鴨疫里默氏桿菌不同分離株生化特性及胞外蛋白酶的檢測

1、圖3 外來苗進(jìn)入川渝地區(qū)情況 注 ：1進(jìn) 苗 量 數(shù) 據(jù) 主要是成都火車 站和重慶火車站的數(shù)據(jù) ；2西 南 均 價 為 西南分公司均價 ；3外 來苗主要來自廣 東 、廣 西 、河南和山西等地 圖4 川渝地區(qū)雞苗流向圖 鴨疫里默氏桿菌不同分離株生化特性及胞外蛋白酶的檢測唐 妤李 繼 祥高 繼 業(yè)丁 孟 建 汪 敏(西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系 ，重 慶榮 昌402460)中 圖 分 類 號 ：s858.32文 獻(xiàn) 標(biāo) 識 碼 ：a文 章 編 號 ：1008-0414(2009)04-0006-03摘 要 研 究 測 定 了29株鴨疫里默氏桿菌不同分離株的生化指標(biāo) ，并 采 用底 物 平 板 法 、

2、底 物-page法檢測了鴨疫里默氏桿菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生情況 。 結(jié) 果 顯 示 ，所有分離株接觸酶陽性 ，硝酸鹽還原試驗 、m.r和v.p試 驗 、尿 素 酶 、精 氨 酸 酶 陰 性 ， 大部分菌株不發(fā)酵碳水化合物 ， 能緩慢液化明膠 ， 明 膠 液 化 陽 性 率 為89.7%（26/29）。 底物平板法和底物-page法 檢 測 發(fā) 現(xiàn) ，89.7%（26/29）的 鴨 疫 里 默 氏桿菌分離株能產(chǎn)生降解明膠和脫脂奶蛋白的胞外蛋白酶 ， 且 該 酶 類 活 性 可 被 edta抑 制 。關(guān) 鍵 詞 鴨疫里默氏桿 菌 生化特性 胞外蛋白酶 川渝地區(qū)的雞苗動向 4受 川渝地區(qū)肉雞養(yǎng)殖習(xí)慣影響

3、 ，川渝地區(qū)散養(yǎng)戶養(yǎng)殖的 基 本 都 是 鑒 別 后 的 公 苗 ， 鑒 別 率 一 般 都 要 在 90%以 上 。 母 苗 基 本 不 養(yǎng) ，混合苗也只是在局 部地區(qū)用來養(yǎng)殖脫溫雞 。detection of extracellular proteases of riemerellaanatipestifertang yu，li ji-xiang，gao ji-ye，ding meng-jian，wang min (department of veterinary medicine，southwest university rongchang campus， chongqing 40246

4、0，china)abstract: biochemical characters were detected in 29 riemerella anatipestiferisolates.the activity of extracellular proteases was analyzed by using the substrate plate process and substrate -page. the results showed that all of isolates could secrete catalase,but nitrate reduction test, m.r

5、and v.p test, urease and arginase was negative. most of isolates could not utilize carbohydrate. 26/29 （89.7%）strains could liquate gelatin and were positive in detection of extracellular proteases by usage of substrate plate process and substrate -page. in addition, the extracellular proteasescould

6、 be inhibited by metalloprotease inhibitor.key words: riemerella anatipestifer；biochemical character；extracellular proteases5綜 合 分 析在 經(jīng) 過 了2008年 整 年 低 迷 行 情 的洗 禮 和 12月 份突發(fā)疫情的打擊后 ，各地區(qū)種雞養(yǎng)殖進(jìn)入了 又 一 個 平 穩(wěn) 發(fā)展 階 段 ， 各種雞養(yǎng)殖企 業(yè) 都 逐 漸 放 慢 了 發(fā) 展 的 腳 步 。 各 肉 雞 養(yǎng) 殖 區(qū) 域 的 養(yǎng) 戶 ， 經(jīng) 過 了20072008年 成 雞 行 情 大 起大落的折磨后也逐 漸

