分子醫(yī)學技能：淋巴細胞的分離、計數(shù)

1、淋巴細胞的分離、計數(shù)淋巴細胞的分離、計數(shù) 實驗?zāi)康暮鸵髮嶒災(zāi)康暮鸵?l 掌握 外周血單個核細胞分離的方法外周血單個核細胞分離的方法 l 掌握 細胞計數(shù)的方法細胞計數(shù)的方法 實驗原理實驗原理 外周血中細胞種類外周血中細胞種類 細胞細胞密度密度 紅細胞和多形核白細胞 1.092 淋巴細胞和單核細胞淋巴細胞和單核細胞（PBMC） 1.075-1.092 血小板 1.030-1.035 葡聚糖葡聚糖泛影葡胺密度梯度離心法：泛影葡胺密度梯度離心法： 根據(jù)外周血中各種血細胞比重不同使不同密度的 細胞呈梯度分布，從而分離出PBMC。 實驗材料實驗材料 1. 肝素抗凝血肝素抗凝血 2. Hanks液液 3

2、. 淋巴細胞分離液（淋巴細胞分離液（F-H) 4. 水平離心機，加樣槍水平離心機，加樣槍 5. 顯微鏡，吸管顯微鏡，吸管 6. 細胞計數(shù)板，臺盼藍計數(shù)液細胞計數(shù)板，臺盼藍計數(shù)液 實驗方案實驗方案 抽取外周血抽取外周血 分離分離單個核細胞（淋巴細胞單個核細胞（淋巴細胞 和單核細胞）（和單核細胞）（PBMC） 細胞計數(shù)細胞計數(shù) 用Hanks液重懸細胞 取10ul細胞懸液與90ul白細胞 計數(shù)液或臺盼蘭計數(shù)液混合 取10ul于細胞計數(shù)板上 細胞計數(shù) 實驗步驟實驗步驟 肝素抗凝靜脈血1.5ml 加加1.5ml Hanks液稀釋液稀釋 置于2ml淋巴細胞分離液上 ( (交界液面：一定交界液面：一定不要打

3、亂不要打亂) ) 稀釋后的稀釋后的 抗凝血抗凝血 淋巴細胞淋巴細胞 分離液分離液 注意注意：稀釋的肝素抗凝血，：稀釋的肝素抗凝血，沿管壁輕沿管壁輕 輕疊加于輕疊加于分離液上，使兩者形成一個分離液上，使兩者形成一個 清晰地界面。清晰地界面。 用Hanks液洗、離 心 (1000rpm，5min) 重復(fù)2次 血漿血漿 分層液分層液 紅細胞紅細胞 粒細胞粒細胞 離心（2000rpm，25min） 淋巴細胞與淋巴細胞與 單核細胞層單核細胞層 注意注意：細胞經(jīng)離心分層：細胞經(jīng)離心分層 后，緩慢小心吸取，后，緩慢小心吸取，勿勿 打破形成的細胞層打破形成的細胞層。 細胞計數(shù)板 細胞計數(shù) 原則：原則： 數(shù)上不

4、數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右 長長1mm寬寬1mm 結(jié)果計算結(jié)果計算 2 2個大方格內(nèi)細胞總數(shù) 單個核細胞濃度（細胞數(shù)/ml) 10104 410 = =(稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)） 活細胞百分率 = = 活細胞數(shù) 細胞總數(shù) 100% 細胞活力檢測：（死細胞被染成藍色，活細胞不著色） 細胞數(shù)量： 方法評價方法評價 u 純度在90%以上 u 淋巴細胞約占90-95% u 細胞收獲率可達80-90% u 活細胞百分率在95%以上 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞： 細胞計數(shù)的儀器 血細胞分析儀，臨床常用血細胞分析儀，臨床常用 裝有自動顯微鏡觀察系統(tǒng)裝有自動顯微鏡觀察系統(tǒng) 自動細胞計數(shù)儀自動細胞計數(shù)儀 注意事項注意事項 l 請將請將帶血帶血的試管，吸管收集放置于實驗室后的的試管，吸管收集放置于實驗室后的紅紅 色消毒盆色消毒盆中。中。 l 值日生負責收集加樣槍，