哮喘大鼠肺組織Akt蛋白表達(dá)上調(diào)對(duì)IL-4,IL-12和IL-13的影響(一)

1、哮喘大鼠肺組織 Akt 蛋白表達(dá)上調(diào)對(duì) IL-4，IL-12和 IL-13的影響 (一) 作者：徐慧，戴元榮，夏曉東，吳成云，何建波【摘要】目的：研究 Akt 蛋白對(duì)支氣管哮喘大鼠 IL-4，IL-12和 IL-13 表 達(dá)的影響。方法：雄性 SD大鼠 24 只，隨機(jī)分為 3 組：對(duì)照組 (C 組)、 哮喘組(A組)、渥曼寧青霉素組 (Wortmannin ，W 組)，每組 8 只。以卵 白蛋白 (OVA)致敏和激發(fā)建立大鼠哮喘模型。各組大鼠于末次激發(fā)后 24h，放血處死。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA測(cè)) 定 BALF中 IL-4，IL-13和 IL-12 的濃度;免疫組化法測(cè)定肺組織中 p

2、-Akt蛋白的表達(dá) ;Westernblot 測(cè)定肺 組織勻漿中 p-Akt 蛋白的含量。結(jié)果： A 組 p-Akt 蛋白的表達(dá)明顯高于 C組，W 組 p-Akt 蛋白的表達(dá)低于 A組，但仍高于 C組;BALF中 IL-4，IL-13 的含量 A組明顯高于 C組，W 組 IL-4，IL-13的含量低于 A 組，但仍高 于 C組，BALF中 IL-12的含量 A組明顯低于 C組，W 組 IL-12的含量低 于 C組，但仍高于 A 組。結(jié)論：哮喘大鼠模型中出現(xiàn)了 Akt 蛋白的激 活，細(xì)胞因子失衡可能與 Akt 蛋白的激活有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】哮喘 ;細(xì)胞因子 ;磷脂酰肌醇 3 激酶;蛋白激酶 B Ab

3、stract:Objective:TostudytheeffectofproteinAktinasthmaairwayinflammat ionofasthmaticratsonthecytokineIL-4，IL-13andIL-12.Methods:Twenty-fourmaleadultSprague-Dawley(SD)ratswer erandomlydividedintothecontrolgroup(C)，stablishedtheasthmagroup(A)andWortmanningroup(W).Therats asthmamodelswereeinwhichratswer

4、esensitizedwithOVAandAl(OH)3andrepeatedlyexposedtoaerosolizedovalbumin.Theratsweresacrificedat24 hoursaferlastchallege ， MeanwhiletheconcentrationofIL-4 ， IL-13andIL-12inBALFweremeasuredwithELISA.Theexpressionsofp-Aktprotei nweredetectedwithImmuno-histochemistry(IHC).Thelevelofp-Aktinlungho mogenate

5、wasmeasuredwithWesternblot.Results:Theexpressionsofp-Aktpr oteinoflungtissuesinthegroupAwerehigherthanthoseingroupC ， andtheexpressionsofp-AktproteinofgroupWwerelowerthanthatofgroupA ， buthigherthanthatofgroupC.TheconcentrationofIL-4andIL-13inBALFofgroup AweresignificantlyhigherthanthatofgroupCandth

6、oseofgroupWwerelowerth anthoseofgroupAbuthigherthanthoseofgroupC.TheconcentrationofIL-12inB ALFofgroupAwassignificantlylowerthanthatofgroupCandthatofgroupWwasl owerthanthatofgroupC，buthigherthanthatofgroupA.Conclusion:TheproteinAktisactivatedintheasth maticratsmodel，andtheimbalanceofcytokineandtheai

7、rwayinflammationintheasthmaticrats modelmayberegulatedbyactivationofAkt.Keywords:asthma;cytokine;PI3K;PKB/Akt 細(xì)胞因子是參與非特異性免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的一組小分子多肽和糖 蛋白。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡可能是哮喘發(fā)病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一， Th2 優(yōu)勢(shì)應(yīng)答是哮喘發(fā)病的始動(dòng)和維持因素。哮喘患者體內(nèi)存在的受體信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)控著細(xì)胞因子、黏附分子和炎性遞質(zhì)對(duì)機(jī)體的作用。目 前的研究認(rèn)為， PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑在哮喘發(fā)生、 發(fā)展中起了重要作 用。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠哮喘模型， 測(cè)定肺組織中 p-A

8、kt 蛋白的表達(dá)及肺泡 灌洗液 (bronchoalveolarlavagefluid，BALF中) IL-4，IL-12和 IL-13的濃度， 進(jìn)一步明確哮喘的發(fā)病機(jī)制， 為尋找更有針對(duì)性的治療方法提供依據(jù)。1 材料和方法1.1 動(dòng)物分組及模型的建立 SPF級(jí)雄性 SD(Sprague-Dawlay大) 鼠 32 只， 由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 (SYXK浙( )2005-0061)，68 周齡，體重 (200 10，)g隨機(jī)分為對(duì)照組 (C 組)、哮喘組 (A 組 )和渥曼寧青霉素組 (Wortmannin ， W 組)，每組 8 只。 A 組和 W 組參照 Temelkovski等