7、 回 歸 理 性 ， 開 始重視對后期行情的預(yù)測 ， 不 再 盲 目 跟 風(fēng) 。 綜合各方面的信息 ，今 后 一 段 時 間養(yǎng)雞行業(yè)會呈現(xiàn)出以下一些現(xiàn)象 ：5.1 西南地區(qū)種雞養(yǎng)殖 方 面 ， 受 5.12 大地震和對經(jīng)融危機(jī) 擔(dān) 憂 的 影 響 ， 各 種雞養(yǎng)殖企業(yè) 針 對 2009年 上 、 下 半 年 的種雞引種數(shù)量 都 有 所 減 少 ， 預(yù) 計 第 二季度開產(chǎn)種 雞 數(shù) 量 較 2008年 同 期 將 下 降36.5%左 右 。5.2 雞 苗 方 面 ，受其他地區(qū)突發(fā)疫情 的 影 響 ，今 后34個 月 的 時 間 從 其 他 地 區(qū)進(jìn)入西南地區(qū) 的種蛋量和雞苗量都 將 減 少 很

8、多 ， 這 個因素的存在既是西 南 地 區(qū)12月 份 雞苗緊缺苗價高漲的 鴨 疫 里 默 氏 桿 菌 (riemerellaanatipestifer，ra) 病 ， 又 稱 為 鴨 傳 染 性 漿 膜 炎 、新 鴨 病 、鴨 敗 血 癥 、鴨 疫 綜 合征 。 它是由鴨疫里默氏 桿 菌 引 起 的 侵害 家 鴨 、火雞及多種禽類 的 接 觸 性 、急 性 或 慢 性 、敗 血 性 傳 染 病 。 由 于 本 病 的 高 發(fā) 病 率 、高 死 亡 率 、高 淘 汰 率 ， 使 其 成為當(dāng)前國內(nèi)外養(yǎng)鴨業(yè) 面 臨 的 嚴(yán) 重 問收 稿 日 期 ：20090305作 者 簡 介 ：唐 妤 （1981

9、-），女 ，在 讀 碩 士 重 要 原 因 ， 同 時 也是今年上半年苗雞 行情遠(yuǎn)比去年年 底最樂觀的預(yù)測還樂 觀 的 主 要 原 因 。5.3 進(jìn) 入 第 二 季 度 ，西南地區(qū)種雞開 產(chǎn)量和進(jìn)入產(chǎn)蛋 高峰的種雞數(shù)量都將 大 量 增 加 ，因 此4、5月份的出苗量也會 大 增 ， 雞 苗 價 格 預(yù)計會慢慢回落到正 常 水 平 （青 腳 麻 混 苗1.51.8元/羽 ）。5.4 由 于 經(jīng) 歷 了 2008 年 長 期 虧 損 的 折 磨 ， 一 部 分 社 會散養(yǎng)戶退出養(yǎng)殖行 業(yè)導(dǎo)致社會散養(yǎng) 量 減 少 ， 同 時 由 于 擔(dān)心成雞價格的不 確 定 性 的 擔(dān) 心 ， 很 多 社會散養(yǎng)戶對

10、于 高價苗基本會用觀望 態(tài) 度 理 性 對 待 ， 不 再 會 再 象07年 那 樣 盲 目 跟 風(fēng) 。社會散養(yǎng)戶處于分 散 風(fēng) 險 的 目5.5的 ， 部 分 地 區(qū) 又 有向脫溫雞市場過渡 的 趨 勢 ，集 中 育 雛710 d或1個 月 后 分 賣 給 千 家 萬 戶 ， 同時把市場風(fēng)險也分 攤 給 千 家 萬 戶 。圖1 底 物page法 檢 測ecpase(1 -9 分 別 表 示 ra 菌 株 af、dy、bsy、gra、lc、p0、517、my、bj)題。胞外蛋白酶（extracellular proteases，ecpase）是細(xì)菌的一種重要致病因子1,2。目 前, 對 氣 單

