臨床微生物檢驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)三

1、臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)臨床微生物學(xué)檢驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)第三周實(shí)驗(yàn)第三周 目的要求目的要求 掌握從掌握從膿標(biāo)本膿標(biāo)本中分離中分離鑒定化膿性球菌鑒定化膿性球菌的程序及鑒的程序及鑒 定方法定方法 掌握金黃色葡萄球菌、鏈球菌屬（掌握金黃色葡萄球菌、鏈球菌屬（A群化膿性鏈群化膿性鏈 球菌、球菌、B群鏈球菌和肺炎鏈球菌）、腸球菌和卡群鏈球菌和肺炎鏈球菌）、腸球菌和卡 他莫拉菌的他莫拉菌的菌落特點(diǎn)菌落特點(diǎn)、菌體形態(tài)、鏡下排列和染菌體形態(tài)、鏡下排列和染 色性色性以及以及常用的鑒定試驗(yàn)原理、方法常用的鑒定試驗(yàn)原理、方法 掌握淋病奈瑟菌革蘭染色鏡下形態(tài)、排列與染色掌握淋病奈瑟菌革蘭染色鏡下形態(tài)、排列與染色 特點(diǎn)特點(diǎn) 掌握抗鏈球菌

2、溶血素掌握抗鏈球菌溶血素“O”試驗(yàn)原理、方法及結(jié)果試驗(yàn)原理、方法及結(jié)果 觀察觀察 第一天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第一天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1.膿標(biāo)本膿標(biāo)本(棉拭子棉拭子)：每人做每人做 接種血平板接種血平板 （1個(gè)大血平個(gè)大血平/人）、涂片染色人）、涂片染色 2.腸球菌主要鑒定試驗(yàn)?zāi)c球菌主要鑒定試驗(yàn)：每人做每人做 菌落觀察、涂片革蘭染色顯微鏡觀察、觸酶、菌落觀察、涂片革蘭染色顯微鏡觀察、觸酶、 6.5%NaCl、膽汁七葉苷、膽汁七葉苷 3. 肺炎鏈球菌主要鑒定試驗(yàn)肺炎鏈球菌主要鑒定試驗(yàn)：每人做每人做 菌落觀察、涂片革蘭染色顯微鏡觀察、觸酶、菌落觀察、涂片革蘭染色顯微鏡觀察、觸酶、 OP試驗(yàn)（試驗(yàn)（1個(gè)小血平個(gè)小血平/人

3、）、血清菊糖人）、血清菊糖 試劑試劑 觸酶試劑、血清菊糖、觸酶試劑、血清菊糖、6.5%NaCl6.5%NaCl、膽汁七葉、膽汁七葉 苷生化微量管、苷生化微量管、OPOP紙片、紙片、 菌種菌種 模擬膿標(biāo)本、肺炎鏈球菌、腸球菌、模擬膿標(biāo)本、肺炎鏈球菌、腸球菌、A群及群及B群鏈球菌群鏈球菌 其他其他 血平板（大和小每人各一個(gè)）、血平板（大和小每人各一個(gè)）、玻片玻片 、接種針、酒精燈、接種針、酒精燈 膿汁、分泌物膿汁、分泌物 直接涂片直接涂片 血平板血平板 革蘭染色革蘭染色 可疑菌落可疑菌落 鏡檢鏡檢 涂片革蘭陽(yáng)性球菌涂片革蘭陽(yáng)性球菌 觸酶（觸酶（+ +） 觸酶（觸酶（- -） 初步報(bào)告初步報(bào)告 耐熱

4、核酸酶耐熱核酸酶 血漿凝固酶血漿凝固酶 甘露醇甘露醇 DNADNA酶酶 其他生化反應(yīng)其他生化反應(yīng) 抗酸染色等抗酸染色等 溫度、氣體環(huán)境等溫度、氣體環(huán)境等 巧克力平板等巧克力平板等 先接種平板后涂片先接種平板后涂片 革蘭陽(yáng)性球菌，觸酶革蘭陽(yáng)性球菌，觸酶(-)(-) 血清學(xué)血清學(xué) 桿菌肽桿菌肽 CAMP Optochin CAMP Optochin 膽汁膽汁 膽膽 6.5%6.5% 鑒鑒 定定 溶菌溶菌 七七 NaClNaCl 試劑盒試劑盒 A A群群 B B群群 A A、B B、 化膿化膿 無(wú)乳無(wú)乳 肺炎肺炎 腸腸 C C、D D、 性鏈性鏈 鏈球鏈球 鏈球鏈球 球球 F F、G G群群 球菌球

