線相對較低得到優(yōu)點(diǎn)。但是對 于測定底物或產(chǎn)物改變量方面不太準(zhǔn)確。 總結(jié)： 綜上所述，過

14、氧化氫酶活性測定的方法大都基于 過氧化氫酶催化過氧化氫的分解反應(yīng)：根據(jù)反應(yīng) 生成的氧氣的量、反應(yīng)剩余的過氧化氫的量或根 據(jù)反應(yīng)時的電子的轉(zhuǎn)移及電流的變化等。同時， 影響測定結(jié)果的因素很多，如過氧化氫的濃度、 酸度、溫度及重金屬的含量等；并且各種方法的 準(zhǔn)確性和靈敏度也有一定差異。因此，在測定CAT 活性時，應(yīng)該根據(jù)具體組織種類及測量要求選擇 適合的測定的方法。 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定 在茶葉中 實(shí)驗(yàn)原理 APX（抗壞血酸過氧化物酶）催化AsA與 H2O2反應(yīng)而使H2O2:2AsA+ H2O22MD-AsA( 單脫氫 抗壞血酸)+2H2O?？箟难徇^氧化物酶是以抗壞 血酸為電子供體

15、的，APX首先與H2O2形成中間復(fù)合 物，中間復(fù)合物接著氧化AsA形成產(chǎn)物，當(dāng)AsA未 被復(fù)合物利用時，APX失活。只要AsA能夠再生， APX就能充分進(jìn)行催化反應(yīng)，從而保護(hù)葉綠體維持 正常的光合能力。 APX酶液的制備 稱取0.5g的茶樹鮮葉剪碎，加 入適量的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液， 在冰浴中充分研磨，離心（10000g、4、 20min）取上層清夜1mL，分裝于小離心管 中置于4備用或-20保存。 APX活性的測定 提取液：50mmol/LPBS（磷酸氫二鉀-磷酸二氫 鉀緩沖液），pH7.8；2mmol/L AsA；5mmol/L EDTA。 反應(yīng)液：50mmol/LPBS，

16、pH7.0；0.5mmol/L AsA；0.1 mmol/L EDTA。 在三個比色皿中各加入20L鮮葉APX粗酶液， 再加入3mL反應(yīng)液；1號比色皿中不加AsA和H2O2 啟動反應(yīng)；每10s連續(xù)記錄室溫下290nm吸光值 的變化X。室溫下每一分鐘氧化1molAsA的酶 量作為一個酶活性單位（U）。 計(jì)算公式計(jì)算公式 每克鮮葉每克鮮葉APXAPX的酶活性的酶活性U=U= （X X7.57.510001000606010001000）/ / （m m2.82.820201010） 上式中，上式中，X X：ODOD值的變化；值的變化；7.57.5：每克材料：每克材料 提取提取7.5mL7.5mL粗

17、酶液；粗酶液；10001000：將：將mlml轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化成LL； 6060：將：將1min1min轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化成60s60s；10001000：將：將mmolmmol轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 成成molmol；m m：鮮葉的重量，單位為：鮮葉的重量，單位為g g；2.82.8： 吸光系數(shù)吸光系數(shù)mmol/L cmmmol/L cm；2020：用：用20L20L酶液進(jìn)行酶液進(jìn)行 活性測定；活性測定；1010：每：每10s10s記錄吸光值的變化。記錄吸光值的變化。 測定茶樹鮮葉測定茶樹鮮葉APXAPX活性的最佳條件活性的最佳條件 PVPP PVPP的加入量為鮮葉重的的加入量為鮮葉重的1.51.5倍，提取液倍，提取液

18、 pHpH為為7.87.8，反應(yīng)液，反應(yīng)液pHpH為為7.07.0，底物，底物AsAAsA濃度為濃度為 0.5mmol/L0.5mmol/L。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： （1 1）由于測定反應(yīng)是通過測定反應(yīng)底物）由于測定反應(yīng)是通過測定反應(yīng)底物AsAAsA的降的降 低來計(jì)算低來計(jì)算APXAPX活性，因此所加的酶量一般不宜過大活性，因此所加的酶量一般不宜過大 ，應(yīng)使加液量控制在，應(yīng)使加液量控制在60s60s內(nèi)，使產(chǎn)生的內(nèi)，使產(chǎn)生的A A290 290光值下 光值下 降呈良好的線性關(guān)系。降呈良好的線性關(guān)系。 （2 2）由于此反應(yīng)中）由于此反應(yīng)中AsAAsA和和H H2 2O O2 2量都很少，可以將量都

