大黃魚中草藥淺析

1、摘 要 三重基序蛋白25 (Tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)在魚非特異性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)通過在大黃魚飼料中添加不同比例中草藥復(fù)方（太子參、巴戟、當(dāng)歸、枸杞、茯苓、白術(shù)等），飼喂30天后，以脾臟組織為實(shí)驗(yàn)材料，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析飼喂中草藥后TRIM25基因的相對(duì)表達(dá)變化。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組中該基因的表達(dá)均出現(xiàn)了不同程度的下降（E5組除外），E3組的表達(dá)量下降最多（64%），其次是E1組（47%），E5組的表達(dá)量比對(duì)照組升高19%，但每組之間無顯著性差異 (P 0.05)。本研究結(jié)果為中草藥作為餌料

2、添加劑在大黃魚飼料中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為中草藥作為魚類免疫增強(qiáng)劑提供了前期研究基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：大黃魚；中草藥；TRIM25Abstract Tripartite motif containing protein 25 (trim25) plays a key part in innate immunity of fish. In this experiment, the relative expression of trim25 gene was analyzed by adding different proportion of Chinese herbal compound (Radi

3、x Pseudostellariae, Morinda officinalis, angelica, wolfberry, Poria cocos, Atractylodes macrocephala) to the feed of large yellow croaker, and feeding it for 30 days. From the results: contrast with the control group, the expression of the gene decreased in different degrees in each experimental gro

4、up (except E5 group), the most decreased expression in E3 group (64%), followed by E1 group (47%), and the expression in E5 group increased by 19% contrast with the control group, but every two sets of data are almost identical, mathematically speaking (P 0.05).The results of this study supply simpl

5、e data for the application of Chinese herbal medicine as bait additive in the feed of large yellow croaker, and also provide the preliminary research basis for Chinese herbal medicine as fish immune enhancer.Key words: large yellow croaker；Chinese herbal medicine；TRIM25； 目 錄1引言1.1大黃魚1.2中草藥及太子參主要簡(jiǎn)介1.

6、3 TRIM25基因2 材料和方法2.1 材料、藥品及儀器2.1.1 原料魚處理2.1.2 試劑2.2 方法2.2.1 總RNA提取2.2.2 RNA凝膠電泳2.2.3 RNA定量分析2.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析3.1 RNA的質(zhì)量檢測(cè)3.2 熔解曲線分析3.3 基因表達(dá)分析4 討 論致謝參考文獻(xiàn)中草藥添加對(duì)大黃魚TRIM25基因表達(dá)的影響1 引 言1.1 大黃魚大黃魚（Larimichthys crocea）輻鰭亞綱，鱸亞目，石首科，黃魚屬。又名黃花魚、大王魚被譽(yù)為中國(guó)傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”之一。大黃魚不僅味道鮮美、肉質(zhì)嫩滑，還富有多種營(yíng)養(yǎng)。受到了廣大消

7、費(fèi)者的喜愛，是我國(guó)近海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一1。自1986年解決了人工育種瓶頸，大黃魚的人工培育得到了飛躍性的進(jìn)步，帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。但由于養(yǎng)殖環(huán)境污染及規(guī)模不斷的擴(kuò)大，近年來病害問題屢見不鮮，造成了巨大的損失。近幾年，隨著養(yǎng)殖規(guī)模化和集約化水平的不斷提高，養(yǎng)殖環(huán)境變化、長(zhǎng)期投喂冰鮮餌料和落后的飼養(yǎng)管理水平等使養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)緩慢、病害頻發(fā)，藥物用量和頻率增加，制約著整個(gè)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此，開發(fā)促進(jìn)養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗病能力的環(huán)保型飼料添加劑已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展新趨勢(shì)1-3。1.2 中草藥及太子參主要簡(jiǎn)介中草藥作為中華之瑰寶目前被大家所認(rèn)同在生物機(jī)體方面起積極作用主要有以下幾個(gè)方面:（1

