阿替洛爾錦鯽肝細(xì)胞

1、摘 要本研究采用阿替洛爾(Atenolol，簡(jiǎn)稱ATL)進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室模擬自然水生條件初步探究ATL對(duì)錦鯽抗氧化防御系統(tǒng)的毒性大小及機(jī)理，探究ATL對(duì)錦鯽肝臟的氧化應(yīng)激系統(tǒng)損傷，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定抗氧化指標(biāo)SOD和CAT，評(píng)估了用不同濃度ATL長(zhǎng)時(shí)間暴露下（30天），ATL對(duì)錦鯽肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的損傷情況，比較不同劑量ATL毒作用的差別。由實(shí)驗(yàn)可得知將錦鯽暴露于ATL100mg/kg會(huì)使錦鯽CAT活性下降，酶活受到抑制，說(shuō)明錦鯽的抗氧化系統(tǒng)受到損傷，阿替洛爾能對(duì)錦鯽產(chǎn)生致毒作用。關(guān)鍵詞：阿替洛爾；錦鯽；肝細(xì)胞；SOD；CAT；氧化損傷；生物毒性AbstractIn this study,

2、atenolol (ATL) was used to study the toxicity and mechanism of ATL on the antioxidant defense system of Carassius auratus, and the damage of ATL on the oxidative stress system of Carassius auratus liver. By measuring the antioxidant indexes SOD and CAT, we evaluated the effects of ATL on Carassius a

3、uratus under low concentration and long time exposure (30 days) To compare the toxic effects of different doses of compounds. The results showed that the CAT activity of Carassius auratus exposed to ATL 100mg / kg decreased and the enzyme activity was inhibited, which indicated that the antioxidant

4、system of Carassius auratus was damaged and atenolol could produce toxic effect on Carassius auratus.Key words: atenolol; Carassius auratus; Liver cells; SOD.CAT; Oxidative damage; The biological toxicity of目 錄1 引言11.1 阿替洛爾的物理化學(xué)性質(zhì)11.2 阿替洛爾進(jìn)入自然環(huán)境的途徑11.3 阿替洛爾的毒性效應(yīng)21.4 錦鯽的抗氧化防御系統(tǒng)31.4.1 生物標(biāo)志物31.4.2 抗氧化防

5、御的機(jī)理31.5 本文的研究目的和意義42 實(shí)驗(yàn)部分42.1 試劑和儀器42.1.1 藥品42.1.2 儀器42.1.3 錦鯽的馴養(yǎng)42.2 實(shí)驗(yàn)步驟52.2.1 染毒處理52.2.2 取樣和制備樣品52.2.3 總蛋白的測(cè)定52.2.4 SOD活性測(cè)定52.2.5 CAT活性測(cè)定63 數(shù)據(jù)分析與處理63.1 統(tǒng)計(jì)分析方法63.2 數(shù)據(jù)記錄與處理63.3 結(jié)果分析與討論83.3.1 圖表分析83.3.2 討論94 結(jié)論與展望10致謝11參考文獻(xiàn)12阿替洛爾對(duì)錦鯽的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)1 引言阿替洛爾(Atenolol，ATL)，是一種選擇性1腎上腺素受體阻滯藥，被廣泛使用在多種情況所引起的中、輕度

6、高血壓病。ATL由英國(guó)帝國(guó)化學(xué)公司(ICI)于上世紀(jì)70年代初期率先研制的1。ATL的優(yōu)點(diǎn)有：起效快、無(wú)積蓄中毒性中毒的風(fēng)險(xiǎn)等，普及于高血壓、心絞痛、心肌梗死等疾病的治療。因?yàn)锳TL有持久性超量使用、較高的穩(wěn)定性和水溶性的特點(diǎn)，所以現(xiàn)在ATL在各類水體中被檢測(cè)出含有殘留。據(jù)實(shí)驗(yàn)研究人員表明，ATL存在阻抑人類胚胎細(xì)胞生長(zhǎng)的情況，所以對(duì)自然生態(tài)環(huán)境和水生生物的健康存在很大的隱患2。天然條件下的水環(huán)境中ATL的理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，因此采用傳統(tǒng)水處理技術(shù)與生態(tài)修復(fù)技術(shù)都很難去除各類水體環(huán)境中殘留的ATL?？偟膩?lái)說(shuō)，ATL對(duì)環(huán)境健康影響的研究仍然是一個(gè)我們需要重復(fù)不斷地探討和研究的問(wèn)題。1.1 阿替洛爾