5、菌 菌菌 菌菌 菌菌 PYR 馬尿酸鹽水解馬尿酸鹽水解 腸球菌主要鑒定特征腸球菌主要鑒定特征 血平板上菌落特征：血平板上菌落特征：（每人均觀察）（每人均觀察） 菌落灰白色、不透明、表面光滑的小菌落，菌落灰白色、不透明、表面光滑的小菌落，無(wú)溶無(wú)溶 血環(huán)或出現(xiàn)血環(huán)或出現(xiàn)溶血環(huán)溶血環(huán)。 革蘭染色革蘭染色： （每人均做）（每人均做） 革蘭陽(yáng)性球菌，卵圓形，單個(gè)、成雙或短鏈排列。革蘭陽(yáng)性球菌，卵圓形，單個(gè)、成雙或短鏈排列。 生化反應(yīng)生化反應(yīng)：觸酶（：觸酶（-） 膽汁七葉苷（膽汁七葉苷（+） 6.5%NaCl（+） （每人均做）（每人均做） 溶血溶血 腸球菌腸球菌 可表現(xiàn) 為溶血溶血 腸球菌 可表現(xiàn) 為不

6、溶不溶 血血 糞腸球菌革蘭染色糞腸球菌革蘭染色 （1000） 觸酶試驗(yàn)：玻片法，腸球菌觸酶（觸酶試驗(yàn)：玻片法，腸球菌觸酶（-） 膽汁七葉苷試驗(yàn)?zāi)懼呷~苷試驗(yàn) 陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性 6.5%NaCl 6.5%NaCl 生長(zhǎng)試驗(yàn)生長(zhǎng)試驗(yàn) 陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性 溴甲酚紫溴甲酚紫 肺炎鏈球菌主要鑒定特征肺炎鏈球菌主要鑒定特征 血平板上菌落特征血平板上菌落特征：（每人均觀察）（每人均觀察） 菌落細(xì)小、周圍有草綠色溶血環(huán)，菌落細(xì)小、周圍有草綠色溶血環(huán)，48小時(shí)后，由小時(shí)后，由 于菌落自溶，呈現(xiàn)于菌落自溶，呈現(xiàn)“臍窩狀臍窩狀” 革蘭染色革蘭染色： （每人均做）（每人均做） 革蘭陽(yáng)性球菌，矛尖狀，成雙排列。革蘭陽(yáng)性球

7、菌，矛尖狀，成雙排列。 在人和動(dòng)物體內(nèi)形成莢膜在人和動(dòng)物體內(nèi)形成莢膜 生化反應(yīng)：生化反應(yīng)：觸酶（觸酶（-） Optochin敏感試驗(yàn)（敏感試驗(yàn)（+） （每人均做）（每人均做） 血清菊糖分解試驗(yàn)（血清菊糖分解試驗(yàn)（+） 膽汁溶菌試驗(yàn)（膽汁溶菌試驗(yàn)（+） 肺炎鏈球菌（血平板）肺炎鏈球菌（血平板） 肺炎鏈球菌（血平板）肺炎鏈球菌（血平板） 肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌“臍窩狀臍窩狀”菌落菌落 肺炎鏈球菌革蘭染色肺炎鏈球菌革蘭染色 （1000） 肺炎鏈球菌革蘭染色肺炎鏈球菌革蘭染色 （1000） 肺炎鏈球菌 肺炎鏈球菌莢膜肺炎鏈球菌莢膜 （1000） 觸酶試驗(yàn)：玻片法，肺雙觸酶（觸酶試驗(yàn)：玻片法，肺雙觸酶（-

8、） OPOP試驗(yàn)：試驗(yàn)： 操作：操作： 用接種環(huán)取待檢菌，密集劃線于用接種環(huán)取待檢菌，密集劃線于 血平板上，再用鑷子貼上血平板上，再用鑷子貼上OPOP紙片。紙片。 結(jié)果觀察：量抑菌環(huán)直徑結(jié)果觀察：量抑菌環(huán)直徑=14=14 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 紙片貼上，紙片貼上，不要再移動(dòng)不要再移動(dòng)。 血平板置于血平板置于COCO2 2環(huán)境培養(yǎng)。環(huán)境培養(yǎng)。 血清菊糖試驗(yàn)血清菊糖試驗(yàn) 陰性陰性 陽(yáng)性陽(yáng)性 中性紅中性紅 第一天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第一天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1.膿標(biāo)本膿標(biāo)本(棉拭子棉拭子)：每人做每人做 分區(qū)劃線接種血平板分區(qū)劃線接種血平板 （1個(gè)大血平個(gè)大血平/人）人） 棉拭子涂片革蘭染色顯微鏡觀察棉拭子涂片革蘭染色顯

9、微鏡觀察 2.腸球菌主要鑒定試驗(yàn)：腸球菌主要鑒定試驗(yàn)：每人做每人做 菌落形態(tài)觀察；涂片革蘭染色顯微鏡觀察；菌落形態(tài)觀察；涂片革蘭染色顯微鏡觀察； 觸酶試驗(yàn)；觸酶試驗(yàn)；6.5%NaCl生長(zhǎng)和膽汁七葉苷試驗(yàn)（微生長(zhǎng)和膽汁七葉苷試驗(yàn)（微 量管接種）量管接種） 3. 肺炎鏈球菌主要鑒定試驗(yàn)：肺炎鏈球菌主要鑒定試驗(yàn)：每人做每人做 菌落形態(tài)觀察；涂片革蘭染色顯微鏡觀察；菌落形態(tài)觀察；涂片革蘭染色顯微鏡觀察； 觸酶試驗(yàn)；觸酶試驗(yàn)；OP試驗(yàn)（試驗(yàn)（1個(gè)小血平個(gè)小血平/人）；血清菊人）；血清菊 糖（微量管接種）糖（微量管接種） 第二天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第二天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1.1.第一天實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察：腸球菌第一天實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察：