8、）對(duì)生物機(jī)體在生長(zhǎng)過程中起促進(jìn)作用。大多數(shù)中草藥都含淀粉、蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，機(jī)體對(duì)這些成分進(jìn)行分解利用和同化作用，來達(dá)到促生長(zhǎng)的目的4。（2）提高機(jī)體的自身天然免疫能力。中草藥具有生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)通過穩(wěn)定體內(nèi)自由基、激活補(bǔ)體等多種方式綜合提高了機(jī)體天然免疫方面的能力。簡(jiǎn)紀(jì)常等5以中草藥作為餌料添加劑飼喂大黃魚發(fā)現(xiàn)，多種自身免疫相關(guān)的免疫細(xì)胞的數(shù)量都有顯著增多，酶活水平方面對(duì)溶酶菌起積極作用，實(shí)驗(yàn)說明中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物的自身天然免疫能力方面起促進(jìn)作用。Friedl等6的通過在體外對(duì)m的培育過程中發(fā)現(xiàn)人參水提物可以提高NO合成效率，從而對(duì)該細(xì)胞整體功能起到促進(jìn)作用。（3）是提高抗應(yīng)激能

9、力。水產(chǎn)生物中機(jī)體對(duì)外界環(huán)境變化都較為敏感，如大黃魚在飼喂過程中對(duì)光線和外界聲音都有較為應(yīng)激的表現(xiàn)，根據(jù)應(yīng)激程度不同對(duì)機(jī)體造成的影響也不同，會(huì)導(dǎo)致免疫下降易染病甚至死亡。而黃芪等中草藥能提高抗應(yīng)激能力。（4）是抗菌作用。少數(shù)中草藥可限制病原體的生命活動(dòng)，促機(jī)體抗菌作用。（5）復(fù)合作用。中草藥因藥性作用機(jī)理不同常進(jìn)行復(fù)合使用，通過合理的配比能使中草藥發(fā)揮更大作用。因此，研究中草藥餌料添加不僅可以改善水產(chǎn)生物養(yǎng)殖環(huán)境方面的諸多問題，還能提高水產(chǎn)生物自身天然免疫。不得不說，中草藥添加在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已是萬眾矚目。太子參系孩兒參屬的一種干燥塊根，也有人稱做雙批七、童參等。味甘、微苦；性平7。我國(guó)太子參種植

10、在南方較為廣布，其中福建省柘榮縣坐擁優(yōu)厚的地理?xiàng)l件所產(chǎn)太子參品質(zhì)上乘，是全國(guó)最大太子參生產(chǎn)基地。太子參作為名貴的中草藥其被認(rèn)可的功效有：補(bǔ)氣益脾，滋養(yǎng)津液。太子參品質(zhì)的高低取決于太子參根塊的飽滿程度、是否香味濃郁、還有就是含糖量的高低。其藥理作用有：（1）抗疲乏、緩解緊張（2）提高人體抵抗力（3）SOD樣作用（4）延年益壽（5）止咳、殺菌抗病作用。其他作用：所含磷脂能有效促進(jìn)血液循環(huán)，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)抵抗力，預(yù)防改善腦血管疾病等8。太子參多糖類提取主要成分為蔗糖、槐糖、麥芽二糖、太子參多糖PHP-A、PHP-B其多糖含量與不同的栽培方式、產(chǎn)地等有較大影響。有研究表明太子參含糖量在7-9月份較

11、高，并且隨著存儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)太子參多糖含量會(huì)減少。其中福建省柘榮縣培育的品種多糖含量最高。皂苷（Saponin）以皂苷元和糖組成，在陸地高等植物中普遍存在，同時(shí)也在少許海生生物中也有發(fā)現(xiàn)。太子參體內(nèi)含有多種皂苷類物質(zhì)，這些物質(zhì)具備良好的生物活性以及抗氧化的功能，能抵抗機(jī)體內(nèi)自由基從而提高免疫力。目前太子參環(huán)肽類物質(zhì)共發(fā)現(xiàn)16種，是其關(guān)鍵的組分之一。這些太子參環(huán)肽具有較高的生物活性，在抑制酶解與化學(xué)降解方面因所產(chǎn)生的構(gòu)象具有良好的限制性所以與線性環(huán)肽比較更具有優(yōu)勢(shì)9。太子參塊根除了多糖、皂苷、環(huán)肽類還富含多種人體必需微量元素。微量元素以鐵、銅、鋅、錳的含量較高，若人體缺乏必需微量元素會(huì)導(dǎo)致機(jī)體功能。