7、的物理化學(xué)性質(zhì)阿替洛爾(Atenolol，ATL)，又稱：氨酰心安，分子量：266.33600，分子式：C14H22N2O3，溶解于乙醇，微溶于氯仿，幾乎不溶于乙醚。精確質(zhì)量：266.16300，熔點(diǎn)151155，密度：1.125 g/cm3，沸點(diǎn)：508C，白色粉末，無(wú)臭或微臭。圖1-1 阿替洛爾結(jié)構(gòu)式1.2 阿替洛爾進(jìn)入自然環(huán)境的途徑目前獲得阿替洛爾片劑生產(chǎn)資質(zhì)的生產(chǎn)企業(yè)我國(guó)共70多個(gè)，觸及的相關(guān)部門批準(zhǔn)文號(hào)105個(gè)。參照國(guó)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)內(nèi)相關(guān)文件，歐洲藥典8.0版收錄了ATL的8個(gè)雜質(zhì)，但是我國(guó)很少有關(guān)于阿替洛爾片的相關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)研究和雜質(zhì)溯源的有關(guān)報(bào)道。隨著近些年來(lái)我國(guó)人口老齡化越來(lái)越嚴(yán)

8、重，ATL也越來(lái)越廣泛地被適用于治療心血管疾病當(dāng)中。在過(guò)去的10年間，其處方量增長(zhǎng)了約1倍3。阿替洛爾主要服用方式以口服為主，ATL的口服雖然吸收很快，但是并不完全，口服大約攝取50%有效成分，在2-4小時(shí)將會(huì)達(dá)到峰濃度，口服攝取后作用會(huì)持續(xù)很久，可以達(dá)到一天，廣泛分布在各個(gè)組織中，少量可以通過(guò)血-腦脊液屏障。健康人群的分布量大約為50-75升，血液中的半衰期為6-7小時(shí)，主要通過(guò)排尿的方式排出人體。且我國(guó)現(xiàn)階段醫(yī)療廢品處置存在廢物生產(chǎn)機(jī)構(gòu)安全意識(shí)低、設(shè)施簡(jiǎn)陋及知識(shí)匱乏、過(guò)期藥品回收形同虛設(shè)、診所廢品流失、廢物集中處置單位服務(wù)方式不足等問(wèn)題，造成了每年近一半年生產(chǎn)量以上的醫(yī)療廢品沒(méi)有妥善處理流

9、入自然界4。由于阿替洛爾具有較好的水溶性和抗生物降解性，因此常規(guī)處理污水方法很難有效去除阿替洛爾，這些殘留于尿液中的藥品隨著地下下水道源源不斷的流入自然界水環(huán)境中。許多國(guó)家和地區(qū)的污水廠中已檢測(cè)到ng/Lg/L的阿替洛爾56。就目前來(lái)說(shuō)，阿替洛爾已經(jīng)在水環(huán)境以及地表水中被檢測(cè)出大量存在，并檢出濃度偏高，阿替洛爾已經(jīng)成為了水環(huán)境的重要污染物。隨著近些年來(lái)我國(guó)人口老齡化越來(lái)越嚴(yán)重，ATL也越來(lái)越廣泛地被適用于治療心血管疾病當(dāng)中，中、輕度高血壓病治療中以ATL為代表的選擇性1腎上腺素受體阻滯藥的需求也將不斷擴(kuò)大。所以在自然生態(tài)環(huán)境中ATL的比例也逐漸增加。1.3 阿替洛爾的毒性效應(yīng)因?yàn)榛衔锏幕瘜W(xué)結(jié)