11、 胞 菌 、假 單 胞 菌 等 的 胞 外 蛋白酶已有較深入研究 , 但 鴨 疫 里 默 氏桿菌是否分泌胞外蛋白酶 , 還 未 見 報 道 。 本試驗利用底物 平 板 法 、底 物- page 法 對 29 株 鴨 疫 里默氏桿菌不同 分 離 株 生 化 特性和胞外蛋白酶進(jìn)行檢 測 ，探 討 其 是 否分泌胞外蛋白酶 ，為 進(jìn) 一 步 研 究 鴨 疫里默氏桿菌的致病機(jī)理 奠 定 基 礎(chǔ) 。1.4.2 蛋 黃 平 板 法 ：參 照 文 獻(xiàn) 方 法6，將ra純培養(yǎng)物點種于蛋黃平板 ，ecpase加入打孔的相同平板中 ，37孵 育 1824 h， 在平板上菌落或孔周圍出現(xiàn)白 色 沉 淀 帶 者 ，則

12、 磷 脂 酶 陽 性 。1.4.3 脫 脂 奶 瓊 脂 平 板 法 ：參 照 文 獻(xiàn) 方 法 7， 將 ra 純培養(yǎng)物點種于脫脂 奶 瓊 脂 平 板 ，ecpase 加 入 打 孔 的 相 同 平 板表1 底物平板法檢測ecpase結(jié) 果營 養(yǎng) 明 膠蛋 黃脫 脂 奶 瓊菌 株平 板 法平 板 法脂 平 板 法afbsy p0p1hndj rl(r) gra my dy dyh517060427tz bsy2bj j2061029lc fl0506140504309hk dc jmy gh10ra1ra2ra4+-+-+-+-+-+-+-+中 ，37孵 育 1824 h，在 平 板 上 菌 落

13、或 孔 周 圍 出 現(xiàn)透明溶蛋白圈者 ， 判 為陽 性 。1.4.4 底 物-page法 ：參 照 文 獻(xiàn) 方 法8， 將 0.1% 明膠直接加入丙 烯 酰 胺 中 聚 合 ， 然 后 加 入 培 養(yǎng) 的 ra上 清 液 ， 4 進(jìn) 行 電 泳 ， 用 2.5% 的 triton x-100 浸 泡 30 min/次 ，2次 ，再 加 入 50 mm tris- hcl 緩 沖 液 (1 mmca2+,ph7.8) 置 于 37 作 用18 h，考馬斯亮藍(lán)染色 ，觀 察 無 色 清晰條帶的情況 。1.5 金屬蛋白酶抑制劑 edta 對 ra胞外蛋白酶的影響 分別于不同底物的平板中加入20 mm

14、 edta， 將 與 0.5 m edta 37 作 用30 min后 的 ecpase加入打孔的底物平 板 中 ，37孵 育24 h，觀 察 結(jié) 果 。1材 料 與 方 法菌 株鴨 疫 里 默 氏 桿 菌29株 由 西 南 大 學(xué) 榮 昌 校 區(qū) 獸醫(yī)生物學(xué)實驗室鑒定 、 保 存 3,4， 將 上述菌種經(jīng)巧克力培養(yǎng)基純 化 培 養(yǎng) ，挑 取 單 菌 落 ，供 檢 測 用 。1.11.2細(xì)菌生化特性測定 蔗 糖 、甘 露 糖 、阿 拉 伯 糖 、尿 素 酶 、果 糖 、乳 糖 、半 乳 糖 、麥 芽 糖 、 海 藻 糖 、赤 蘚 糖 、衛(wèi) 茅 醇 、山梨醇等均采用微量 生 化 管 發(fā) 酵 法

15、， 生化管購自杭州天和 微 生 物 試 劑 有 限 公 司 ； 明 膠 液 化 試 驗 按傳統(tǒng)明膠穿刺法進(jìn)行 。1.3 ra胞外蛋白酶的制備 ra純培養(yǎng)物接種于 lb肉 湯 ，37振 蕩 培 養(yǎng)24 h，離 心 ，上清液經(jīng)超濾濃 ra5 + - + 結(jié) 果2注 ：+表 示 陽 性 ，-表 示 陰 性生 化 特 性純化細(xì)菌的生化鑒定 結(jié) 果 表 明 ， 所 有 分 離 株 接 觸 酶 陽 性 ， 硝 酸 鹽 還 原 試 驗 、m.r和 v.p試 驗 、尿 素 酶 、精 氨 酸 酶 、賴 氨 酸 酶 陰 性 ，不 發(fā) 酵 葡 萄 糖 （1株 除 外 ）、果 糖 、乳 糖 、半 乳 糖 、麥 芽 糖