12、除此之外，太子參還可提高豐富的氨基酸，包含人體無法合成或者合成速度滿足不了需求的此類必需氨基酸10。在小鼠、豬的研究中發(fā)現(xiàn)，太子參可以提高動(dòng)物機(jī)體的免疫保護(hù)作用11-16。如吳建華等以小豬體重每kg給0.5g太子參須連續(xù)喂養(yǎng)7d，研究表明太子參須在小豬的自身天然免疫與特性免疫中起積極作用，一方面太子參須可以使免疫細(xì)胞增多，另一方面對(duì)豬瘟抗體的表達(dá)與存在時(shí)間皆有提升。孫弼等對(duì)小鼠用太子參多糖設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)太子參多糖可有減少心肌缺血再灌注損傷模型的大鼠的心肌結(jié)構(gòu)損傷。水產(chǎn)動(dòng)物中，目前常見將太子參作為餌料添加在南美白蝦和福瑞鯉中的研究。如王蕓等17報(bào)道經(jīng)過復(fù)方中草藥投喂南美白對(duì)蝦能有效改善其抵御病害

13、侵染的能力，而且根據(jù)投喂時(shí)間的延長(zhǎng)而改善能力也不斷提高。李義等18用黃芪等多種中草藥作為餌料增添劑，能有效提高羅氏沼蝦的免疫功能。吳斌19將不同質(zhì)量比例（0.1%、0.2%、0.3%、0.5%）太子參多糖做餌料添加劑飼養(yǎng)福瑞鯉發(fā)現(xiàn)在0.3%太子參多糖添加量下，福瑞鯉自身天然免疫得到顯著提高。而太子參作為餌料添加劑在大黃魚中尚未見報(bào)道。1.3 TRIM25基因魚類免疫系統(tǒng)是負(fù)責(zé)防衛(wèi)病害入侵和感染疾病后恢復(fù)的防御機(jī)構(gòu)20。魚類的免疫系統(tǒng)主要有三大類分別是相關(guān)組織器官、與免疫應(yīng)答的相關(guān)細(xì)胞和B細(xì)胞免疫。魚免疫構(gòu)造器官含括頭、腎、脾等，同時(shí)這些相應(yīng)器官也產(chǎn)生在免疫過程中直接參與或與之相關(guān)的細(xì)胞俗稱白細(xì)

14、胞。體液免疫因子則可以分為非特異免疫蛋白或酶類、適應(yīng)性抗體21。魚的免疫系統(tǒng)可分為獲得免疫和先天性免疫，其中獲得免疫應(yīng)激時(shí)間較長(zhǎng)通常為14天，自身天然免疫具有速度快，一般1至2天，受溫度影響較小等特點(diǎn)。自身天然免疫包括辨別系統(tǒng)、干擾素系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)、溶菌酶、抗菌肽等直接殺傷分子，其中溶菌酶與抗菌肽等直接殺傷分子不成體系，而補(bǔ)體系統(tǒng)包括經(jīng)典途徑、旁路途徑、凝集素途徑。有研究表明，魚類中同時(shí)存在三種補(bǔ)體激活途徑，且旁路途徑活性水平遠(yuǎn)高于哺乳動(dòng)物。這說明相對(duì)其他高等動(dòng)物來說魚類對(duì)旁路途徑補(bǔ)體對(duì)抵御病害顯得更加關(guān)鍵22。魚類的獲得免疫的關(guān)鍵是適應(yīng)性抗體的產(chǎn)生，而適應(yīng)性抗體則要有相應(yīng)過程形成并且記憶，所

15、以認(rèn)為獲得免疫處于初期水平，而魚類自身天然免疫在拮抗外界病害入侵時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用23,24。故而提升魚類自身天然免疫對(duì)防御外來病害具有重大意義。三重基序蛋白25 (Tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)是E3泛素連接酶家族，其在非特異性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。三重基序蛋白的族群蛋白結(jié)構(gòu)中皆存在三個(gè)一樣的構(gòu)造，因此而得名，從N至C端分別是RING結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或者兩個(gè) B-box 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)處于 C 端的Coiled-coil結(jié)構(gòu)域。其中, RING結(jié)構(gòu)域參與鋅原子的融合并且促進(jìn)對(duì)靶蛋白的泛素化, 增強(qiáng)蛋白的平穩(wěn)性;B-box結(jié)構(gòu)域作為TRIM蛋