10、構(gòu)和毒性效應(yīng)緊密相連，不難看出阿替洛爾的親脂性顯然和阿替洛爾生物毒性相關(guān)，阿替洛爾的-受體阻滯劑的logKow（辛醇水分配系數(shù)）為：約為 -0.15到0.787。凡是人類生產(chǎn)的大多數(shù)藥品大多經(jīng)過(guò)特別調(diào)整而擁有其特定的效用方式。雖然阿替洛爾是針對(duì)人類的l腎上腺受體，可是與其相似的受體也在哺乳類、魚類等脊椎動(dòng)物中存在。根據(jù)研究現(xiàn)象表明，有類似阿替洛爾的-受體阻滯劑，-受體阻滯劑裸露會(huì)致使魚類胚胎孵化成功率減少，而且也會(huì)導(dǎo)致魚類的胚胎發(fā)育情況不正常。例如普萘洛爾裸露可能會(huì)讓斑馬魚胚胎的體色變淺、心包腫、血液循環(huán)異常和尾部彎曲，明顯減少其孵化成功率和自由活動(dòng)，最后導(dǎo)致胚胎直接死亡8。根據(jù)觀察-受體阻滯

11、劑的藥物在防治疾病中對(duì)機(jī)體的作用及其原理，ATL對(duì)魚類也能發(fā)生相似的生物機(jī)體的機(jī)能效應(yīng)，比如引起心率降低。相關(guān)研究人員還在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)-受體阻滯劑可能導(dǎo)致EROD的升高。也發(fā)現(xiàn)魚鰓中的EROD含量更為顯著，這樣的情況也許說(shuō)明了魚鰓在-受體阻滯劑代謝中的主要作用，而-受體阻滯劑的誘導(dǎo)效力可以與一些自然生態(tài)環(huán)境常見(jiàn)的EROD誘導(dǎo)劑的作用匹敵。在其他研究實(shí)驗(yàn)中還能發(fā)現(xiàn)-受體阻滯劑可以誘導(dǎo)斑馬魚心臟中產(chǎn)VTG（卵黃蛋白原），這是第一次人類發(fā)現(xiàn)VTG可以經(jīng)過(guò)非雌激素方式刺激表現(xiàn)出來(lái)9。雖然ATL被認(rèn)為是較為安全的一種-受體阻滯劑，但是自然生態(tài)環(huán)境中所存在的大量ATL，讓我們不得不重新看待ATL的毒性效應(yīng)和

12、ATL對(duì)于自然生態(tài)環(huán)境及生物體的安全危害和影響。1.4 錦鯽的抗氧化防御系統(tǒng)1.4.1 生物標(biāo)志物一種能在意識(shí)之外評(píng)價(jià)服藥后正常生理、病理過(guò)程或機(jī)體生理的指標(biāo)被稱作生物標(biāo)志物10。生物標(biāo)志物作為一種特別的且有用的輔佐方法可以快速、靈敏、準(zhǔn)確、在較早期地推斷病癥的產(chǎn)生、進(jìn)展和預(yù)后。生物標(biāo)志物還可以適合用在嚴(yán)重程度疾病的判斷和種類，檢測(cè)疾病醫(yī)療的效果，也可使用在篩查患病高危人群之中111213。指示水環(huán)境污染的主要生物標(biāo)志物包括：細(xì)胞色素4P50lA1（抗氧化酶、解毒酶等）、金屬硫蛋白、DNA加合物、應(yīng)激蛋白（HSP）?？寡趸副灰曌麇\鯽抗氧化系統(tǒng)的重要指標(biāo)之一，所以在研究錦鯽抗氧化性時(shí)抗氧化酶便

13、能作為一種特殊生物標(biāo)志物。1.4.2 抗氧化防御的機(jī)理鯽魚類的抗氧化系統(tǒng)中，起重要作用的是抗氧化酶：消除機(jī)體自由基的功能、對(duì)氧化脅迫的清除功能、增強(qiáng)機(jī)體防御能力、增強(qiáng)機(jī)體免疫等14?？寡趸烙到y(tǒng)中SOD、CAT是其重要防線之一，SOD的任務(wù)是將氧氣催化成過(guò)氧化氫，如果過(guò)氧化氫清除的不適時(shí)，過(guò)氧化氫就會(huì)和氧氣產(chǎn)生反應(yīng)后，從而生成毒性羥基自由基。而CAT的任務(wù)是主要將SOD催化后產(chǎn)生的過(guò)氧化氫一一轉(zhuǎn)化為水和氧氣，便能夠減少過(guò)氧化氫的濃度，以此保護(hù)機(jī)體的組織，維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定15。清除活性氧自由基的反應(yīng)式如下：自由基是有氧生物一定需要的，若自由基的生產(chǎn)量很大，抗氧化防御系統(tǒng)的抗氧化清理作用