16、 、蔗 糖 、 甘 露 糖 、 阿 拉 伯 糖 、 海 藻 糖 、 赤 蘚 糖 、衛(wèi) 茅 醇 、山 梨 醇 ， 有 26 株 細(xì) 菌 能 緩 慢 液 化 明 膠 ，明 膠 液 化 陽 性 率 為 89.7%（26/29）。2.2 平 板 法 檢 測ecpase用不同平板法檢測 29 株 ra 純 培2.1明 的 亮 帶 ，陰性菌株則無此條帶 （如 圖1）?？s 、丙 酮 沉 淀 、tris-hcl緩 沖 液 溶 解 、過濾除菌后保存?zhèn)溆?，記 為ecpase。胞外蛋白酶的檢測 1.41.4.1 營 養(yǎng) 明 膠 平 板 法 ： 按 frazier法 5制 備 營 養(yǎng) 明 膠 平 板 ，將 ra純

17、培 養(yǎng) 物 點 種于營養(yǎng)明膠平板 ，ecpase 加 入 打 孔 的 相 同 平 板 中 ，37孵 育 24 h，取 出 平 板 滴 加 23 ml顯 色 劑 （酸 性 氯 化 汞 ）， 平 板 上 菌 落 或孔周圍出現(xiàn)清晰透明圈 者 ，判 為 陽 性 。養(yǎng) 物 及 其 ecpase，結(jié)果顯示菌體和 5.6 由于社會散戶在 12 月 投 放 成ecpase試 驗 結(jié) 果 一 致 。 29株ra純 培 養(yǎng)物 及 其 ecpase 用營養(yǎng)明膠平板法 、 脫 脂奶瓊脂平板法檢測均為 26 株 陽 性（陽 性 率 為89.7%），蛋 黃 平 板 法 檢 測 全部 為 陰 性 （見 表1）。2.3 底

18、物-page法 檢 測ecpase底 物 -page 法 檢 測 ra 不 同 菌 株 培 養(yǎng) 后 上 清 液 ， 結(jié)果與營養(yǎng)明膠平板 法 一 致 ， 營 養(yǎng)明膠平板法檢測呈陽性 的 菌 株 ， 用 底 物-page法 檢 測 形 成 透雞 市 場 的 苗 量 較 少 ，同 時 由 于 2 月 份脫 溫 雞 市 場行情的高價位運行 ， 一 些一體化養(yǎng)殖企業(yè)和散戶把均重在 0.40.5 kg/只的存欄肉雞直接 當(dāng) 脫 溫 雞 賣 掉 ， 導(dǎo) 致45月份成批出欄的大雞數(shù) 量 將 減 少 很 多 。2.4金 屬 蛋 白 酶 抑 制 劑 edta 對ecpase的 影 響將 ecpase 與 金 屬

19、蛋 白 酶 抑 制 劑edta作 用 后 ，加入含抑制劑的底物平 5.7考 慮 到 當(dāng) 前 經(jīng)融危機(jī)對民眾消 板 中 ，37孵 育 后 ， 結(jié) 果 顯 示 edta能抑 制 ra ecpase降 解 明 膠 和 脫 脂 奶 蛋 白 的 能 力 （如 圖2）。費 能 力 的 影 響 ， 預(yù) 計46月 份 的 成 雞應(yīng) 該 有 一 定 的 利 潤 空 間 ， 但 利 潤 空 間 不 會 太 大 。圖2 edta抑 制ecpase活 性 a：edta 作 用 后 明 膠 平 板 法 檢 測 ecpase；b： 明膠平板法檢測 ecpase； c：edta 作 用 后脫脂奶平板法檢測 ecpase；d