16、白的關(guān)鍵特征結(jié)構(gòu)域能提高TRIM蛋白E3泛素連接酶活性，Coiled-coil結(jié)構(gòu)域可以增進(jìn)TRIM蛋白間同一來源或不同來源的寡聚反應(yīng);C末端的PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域通過與RIG-I共同作用使下游抗病毒信號(hào)明顯增加, 從而干擾素的產(chǎn)生。在干擾素影響下可產(chǎn)生絕大部分TRIM族群蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在防御病原體方面起到關(guān)鍵作用。還有一些 TRIM 家族的蛋白質(zhì)在病原體侵染寄主細(xì)胞時(shí)起到至關(guān)重要的把控作用。不僅如此TRIM25基因在多種生物生命活動(dòng)中皆有參與，含細(xì)胞程序性的死亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞連續(xù)分裂成子細(xì)胞的過程。TRIM家族在哺乳動(dòng)物中普遍存在并且被研究。TRIM家族基因參與哺乳動(dòng)物機(jī)體多種生命活

17、動(dòng)如中與HIV-病毒相關(guān)的TRIM5，與神經(jīng)元特異性蛋白相關(guān)的TRIM22和自身天然免疫相關(guān)的TRIM25等25。近年來TRIM家族基因在魚類中被研究26,27，在三文魚(Salmo salar)、紅點(diǎn)虎麻(Epinephelus coioides)和非洲鯽魚(Oreochromis niloticus)等硬骨魚類中發(fā)現(xiàn)病毒和病毒模擬體poly(I:C)誘導(dǎo)TRIM25基因表達(dá)。有研究表明TRIM5基因在體外過表達(dá)可抑制病毒復(fù)制，在培養(yǎng)的魚類細(xì)胞中可加強(qiáng)干擾素表達(dá)。如楊瑩等通過克隆石斑魚TRIM25基因研究發(fā)現(xiàn)TRIM25基因的表達(dá)量在SGIV病毒侵染前期有明顯增高，并且當(dāng)TRIM25基因過表

18、達(dá)時(shí)能有效抑制該病毒的基因復(fù)制。鄭健美等對(duì)羅尼羅非魚TRIM25基因進(jìn)行克隆分析表明當(dāng)人工感染無乳鏈球菌后，TRIM25在各組織中表達(dá)量有顯著上升。以上研究充分說明了TIMR25基因在硬魚類自身免疫中揮發(fā)重要作用。本論文研究將太子參等中草藥添加到大黃魚飼料中，研究餌料添加對(duì)大黃魚TRIM25基因表達(dá)的影響，為中草藥提高魚類免疫研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和基本操作方法。2 材料和方法2.1 材料、藥品及儀器2.1.1 原料魚處理實(shí)驗(yàn)所用大黃魚來源于寧德市鼎誠(chéng)水產(chǎn)有限公司自行繁育的健康、規(guī)格一致，平均體長(zhǎng)（23.450.83）cm，體質(zhì)量（34.058.23）g的大黃魚幼魚。原料魚共分六組飼養(yǎng)分別為：1、2

19、、3、4、5、6（CK），養(yǎng)殖在1.5 T養(yǎng)殖桶中，養(yǎng)殖周期30 d，實(shí)驗(yàn)組飼料中添加的太子參及其他中草藥濃度見表2-1。每組設(shè)置1個(gè)平行組，每組100尾大黃魚幼魚。每天分2次投喂魚體質(zhì)量1%2%的飼料，視攝食情況酌情調(diào)整。養(yǎng)殖水體水溫控制在2426之間，溶解氧大于5.0 mg/L，pH值維持在8.0左右，氨氮小于0.2 mg/L。常規(guī)養(yǎng)殖管理，做好養(yǎng)殖記錄。30天以后，每組分別隨機(jī)取三尾健康個(gè)體進(jìn)行活體解剖采樣，取脾臟組織保存于Trizol裂解液，-80 超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。?-1實(shí)驗(yàn)魚各組飼料用料組成Table 2-1Feed components組別組分用量（%）1太子參0.52太子參

20、、黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天各0.167（總1.0）3太子參、黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天太子參0.5其他各0.1（總1.0）4太子參、黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓各0.111（總1.0）5太子參、黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、太子參0.5其他各0.0625（總1.0）6商品化餌料（CK）2.1.2 試劑TB Green Premix Ex Taq（Perfect Real time）、rTaq DNA Polymerase、購(gòu)自大連寶生物公司。dNTP購(gòu)自大連寶生物公司。DNA Marker購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司。引物由上海生工生物公司合