14、清理不及時(shí)，遭到壓制，長(zhǎng)時(shí)間就會(huì)導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)損傷，抗氧化酶活性下降。綜上，要讓自然生態(tài)環(huán)境有所改變，魚類的抗氧化酶活性的變化就可以作為衡量指標(biāo)之一。1.5 本文的研究目的和意義隨著我國(guó)老齡化的加劇，心血管疾病患者不斷增多，阿替洛爾為代表的-受體阻滯劑藥品的使用量可能會(huì)持續(xù)增加。大量的阿替洛爾隨著患者排泄以及醫(yī)療廢物處理不當(dāng)大量流入以水環(huán)境為代表的自然環(huán)境中，因此自然生態(tài)環(huán)境正在逐漸惡化。本論文在以下文獻(xiàn)的研究基礎(chǔ)上，以錦鯽作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，主要進(jìn)行的研究?jī)?nèi)容是在室內(nèi)進(jìn)行半靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行更深入的研究關(guān)于阿替洛爾對(duì)錦鯽的肌肉和內(nèi)臟團(tuán)中谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶、超氧化物歧

15、化酶活性的影響。經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)的探究，從而評(píng)價(jià)阿替洛爾對(duì)錦鯽的毒性效應(yīng)以及產(chǎn)生的酶系的響應(yīng)，為評(píng)價(jià)阿替洛爾對(duì)水生動(dòng)物，尤其是對(duì)于魚類的毒性影響和潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考價(jià)值。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 試劑和儀器2.1.1 藥品阿替洛爾（摩貝實(shí)驗(yàn)用品商城，純度為98%）；福爾馬林、二甲苯和酒精（國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，上海）；SOD、CAT和蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所，南京）；錦鯽（Carassiusauratus，19.73.6g，9.01.0cm），所有錦鯽均購(gòu)自寧德市金馬市場(chǎng)。（實(shí)驗(yàn)中所用的試劑的純度均為100）2.1.2 儀器低溫高速冷凍離心機(jī)（Allegra64R來(lái)自于美國(guó)

16、Beckman公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Unico UV2000 spectrometry，上海）；2.1.3 錦鯽的馴養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中曝氣水的來(lái)源是活性炭去氯曝氣自來(lái)水、溶解氧大于5mgL-1、pH7.60.3、水溫222C。實(shí)驗(yàn)室條件下錦鯽被馴養(yǎng)至少達(dá)到15天以上，每天的任務(wù)給錦鯽定時(shí)定量投餌一次（餌料為南京水產(chǎn)所提供的魚用食料），并且給魚缸持續(xù)充氧。實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇肉眼不可見(jiàn)畸形的無(wú)明顯疾病的錦鯽。2.2 實(shí)驗(yàn)步驟2.2.1 染毒處理本實(shí)驗(yàn)選擇以錦鯽作為對(duì)象，購(gòu)置于寧德市金馬市場(chǎng)。將錦鯽置于30L曝氣水配備自動(dòng)換水系統(tǒng)的魚缸中，實(shí)驗(yàn)環(huán)境保持在溶解氧大于5mgL-1、pH7.60.3、水溫222。錦

17、鯽必須在實(shí)驗(yàn)室的條件下馴養(yǎng)至少達(dá)到15天以上，需要給魚缸持續(xù)充氧且每天喂食量約0.035g/魚（餌料為寧德水產(chǎn)所提供的魚用食料）。實(shí)驗(yàn)開始前，應(yīng)挑選無(wú)明顯疾病、健康活潑和肉眼無(wú)可見(jiàn)畸形的錦鯽。為保證每個(gè)魚缸的暴露濃度盡量在同一水平，換水時(shí)先放到剩下一半的水，再加入一定體積事先配置好的KP母液和水，其中KP母液濃度為100mg/L（用二甲基亞砜溶液配置）。將錦鯽隨機(jī)分劃入處理組別，設(shè)置的濃度組為ATL（0），ATL（10mg/kg），ATL（100mg/kg）。2.2.2 取樣和制備樣品在暴露實(shí)驗(yàn)第7、14、30天從每個(gè)缸中選擇三條差不多，無(wú)明顯病態(tài)錦鯽，撈出受試魚，將其擊昏后立刻放置在天平上迅