9、1 的方法建立哮喘模型， 每日激發(fā)哮喘 1 次，共 8 周。C組霧化吸入生理 鹽水，W 組在模型組基礎(chǔ)上， 每次激發(fā)前半小時(shí)以 Wortmannin15g/kg 腹腔注射。1.2 標(biāo)本的采集與制備各組大鼠分別于末次激發(fā)后 24h 內(nèi)， 10%水合氯 醛溶液(5mL/kg)腹腔麻醉，打開胸腔，分離肺組織，結(jié)扎左支氣管，行 右支氣管灌洗，用 10mL的生理鹽水分 3 次注入，并輕輕按摩肺組織， 約 30s 后回收 BALF，回收率高于 80%，回收液 3000r/min 離心 15min， 取上清分裝保存于 -80備用。切取左肺肺門中上、中下肺段組織，浸 入 4%多聚甲醛固定， 5 6h 轉(zhuǎn)入 7

10、0%乙醇，石蠟包埋切片，備做免疫 組化染色。左肺肺門中上肺段組織迅速置于液氮， -80保存?zhèn)溆谩?1.3BALF中 IL-4，IL-13 和 IL-12 含量檢測(cè)應(yīng)用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)(ELISA分) 別檢測(cè) BALF中 IL-4，IL-13和 IL-12 的含量，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。1.4 免疫組化法檢測(cè)肺組織 p-Akt 蛋白的表達(dá)兔抗 p-Akt 多克隆抗體購(gòu) 于美國(guó) Cellsignal-ing公司， 稀釋度為 1:100，按 MaxvisionTM 法（福州邁 新生物技術(shù)有限公司 ）說明書操作步驟進(jìn)行操作。對(duì)照試驗(yàn)選用 PBS代 替一抗，其他步驟相同。用 image

11、-proplus 圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性部位 的平均吸光度。1.5Westernblot 法檢測(cè)肺組織 p-Akt 表達(dá) 取-80保存的肺組織 100mg，PBS潤(rùn)洗，加預(yù)冷的 Western 及 IP 裂 解液，勻漿，冰后離心 3min，取上清，超聲 5s4次破碎細(xì)胞核，超速 離心后收集上清。 BCA 法測(cè)定肺組織勻漿總蛋白濃度。 蛋白質(zhì)電 泳和印跡電轉(zhuǎn)移： SDS聚- 丙烯酰胺凝膠電泳配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的分離 膠和 5%的濃縮膠，電泳條件：恒壓，先 80V，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠后 改電壓為 120V，直至溴酚藍(lán)跑到凝膠底部。 電泳結(jié)束后進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移， 應(yīng)用 NC膜 300mA 恒流電轉(zhuǎn) 6

12、0min，轉(zhuǎn)移完畢后分別用立春紅和考馬 斯亮蘭染膜和膠。 Westernblot 分析：采用 5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封 閉 60min， TBST洗膜，加入 5%脫脂牛奶稀釋的兔抗大鼠 p-Akt 多克隆 抗體 （1:800），4過夜，次日加入 5%脫脂牛奶稀釋的辣根過氧化物酶 （HRP標(biāo)） 記的鼠抗兔二抗 （1:1000），同時(shí)加入 GAPDH（1:10000，） 洗膜后， ECL顯色、膠片曝光，用 QuantityOne 凝膠軟件分析系統(tǒng)分析計(jì)算其灰 度值。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法組間比較采用單因素方差分析， 兩兩比較方差齊者用 LSD 檢驗(yàn)，方差不齊采用 Dunnett sT檢3 驗(yàn)，兩變量

13、的相關(guān)分析用 Pearson直線相關(guān)分析法。2 結(jié)果2.1各組大鼠 BALF液中 IL-4，IL-13和 IL-12濃度比較 BALF中 IL-4，IL-13 的含量 A組明顯高于 C組，W 組 IL-4，IL-13的含量低于 A組，但仍高 于 C組;BALF中 IL-12的含量 A組明顯低于 C組，W 組 IL-12的含量低于 C組，但仍高于 A 組。詳見表 1。2.2 各組大鼠肺組織 p-Akt 蛋白免疫組化檢測(cè)結(jié)果 p-Akt 蛋白表達(dá)于細(xì) 胞漿和細(xì)胞核，主要表達(dá)的細(xì)胞有支氣管上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞 及散在的炎性細(xì)胞。 免疫組化結(jié)果顯示， A組有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)， 而 C組只 有極少量表達(dá)， A 組表達(dá)量明顯高于 C 組(P0.01);W 組有陽(yáng)性表達(dá)，但 較 A 組弱， p-Akt 活化量明顯低于 A 組(P0.01)，高于 C 組(P0.01)。詳見 表 2。2.3 各組大鼠肺組織 p-Akt 的 Westernb