20、：脫脂奶平板法檢測ecpase研 究 ， 對 其 的 檢 測 有助于判斷所分離 菌株是否具有致病性 。 細(xì) 菌 胞 外 蛋 白 酶的檢測方法很多 ， 最常見有底物平 板 法 、 底 物 -page 法 、 底 物 法 、dot- elisa等 。 底物平板法和底物法方便 、 快 速 ， 但 主 觀 性 強(qiáng) 、 特 異 性 低 ；dot- elisa特異性與敏感性強(qiáng)于平板 法 和 底 物 法 ，但 較 之 復(fù) 雜 ；底 物-page法 簡 便 、快 速 、敏 感 ，并 且 適用于定性檢測 。 本研究結(jié)合底物平 板 法 和 底 物 -page 法 檢 測ra胞 外 蛋 白 酶 ，結(jié) 果 顯 示 2

21、9株 ra 中 ， 明 膠 平 板 法 、 脫脂奶瓊脂平板 法 檢 測 均 為26株 陽 性 ， 蛋 黃 平 板 法 檢 測 全 部 為 陰 性 。提示在本研究中89.7%（26/29） 的 ra 菌株能分泌胞 外 蛋 白 酶 ， 而且該胞外蛋 白酶中可能含有能 icrobiol，1995（3）：4054073 李 繼 祥 ， 徐 剛 ， 王 孝 友 ， 等 . 重 慶 地 區(qū) 鴨 傳染性漿膜炎病原分離鑒定 . 中 國 預(yù) 防 獸 醫(yī) 學(xué) 報. 2000(6)：4204224 李 繼 祥 ， 黃 偉 ， 高 繼 業(yè) ， 等 . 西 南 地 區(qū) 鴨 傳染性漿膜炎病 原流行病學(xué)研究 . 中 國 畜

22、 牧獸醫(yī)學(xué)會傳染病學(xué)分會成立 20周 年 慶 典 暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集 ，20035 frazier, w. c. a method for the detection of changes in gelatin due to bacteria.infectious diseases，1926,39：3023096 曹 瑞 華 ， 溫 海. 新生隱球菌磷脂酶的研 究 進(jìn) 展 . 國 外 醫(yī) 學(xué) 皮 膚 性 病 學(xué) 分 冊 ，2002（5）：2973007 quinn p j, carter m e, markey b m , et al. clinical veterinary. lond

23、on: wolf publishing, 19948 lin -chi chen，erika s.blank，arturo casadevall. extracellular討 論3夠降解明膠的金屬 蛋 白 酶膠 原 酶 ），不 含 磷 脂 酶 。（明 膠 酶 或鴨疫里默氏桿菌是一種無芽胞 、不 運 動 、 有 莢 膜 的 g 小 桿 菌 ， 主 要 引 起鴨傳染性漿膜炎 。德 國 學(xué) 者segers等 (1993)根 據(jù)dna-rrna雜 交 分 析 ，蛋 白 質(zhì) 、脂 肪 酸 組 成 ，結(jié) 合 基因型和表現(xiàn)型 特 征 ， 提議將鴨疫里 默氏桿菌獨立成 屬 。 riemerella 屬 目

24、前 只 有 riemerella anatipestifer一 個 種 ， 因此在生化特性 上尚無共同的規(guī)則可循 。 通 常 認(rèn) 為 鴨 疫里默氏菌不發(fā)酵碳 水 化 合 物 ， 不 產(chǎn) 生 吲 哚 、尿 素 ，但 也 有 報 道 指 出 ， 少 數(shù) 菌株能發(fā)酵葡萄糖 、麥 芽 糖 、肌 醇 和 果 糖 ，產(chǎn)吲哚和尿素不定 。 本 研 究 對29株 ra的 檢 測 發(fā) 現(xiàn) ，大 部分菌株生化指標(biāo) 表現(xiàn)為接觸酶陽性 ，硝 酸 鹽 還 原 試 驗 、 m.r和 v.p試 驗 、尿 素 酶 、精 氨 酸 酶 、賴 氨 酸 酶 陰 性 ，不發(fā)酵碳水化合物, 這 一 點與相關(guān)文獻(xiàn)報道相似 。 但 本 研