18、速稱重，而后在冰盤上為受試魚測(cè)量和解剖，將受試魚的肝臟取出，用0.9的生理鹽水為組織表面沖洗備用。然后取出低溫冷凍保存的樣品或者新鮮組織樣品，表面殘余的水分利用濾紙吸干，而后迅速稱量，加入質(zhì)量體積比為1：9的冷生理鹽水，操作電動(dòng)勻漿器進(jìn)行勻漿后，在-4的冷凍離心機(jī)（Beckman，購(gòu)置于美國(guó)）12000g離心15分鐘，取其上清液分別測(cè)定肌肉和內(nèi)臟中蛋白質(zhì)含量及相關(guān)酶活性，4小時(shí)內(nèi)需測(cè)定完畢。2.2.3 總蛋白的測(cè)定運(yùn)用Bradford方法對(duì)錦鯽的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，采用BSA實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。NH3+基團(tuán)存在于蛋白質(zhì)分子中，游離狀態(tài)下的考馬斯亮藍(lán)G-250呈現(xiàn)棕紅色，當(dāng)?shù)鞍讟?biāo)準(zhǔn)液或樣品與棕紅色的

19、顯色劑出現(xiàn)反應(yīng)時(shí)，蛋白中的NH3+便會(huì)和G-250染料上的陰離子相結(jié)合，此時(shí)溶液將會(huì)呈現(xiàn)出藍(lán)色。如果色素-蛋白質(zhì)的結(jié)合物在595nm下時(shí)，在一定范圍內(nèi)含量的蛋白質(zhì)，蛋白的含量與光的密度值會(huì)呈現(xiàn)正比，測(cè)定出的蛋白含量被用在校正SOD，CAT酶活性。提取所需的酶提取液，用滴管加入3mL的G-250試劑，然后使用混勾器將酶提取液和試劑進(jìn)行充分的混合，在10分鐘內(nèi)二者將會(huì)相互反應(yīng)，而后用595nm的波長(zhǎng)下做比色，樣品測(cè)定過(guò)程中，利用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管（標(biāo)準(zhǔn)樣品試樣）和對(duì)照管（蒸餾水空白）的吸光度作為校正。在此期間一定要注意的是，如果當(dāng)樣品的濃度太高則需要對(duì)其預(yù)先稀釋，以保證測(cè)定的樣品吸光度在準(zhǔn)確的線性范圍內(nèi)。

20、2.2.4 SOD活性測(cè)定使用Flohe和Otting(1984)描述的方法測(cè)定相關(guān)生化參數(shù)的測(cè)定過(guò)程并且采用試劑盒測(cè)定SOD活性，SOD活性根據(jù)馮明寶16等提出的方法來(lái)測(cè)定：超氧離子的自由基會(huì)生成黃嘌呤氧化酶與黃嘌呤，二者相互反應(yīng)中，亞硝酸鹽形成于超氧離子經(jīng)過(guò)氧化羥胺的作用。通過(guò)顯色劑的作用下，使用分光光度計(jì)測(cè)其在550nm處的吸光度，會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的淡紫紅色。如果待測(cè)樣品中具有SOD超氧離子會(huì)出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的專一性的抑制作用，會(huì)降低它生成的亞硝酸鹽的濃度，并且吸光度會(huì)減小。推算SOD酶活性可利用所測(cè)定樣品與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照之間吸光度的差異，單位為USOD/g蛋白質(zhì)。依照實(shí)驗(yàn)中吸光度的變化情況，可以明確

21、待測(cè)樣品的SOD活性，并且通過(guò)公式推算，最后能夠計(jì)算出待測(cè)樣品中SOD酶活性，其中SOD的活性的表達(dá)式為U/mg protein。每毫克的組織蛋白在每一毫升反應(yīng)液的抑制率達(dá)50%時(shí)，其實(shí)驗(yàn)所對(duì)應(yīng)的SOD量是一個(gè)活性單位（U）為SOD活性定義。測(cè)定過(guò)程需要同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管（標(biāo)準(zhǔn)樣品試樣）和對(duì)照管（蒸饋水空白），用作樣品管的校正。2.2.5 CAT活性測(cè)定CAT酶活性的測(cè)定利用試劑盒進(jìn)行批量化的測(cè)定，其測(cè)定過(guò)程是依據(jù)Goth(1991)所描述的方法，CAT分解H2O2加入鉬酸銨的反應(yīng)后將會(huì)迅速中止，因?yàn)殂f酸銨與實(shí)驗(yàn)過(guò)量的H2O2反應(yīng)能夠產(chǎn)生淡黃色的絡(luò)合物，而且能夠在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定出其的吸光度和