21、成。Trizol試劑購(gòu)自上海生工。2.2 方法2.2.1 總RNA提取Trizol法提取RNA具體流程參考說明書，具體如下：（1）取1.5 mLEP管加入30-50 mg脾臟樣品，用移液槍加1 mL Trizol，冰上破碎成漿；常溫放置3 min ，4 12000 g離心5 min。（2）取清液層加氯仿（1/5上清體積），混勻，常溫等待5 min，4 12000 g離心5 min。（3）取清液層加同體積經(jīng)預(yù)冷后的異丙醇，混勻，-20 放置20 min，4 12000 g離心10 min。取上清時(shí)需注意寧可少取也不要取到中層蛋白和下層基因組溶液，若取到則對(duì)后續(xù)RNA純度品質(zhì)造成污染。（4）倒清液

22、層加1 mL 75%乙醇（預(yù)冷），4 12000 g離心5 min，干燥（需干燥至EP管壁沒有余存乙醇，若余下乙醇較多可以用滅菌過的槍頭吸出，沉淀由實(shí)體轉(zhuǎn)至漸透明之間，則干燥完全），加無核酸酶水20-30 L，-80 保存。2.2.2 RNA凝膠電泳1.制膠：稱取4.8 g瓊脂糖，加40 ml 1X TAE電爐加熱溶解放涼加入4 L核酸染色劑，倒入制膠模具，待凝固成型。2.點(diǎn)樣：將RNA樣品順離與RNA Loading Buffer混好，用移液槍把混好的RNA輕輕點(diǎn)入膠孔中，設(shè)定程序121 V 15 min，開始電泳。3.將電泳完成的膠用凝膠成像系統(tǒng)觀察，驗(yàn)證其完整性。2.2.3 RNA定量分

23、析將RNA樣品用超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific)檢測(cè)樣品在260 nm和280 nm的吸收值，記錄RNA樣品濃度。2.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄以RNA樣品為模板，按照PrimeScriptIV 1st strand cDNA Synthesis Mix(Takara)試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，總反應(yīng)體系為10 L（如表2-2）。表2-2反轉(zhuǎn)錄各引物Table 2-2 Reverse transcription primers名稱用量（L）5Buffer2Enzyme Max 0.5OligdT0.5Random 6 mersRNA水0.51-3補(bǔ)至102.2.5

24、實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)大黃魚基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列設(shè)計(jì)引物，以-actin rRNA為內(nèi)參基因(引物序列見表2-3)，使用TB Green Premix Ex TaqTM (Takara)試劑盒，對(duì)基因進(jìn)行相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)2個(gè)重復(fù)。12.5 L反應(yīng)體系如下：6.25 L TB Green Premix Ex TaqTM (TaKaRa)，正向和反向引物各0.5 l（2 M），1 l 稀釋后的cDNA 模板（1:10稀釋），4.25 l 水。循環(huán)參數(shù)：95 預(yù)變性 5 min，40 個(gè)循環(huán)：95 15 s，60 45 s。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 2 次，

25、以平均值進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。根據(jù)2-Ct 算法算出每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量，所得數(shù)據(jù)用SPSS （Statistics Package for Social Science）18.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），比較均值的差異顯著性（P0.05）。表 2-3 實(shí)驗(yàn)所用PCR引物Table2-3 The primers used in qRT-PCR基因引物序列g(shù)ene sequenceTRIM25 F:AAACCTGTCACACCTGTATGGCR:GTCTTCATTCTTTTGGTCGCTG-actinF:TCGTCGGTCGTCCCAGGCATR:ATGGCGTGGGGCA

26、GAGCGT3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析3.1 RNA的質(zhì)量檢測(cè)通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)分析RNA的濃度和完整性。本實(shí)驗(yàn)得到的RNA，經(jīng)過電泳以后，發(fā)現(xiàn)18s、28s條帶清晰，無明顯smear，說明RNA具有較高的完整性（圖3-1）。RNA的OD值測(cè)定是檢測(cè)RNA質(zhì)量的重要指標(biāo)，RNA的OD260/280在1.8-2.0之間，說明其質(zhì)量較好，完整性較高，若比值大于2.2說明RNA存在降解，比值小于1.8則可能存在污染。本實(shí)驗(yàn)獲得的 OD260/280均值在1.7-2.1這個(gè)范圍內(nèi)（表3-1），說明提取的RNA質(zhì)量上乘，達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。圖3-1 部分RNA電泳圖Fig 3-1 RNA elec