25、究 中 ra分離株明膠液化陽性率高于文獻(xiàn)報 道9,10，29株ra中26株能液化明 膠 ，陽 性 率達(dá)89.7%。 細(xì)菌具有液化明膠的特性 是因為其能分泌具有 水解明膠活性的 類 蛋 白 水 解 酶 ，該 酶 類 作 用 底 物 廣 泛 ， 已有文獻(xiàn)報道其與細(xì) 菌性腦膜炎和心 肌炎等多種細(xì)菌性 疾 病 密 切 相 關(guān) ， 是 許 多 病 原 性細(xì)菌的重要毒力因子 1114。 明膠液化陽性率的增高 ， 是 否 與ra本 身血清型復(fù)雜 ， 隨著近 年 來ra動 物 感 染 譜 的 擴(kuò) 大 ， 其 致 病 性發(fā)生了一定變 化有關(guān)是值得進(jìn)一步研究的 。胞外蛋白酶是細(xì) 菌的一種重要致 病 因 子 ，目

26、前, 對 氣 單 胞 菌 、假 單 胞 菌 、 大腸桿菌等的胞外蛋 白酶已有較深入 proteinaseactivityofcryptococcus底 物 -page 法 檢 測 ra 胞 外 蛋 白酶結(jié)果與平板法一致 ， 但 是 較 平 板 法 敏 感 ， 本 研 究 中 ，ra液體培養(yǎng)后收集 的 上 清 液 稀 釋 10 倍 以 后 進(jìn) 行 底 物 -page法 仍 能 檢 測到胞外蛋白酶 ，其 降 解明膠形成透明的 亮 帶 。 在 平 板 法 中檢測呈陽性的菌株 ， 用 底 物-page法 檢測均能形成不止 一 條 亮 帶 ， 這 提 示我 們 ra 胞外蛋白酶中能降解明膠的 蛋白酶不止

27、一種或 者該蛋白酶不穩(wěn)定 發(fā) 生 自 身 降 解 ，因而形成幾條亮帶 。將 ecpase 與 金 屬蛋白酶抑制劑 edta作 用 后 ，再用底物平板法進(jìn)行檢 測 ，結(jié)果明膠平板法 、脫脂奶瓊脂平板 法檢測均為陰性 ， 表 明 edta 能 抑 制 ecpase降解明膠和脫脂奶 中 蛋 白 的 能 力 。 金屬蛋白酶最 大的特點就是活性 中心依賴于某種金 屬 離 子 ， 能 夠 被 金 屬 離 子 螯 合 劑 (edta，egta，nacn 或 鄰 二 氮 雜 菲 等)強(qiáng) 烈 抑 制15。 因 此 ，金 屬 蛋 白 酶 抑 制 劑 edta對 ra胞 外 蛋 白 酶 活 性的抑制進(jìn)一步提示我們

28、ra 胞 外 蛋白酶可能是一種金屬蛋白酶 。 而ra 產(chǎn)生什么種類和性質(zhì)的金屬蛋白酶 , 以及它們與其他毒力因子的相 互 作 用, 值得進(jìn)一步探討 。參 考 文 獻(xiàn)neoformans. clinical and diagnosticlaboratory immunology, 1996 (5)：705749 程安春, 汪銘書, 陳孝躍, 等. 我國鴨疫里 默氏桿菌血清型調(diào)查及新血 清 型 的 發(fā) 現(xiàn) 和 病原特征. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2003(4)：320323 10 徐 軒 郴 ，萬 紹 貴 ，劉 小 蘭 ，等 .鴨 疫 里 默 氏桿菌江西分離株的微生 物 學(xué) 特 性 . 江 西 畜 牧 獸 醫(yī) 雜 志 ，2003(5)：6811 gven kayaoglu. virulence factors ofenterococcusfaecalisrelationshiptoendodontic disease. crit rev oral biol