22、生成量，所以能夠推算出CAT的活性，其中CAT活力表達(dá)為U/mg protein。通過(guò)研究人員發(fā)現(xiàn)每一毫克組織蛋白1秒鐘能夠分解出1mol的H2O2的量作為一個(gè)活性單位該為組織勻漿中的CAT活性定義。測(cè)定過(guò)程中需要同時(shí)測(cè)定對(duì)照管(蒸餾水空白)用作樣品管的校正。3 數(shù)據(jù)分析與處理3.1 統(tǒng)計(jì)分析方法該實(shí)驗(yàn)利用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件Statistical Package for Social Sciences，ver.12.0，SPSS公司，芝加哥，美國(guó)）處理該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)的數(shù)值均可使用平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法來(lái)表示。其中，當(dāng)P小于0.05時(shí)，可認(rèn)為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間具有

23、顯著性的差異。實(shí)驗(yàn)時(shí)數(shù)據(jù)記錄的應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析圖均用Origin 8.0（Origin Lab，美國(guó)）繪制。3.2 數(shù)據(jù)記錄與處理表2-1 不同濃度的ATL在不同時(shí)間暴露下蛋白質(zhì)濃度的變化暴露時(shí)間/天ATL暴露濃度Control10mg/kg100mg/kg71.011.371.15140.971.401.14301.011.060.96圖2-1 不同濃度的ATL在不同時(shí)間暴露下蛋白質(zhì)濃度的變化表2-2 不同濃度的ATL在不同時(shí)間暴露下SOD酶活性的變化暴露時(shí)間/天ATL暴露濃度Control10mg/kg100mg/kg770.8861.5969.321483.0757.9977.753078.

24、3082.1176.48圖2-2 不同濃度的ATL在不同時(shí)間暴露下SOD酶活性的變化表2-3不同濃度的ATL在不同時(shí)間暴露下CAT酶活性的變化暴露時(shí)間/天ATL暴露濃度Control10mg/kg100mg/kg717.7520.2319.941417.7921.8415.423017.2310.6115.12圖2-3 不同濃度的ATL在不同時(shí)間暴露下CAT酶活性的變化3.3 結(jié)果分析與討論3.3.1 圖表分析從圖1中我們分析不同濃度ATL和時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響，可以看出第7天的在蛋白質(zhì)酶活性10mg/kg的濃度組酶活性與空白對(duì)照組其酶活性呈現(xiàn)出誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，呈現(xiàn)顯著性差異（p小于0.05

25、），其誘導(dǎo)率為34.97；在100mg/kg濃度組與空白對(duì)照組相比較呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升趨勢(shì)，但是沒(méi)有明顯差異（P大于0.05）。14天的時(shí)候，10mg/kg的濃度組蛋白質(zhì)酶活性與空白組對(duì)比呈現(xiàn)出誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，且出現(xiàn)顯著性差異（p小于0.05），其誘導(dǎo)率為43.72；100mg/kg高濃度組蛋白質(zhì)酶活性與空白組相比沒(méi)有顯著性差異（P大于0.05）。30天的時(shí)候，10mg/kg濃度組蛋白質(zhì)酶活性與空白組對(duì)比出現(xiàn)了誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，但是沒(méi)有明顯差異（P大于0.05）；100mg/kg高濃度組蛋白質(zhì)酶活性與空白組相比呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，但是沒(méi)有明顯差異（P大于0.05）。從圖2中我們分析不同濃度ATL和時(shí)間