27、trophoresis表3-1 RNA的定量結(jié)果Table 3-1 The quantity and quality of RNA樣品編號(hào)OD260/280濃度（ug/ul）樣品編號(hào)OD260/280濃度（ug/ul）Sp-E1-11.940.51Sp-E4-12.080.80Sp-E1-22.121.16Sp-E4-22.021.38Sp-E1-32.041.25Sp-E4-31.950.84Sp-E2-11.751.62Sp-E5-12.121.05Sp-E2-21.930.93Sp-E5-21.931.33Sp-E2-32.061.10Sp-E5-31.931.22Sp-E3-11.89

28、1.40Sp-C11.950.45Sp-E3-22.110.90Sp-C21.520.10Sp-E3-32.040.92Sp-C31.540.61 注：Sp（Spleen）為脾臟，E為實(shí)驗(yàn)組C為對(duì)照組3.2 熔解曲線分析實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)合熒光染料的特性可直觀的反應(yīng)非特異性擴(kuò)增，將特異性引物進(jìn)行熔解曲線分析，熔解曲線呈單峰（圖3-2），則說明引物特異性較好，定量結(jié)果準(zhǔn)確。圖3-2 溶解曲線圖Fig 3-2 Dissolution curve3.3 基因表達(dá)分析該基因在各實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)情況如圖3-3，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中該基因的表達(dá)均出現(xiàn)了不同程度的下降（E5組除外），E3組的表達(dá)

29、量減少最多（64%），其次是E1組（47%），E5組的表達(dá)量比對(duì)照組升高19%，但是各組間均無顯著性差異（P大于0.05）。圖 3-3 基因相對(duì)表達(dá)量圖Fig 3-3 Relative gene expression4 討 論4.1 中草藥添加相關(guān)應(yīng)用與前景中草藥乃我泱泱中華之瑰寶，不僅擁有豐富的營(yíng)養(yǎng)組分，還有許多珍貴的生物活性物質(zhì)。中草藥作餌料添加能提高生物機(jī)體的自身天然免疫、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)。吳斌19將不同質(zhì)量比例（0.1%、0.2%、0.3%、0.5%）太子參多糖做餌料添加劑飼養(yǎng)福瑞鯉發(fā)現(xiàn)在0.3%太子參多糖添加量下，福瑞鯉自身天然免疫得到顯著提高。吳建華等14以小豬體重每kg給0.5g太子

30、參須連續(xù)喂養(yǎng)7d，研究表明太子參須可以使小豬血液中白細(xì)胞數(shù)目增多，還對(duì)豬瘟的抗體存在時(shí)間有所延長(zhǎng)，抗體水平也有效提升。在飼養(yǎng)環(huán)境惡化的今天，研究增強(qiáng)抗病能力的環(huán)保型飼料添加劑已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。而天然中草藥具有毒性低、耐受低等優(yōu)點(diǎn)作為餌料添加劑擁有不可小覷的情景。4.2 中草藥添加對(duì)TRIM25基因表達(dá)的影響中草藥作為飼料添加可有效提高機(jī)體自身天然免疫，其含有很多活性抗氧化物質(zhì)可抑制防止生物體內(nèi)不穩(wěn)定自由基造成體內(nèi)結(jié)構(gòu)遭到破壞，另一方面中草藥所含有效成分可提高機(jī)體內(nèi)其他抗氧化物的活性。鄒云28等介紹了中草藥多糖不同渠道作用機(jī)理，其中表明中草藥多糖對(duì)干擾素、補(bǔ)體系統(tǒng)等起激活作用。中草藥從