19、很少，可以將 30%30%的的H H2 2O O2 2稀釋稀釋500500倍，在測定時直接吸取倍，在測定時直接吸取15L15L的的 H H2 2O O2 2與與3mL3mL反應(yīng)液將加入到比色皿中，啟動反應(yīng)。反應(yīng)液將加入到比色皿中，啟動反應(yīng)。 （3 3）H H2 2O O2 2由于本身對由于本身對AsAAsA的氧化作用在測定時間的氧化作用在測定時間 內(nèi)可以忽略不計(jì)。內(nèi)可以忽略不計(jì)。 超氧化物歧化酶（SOD）的活性測定 黃嘌呤氧化酶法黃嘌呤氧化酶法 原理:通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn) 生超氧陰離子自由基（生超氧陰離子自由基（O O2 2- -），后者氧化羥胺

20、形成），后者氧化羥胺形成 亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，用可見亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，用可見 光分光光度計(jì)測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含光分光光度計(jì)測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含SODSOD時時 ，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用， 使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度 值低于對照管的吸光度值，通過公式計(jì)算可求出值低于對照管的吸光度值，通過公式計(jì)算可求出 被測樣品中的被測樣品中的SODSOD活力。活力。 實(shí)驗(yàn)試劑： 硫酸鹽緩沖液，鹽酸羥胺，黃嘌呤，黃嘌 呤氧化酶，醋酸等。 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟

21、： 計(jì)算方法： 每毫升反應(yīng)液中每毫升反應(yīng)液中SOD SOD 抑止率達(dá)抑止率達(dá)5050時對應(yīng)時對應(yīng) 的的SOD SOD 量為一個量為一個SOD SOD 活力單位（活力單位（U U），待測），待測 樣品中的樣品中的SOD SOD 活力由下式計(jì)算：活力由下式計(jì)算： SODSOD抑制率（）（抑制率（）（A2-A1A2-A1）/A2/A2100% 100% SOD SOD 活力（活力（U/mlU/ml）（）（A2-A1A2-A1） /A2/A2100%100%5050反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù) 樣本測試前的稀釋倍數(shù)樣本測試前的稀釋倍數(shù) 式中：式中：A1:A1:測定管的吸光值；測定管的吸光值；A

22、2:A2:空白管的空白管的 吸光值。吸光值。 鄰苯三酚自氧化法鄰苯三酚自氧化法 原理：原理： 在堿性條件下在堿性條件下, , 鄰苯三酚迅速氧鄰苯三酚迅速氧 化釋放出超氧化物陰離子，生成有色中間化釋放出超氧化物陰離子，生成有色中間 產(chǎn)物，吸光度隨之增加，使吸光度值與反產(chǎn)物，吸光度隨之增加，使吸光度值與反 應(yīng)時間呈良好的線性關(guān)系。應(yīng)時間呈良好的線性關(guān)系。 SOD SOD 加入鄰苯加入鄰苯 三酚自氧化反應(yīng)體系后，催化超氧化物陰三酚自氧化反應(yīng)體系后，催化超氧化物陰 離子生成過氧化氫，使有色中間產(chǎn)物的生離子生成過氧化氫，使有色中間產(chǎn)物的生 成受阻，導(dǎo)致吸光值下降，鄰苯三酚自氧成受阻，導(dǎo)致吸光值下降，鄰苯三酚自氧 化速率降低，可作為測定化速率降低，可作為測定 SOD SOD 活性的理論活性的理論 依據(jù)。依據(jù)。 1.1.試劑試劑： 0.1mol/L Tris-HCl 0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液緩沖液 (pH8.2(pH8.2內(nèi)含內(nèi)含 2mmol/L EDTA) 2mmol/L EDTA)0.2mol/L 0.2mol/L （TrisTris）三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷( (內(nèi)含內(nèi)含 4mmol/L 4mmol/L 乙二胺四乙乙二胺四乙酸酸EDTA EDTA )100ml