26、對(duì)SOD酶活性的影響，可以看出第7天，10mg/kg低濃度組與空白對(duì)照組相比SOD酶活性呈現(xiàn)出顯著性差異（p小于0.05），SOD酶活性有明顯降低，酶活顯著被抑制，抑制率為13.10；在100 mg/kg濃度組與空白對(duì)照組比較呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，但是沒(méi)有明顯差異（P大于0.05）。14天的時(shí)候，10mg/kg濃度組與空白組對(duì)比SOD酶活性呈現(xiàn)顯著性差異（p小于0.05），且呈抑制下降趨勢(shì)，其抑制率為30.20；100 mg/kg濃度組SOD酶活性與空白組對(duì)比呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，但是沒(méi)有明顯差異（P大于0.05）。30天的時(shí)候，10mg/kg濃度組SOD酶活性與空白組對(duì)比呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，可是

27、沒(méi)有明顯差異（P大于0.05）；100 mg/kg高濃度組與空白組相比SOD酶活性已經(jīng)相對(duì)一致。從圖3中，我們分析不同濃度ATL和時(shí)間對(duì)CAT酶活性的影響，第7天的在CAT酶活性10 mg/kg低濃度組CAT酶活性與空白對(duì)照組相比呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，但是沒(méi)有明顯差異（P大于0.05）；在100mg/kg濃度組與空白對(duì)照組相比較，呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升的趨勢(shì)，但是沒(méi)有明顯差異（P大于0.05）。14天的時(shí)候，10 mg/kg濃度組CAT酶活性呈現(xiàn)誘導(dǎo)上升趨勢(shì)，出現(xiàn)顯著性差異（P小于0.05），其誘導(dǎo)率22.80；100 mg/kg濃度組CAT酶活性與空白組對(duì)比呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，但是沒(méi)有明顯差異（P大于0

28、.05）。30天的時(shí)候，10mg/kg濃度組CAT酶活性與空白組對(duì)比出現(xiàn)了顯著性差異（p小于0.05）呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，其抑制率為38.43；100 mg/kg高濃度組CAT酶活性與空白組相比出現(xiàn)了顯著性差異（p小于0.05）呈現(xiàn)抑制下降的趨勢(shì)，其抑制率為12.26。3.3.2 討論本實(shí)驗(yàn)所采用阿替洛爾（ATL）進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室模擬自然水生條件初步探究ATL對(duì)錦鯽抗氧化防御系統(tǒng)的機(jī)理與毒性作用的大小，探究ATL對(duì)錦鯽肝臟的氧化應(yīng)激系統(tǒng)損傷，為理解ATL對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的影響提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定抗氧化指標(biāo)SOD和CAT，評(píng)估了低濃度長(zhǎng)時(shí)間暴露下（30天）阿替洛爾對(duì)錦鯽肝臟抗氧化防御系

29、統(tǒng)的損傷，比較不同劑量化合物毒作用的差異。通過(guò)對(duì)阿替洛爾對(duì)錦鯽肝臟的氧化系統(tǒng)損傷的研究了解到，將錦鯽暴露于ATL0mg/kg、ATL10mg/kgSOD、CAT濃度變化呈現(xiàn)一致規(guī)律，說(shuō)明ATL10mg/kg時(shí)，對(duì)錦鯽的氧化損傷并不明顯；將錦鯽暴露于ATL100mg/kg會(huì)導(dǎo)致錦鯽CAT酶活性受到抑制作用，這些體內(nèi)表征的變化可證明阿替洛爾能導(dǎo)致錦鯽肝臟的氧化損傷。因此阿替洛爾對(duì)魚能夠產(chǎn)生誘導(dǎo)發(fā)生氧化應(yīng)激，CAT活性下降，這些表征可證明阿替洛爾的暴露造成了肝臟細(xì)胞的氧化應(yīng)激并產(chǎn)生毒性效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌系統(tǒng)易受阿替洛爾影響，對(duì)生物體具有潛在的威脅，對(duì)與動(dòng)植物都具有較大的消極效應(yīng)。當(dāng)使用低濃度阿