31、多渠道多方面綜合提高了機(jī)體的免疫能力。在本論文通過在在基礎(chǔ)飼料中添加太子參等中草藥（太子參、黨參、黃芪、甘草、枸杞、巴戟天）。飼喂大黃魚，通過分析基因的相對(duì)表達(dá)變化，率先分析中草藥對(duì)TRIM25基因表達(dá)的影響。不同實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)結(jié)果顯示，大黃魚在飼喂中草藥后，TRIM25基因的表達(dá)發(fā)生變化，除了E5組表達(dá)升高以外，其他組的表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的下降，尤其是E3組，下降的最大。TRIM25同屬TRIM家族之一在自身天然免疫中發(fā)揮重要作用，與該族大部分成員相同其用有三種象征結(jié)構(gòu)域。其中，RING結(jié)構(gòu)域參與鋅原子的融合并且促進(jìn)對(duì)靶蛋白的泛素化,增強(qiáng)蛋白的平穩(wěn)性；B-box結(jié)構(gòu)域作為TRIM蛋白的關(guān)鍵特

32、征結(jié)構(gòu)域能提高TRIM蛋白E3泛素連接酶活性，C末端的PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域通過與RIG-I共同作用使下游抗病毒信號(hào)明顯增加,從而干擾素的產(chǎn)生。在干擾素影響下可產(chǎn)生絕大部分TRIM族群蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在防御病原體方面起到關(guān)鍵作用。而中草藥多糖對(duì)干擾素起到了激活的作用，同時(shí)這也可能對(duì)TRIM族群蛋白的產(chǎn)生間接起了積極作用。4.3 總結(jié)中草藥從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出大黃魚經(jīng)中草藥添加飼喂后，其脾臟中TRIM25基因表達(dá)的除E5組表達(dá)升高外，其他組的表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的降低，但組別之間并沒有顯著性差異。說明中草藥含有的有效活性物質(zhì)雖然可能從多種渠道綜合提高了大黃魚機(jī)體的天然自身免疫，但因中草藥組分在不同

33、搭配組成不同比例的情況下可能存在一定的互斥作用導(dǎo)致部分有效活性組分效果不理想。但中草藥可有效提高機(jī)體天然免疫已經(jīng)諸方認(rèn)可，在尋求新型環(huán)保飼料添加劑的路上我們?nèi)沃氐肋h(yuǎn)，相信在不久的將來中草藥作為新型環(huán)保飼料添加劑會(huì)在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)大放異彩。參考文獻(xiàn)1 張彩蘭.福建省大黃魚養(yǎng)殖現(xiàn)狀分析與對(duì)策N.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,3(1).2 曹俊明,許丹丹,黃燕華.飼料中添加核苷酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦生長(zhǎng)組織生化組成及非特異性免疫功能的影響J.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2011,35(4):594-603.3 柯巧珍,余訓(xùn)凱,張永興.飼料中添加勝肽和益生菌對(duì)大黃魚生長(zhǎng)性能和體組成的影響J. 應(yīng)用海洋學(xué)學(xué)報(bào),2018,37(1

34、):141-145.4 王家敏. 復(fù)方中草藥對(duì)吉富羅非魚免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響D. 廣東海洋大學(xué), 2011.5 簡(jiǎn)紀(jì)常,吳灶和. Effects of Chinese herbal medicine on non- specific immunity of Jian common carp (Cyprinus Carpio var. Jian)%中草藥對(duì)建鯉非特異性免疫功能的影響J. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 017(002):114-119.6 Friedl R etal. Stimulation of nitric oxide synthesis by the aqueous ex

35、tract of Panaxginseng root in RAW 264. 7 cells. J Pharmacol, 2001, 134 (8): 63-70.7 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志M.北京:科學(xué)出版社,1996.8 薛蕾.黃芪太子參藥對(duì)調(diào)節(jié)脾虛小鼠免疫作用的實(shí)驗(yàn)研究D.貴陽中醫(yī)學(xué)院,2007.9 譚寧華,周俊.太子參中新環(huán)肽太子參環(huán)肽CJ.沈陽藥學(xué)院學(xué)報(bào),1995,17(1):60.10 李仕海,劉訓(xùn)紅.江蘇地產(chǎn)太子參中氨基酸及微量元素的分析J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2001,12(3):199-200.11 張炎達(dá),潘慧青,趙軍.太子參的生物學(xué)功能及其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用J.飼料營(yíng)養(yǎng),2018,(12):42-46.12 Yang C, You L, Yin X, etal. Heterophyllin B ameliorates lipopolysaccharide-i