30、替洛爾處理動(dòng)物時(shí)，會(huì)造成動(dòng)物對(duì)氧的消耗量的增加，可發(fā)現(xiàn)阿替洛爾對(duì)錦鯽的肝細(xì)胞既有誘導(dǎo)作用，也有抑制作用。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得知，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：0mg/kg、10mg/kg濃度暴露下，蛋白質(zhì)濃度變化呈現(xiàn)一致規(guī)律；10mg/kg濃度暴露下，7天、14天對(duì)SOD酶活性有顯著的抑制能力和CAT酶活性有誘導(dǎo)能力，30天后又與空白組持平，說(shuō)明低濃度ATL暴露下，生物體內(nèi)自由基的增加，在SOD酶活性下降和CAT酶活性上升作用下使得生物體清除過(guò)多的自由基后機(jī)體自身抗氧化系統(tǒng)未被破壞，得出低濃度ATL對(duì)生物體的毒性影響不大；100mg/kg濃度暴露下，30天對(duì)CAT酶活性有顯著的抑制能力，說(shuō)明生物體內(nèi)自由基的增加，從而造

31、成肝臟組織損傷，這種現(xiàn)象可能是阿替洛爾本身所具有的毒性所引起的，即ATL的濃度僅在一定濃度范圍內(nèi)與錦鯽的表達(dá)呈劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系，并把這種現(xiàn)象歸結(jié)為ATL本身所具有的毒性。4 結(jié)論與展望本論文針對(duì)阿替洛爾進(jìn)入環(huán)境后錦鯽肝臟的損傷以及對(duì)肝臟抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響。論文主要研究結(jié)論如下：在濃度（ATL0mg/kg、ATL10mg/kg）暴露下SOD、CAT濃度變化沒(méi)有并呈現(xiàn)一致規(guī)律，蛋白質(zhì)濃度變化沒(méi)有并呈現(xiàn)一致規(guī)律，說(shuō)明ATL10mg/kg時(shí)，對(duì)錦鯽的氧化損傷并不明顯；ATL100mg/kg會(huì)導(dǎo)致錦鯽SOD、CAT活性有下降趨勢(shì)，蛋白質(zhì)濃度均有所降低，說(shuō)明高濃度對(duì)SOD、CAT活性蛋白質(zhì)有著顯著的抑

32、制能力，這些體內(nèi)表征的變化可證明阿替洛爾能導(dǎo)致錦鯽肝臟的氧化損傷。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出一定濃度的阿替洛爾會(huì)導(dǎo)致錦鯽SOD、CAT活性有下降趨勢(shì)，蛋白質(zhì)濃度均有所降低對(duì)錦鯽的肝臟造成氧化損傷，所以可以說(shuō)明阿替洛爾對(duì)生物的毒性十分強(qiáng)烈，因此在必要的使用當(dāng)中若使用不當(dāng)就會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境影響。在未來(lái)的使用當(dāng)中，應(yīng)謹(jǐn)慎小心或發(fā)展出更加安全可靠、效果相同可替代的阿替洛爾其他藥品。1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版(二部) S .北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 572573.2 李蓮. 改性TiO_2對(duì)水體中阿替洛爾去除的應(yīng)用研究D. 東南大學(xué), 2018. 3 Santos L H

33、M L M , Araujo A N , Fachini A , et al. Ecotoxicological aspects related to the presence of Pharmaceuticals in the aquatic environmentJ. Journal of Hazardous Materials, 2010, 175(1-3) :45-95. 4 鄭瑋, 陳建輝. 生態(tài)文明視角下醫(yī)療廢物處置現(xiàn)狀及管理對(duì)策J. 中國(guó)公共衛(wèi)生管理, 2015, 31(06) :819-821+824. 5 Jones O A H , Voulvoulis N , Lester

34、 J N . aquatic environmental assessmentJ. Water Research, 2002, 36(20) :5013-5022. 6 Gmez MJ, Petrovi M, Fernndez-Alba AR, Barcel D. Determination of pharmaceuticals of various therapeutic classes by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis in hospital efflu

35、ent wastewaters. Journal of chromatography. A. 2006 May; 1114(2) :224-233. DOI: 10. 1016/j. chroma. 2006. 02. 038. 7 Massarsky A , Trudeau V L , Moon T W . -blockers as endocrine disruptors: the potential effects of human -blockers on aquatic organismsJ. Journal of Experimental Zoology Part A Ecological Genetics & Physiology, 2011, 315A(5) :251-265. 8 Fraysse B, Mons R, Garric J (2006) Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals. Ecotoxicol Environ Saf 63: 253267. 9 彭祖華, 池劍, 孫立偉, et al. -腎上腺受體阻滯劑的水生態(tài)