10、腸球菌 肺雙肺雙 2.棉拭子標(biāo)本鑒定棉拭子標(biāo)本鑒定：觀察菌落并涂片染色觀察菌落并涂片染色、觸酶試驗(yàn)觸酶試驗(yàn)， 若陽(yáng)性若陽(yáng)性 接種甘露醇微量管、接種甘露醇微量管、DNADNA酶試驗(yàn)（酶試驗(yàn)（2 2平板平板/ / 組，組，點(diǎn)種點(diǎn)種）、耐熱核酸酶試驗(yàn)（）、耐熱核酸酶試驗(yàn)（2 2平板平板/ /組）組） 血漿血漿 凝固酶試驗(yàn)（每人做凝固酶試驗(yàn)（每人做-玻片法、試管法）玻片法、試管法） 3.3.肺雙：膽汁溶菌試驗(yàn)（平板法）肺雙：膽汁溶菌試驗(yàn)（平板法） 4.A4.A群鏈球菌：桿菌肽試驗(yàn)（群鏈球菌：桿菌肽試驗(yàn)（1 1個(gè)小血平個(gè)小血平/ /人）人） 5.B5.B群鏈球菌：群鏈球菌：CAMPCAMP試驗(yàn)（試驗(yàn)（1

11、 1個(gè)大血平個(gè)大血平/ /人）人） -以上試驗(yàn)每人均做以上試驗(yàn)每人均做 膿汁、分泌物膿汁、分泌物 直接涂片（直接涂片（第一天第一天） 接種血平板接種血平板 （第一天第一天） 革蘭染色革蘭染色 觀察菌落（觀察菌落（第二天第二天） 鏡檢鏡檢 涂片革蘭陽(yáng)性球菌涂片革蘭陽(yáng)性球菌 觸酶（觸酶（+ +） 觸酶（觸酶（- -）（）（第二天第二天） 初步報(bào)告初步報(bào)告 耐熱核酸酶耐熱核酸酶 血漿凝固酶血漿凝固酶 甘露醇甘露醇 DNADNA酶酶 其他生化反應(yīng)其他生化反應(yīng) （第二天做第二天做） 取菌落涂片革蘭染色 取菌落觸酶試取菌落觸酶試 驗(yàn)驗(yàn) 觸酶試驗(yàn)：玻片法觸酶試驗(yàn)：玻片法 6.5%NaCl 6.5%NaCl生

12、長(zhǎng)試驗(yàn)生長(zhǎng)試驗(yàn) 陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性 溴甲酚紫溴甲酚紫 膽汁七葉苷膽汁七葉苷 陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性 血清菊糖分解試驗(yàn)血清菊糖分解試驗(yàn) 陰性陰性 陽(yáng)性陽(yáng)性 中性紅中性紅 18mm OPTOCHIN OPTOCHIN試驗(yàn)：試驗(yàn)： 抑菌環(huán)直徑抑菌環(huán)直徑=14 =14 敏感敏感 桿菌肽試驗(yàn)桿菌肽試驗(yàn) 密集劃線密集劃線 A群鏈球菌群鏈球菌 桿菌肽桿菌肽 桿桿 桿桿 密集劃線密集劃線 B群鏈球菌群鏈球菌 -對(duì)照對(duì)照 35培養(yǎng)培養(yǎng)24h 桿菌肽試驗(yàn)桿菌肽試驗(yàn)： 抑菌環(huán)直徑抑菌環(huán)直徑=10 =10 敏感敏感 14mm CAMP試驗(yàn)試驗(yàn) 金葡菌金葡菌 B B鏈鏈 陰性對(duì)照（陰性對(duì)照（A群鏈球菌）群鏈球菌） 兩線不得相接

13、，兩線不得相接， 間隔約間隔約3 34mm4mm。 35培養(yǎng)培養(yǎng)24h 玻片法：金黃色葡萄球菌表面有結(jié)合的凝固酶（聚玻片法：金黃色葡萄球菌表面有結(jié)合的凝固酶（聚 集因子），與血漿中的纖維蛋白原交聯(lián)使集因子），與血漿中的纖維蛋白原交聯(lián)使 菌體快速凝聚。菌體快速凝聚。 試管法：細(xì)菌分泌到菌體外的凝固酶被血漿中的協(xié)試管法：細(xì)菌分泌到菌體外的凝固酶被血漿中的協(xié) 同因子激活形成復(fù)合物，再使纖維蛋白原同因子激活形成復(fù)合物，再使纖維蛋白原 轉(zhuǎn)變成纖維蛋白轉(zhuǎn)變成纖維蛋白。 血漿凝固酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn) 血漿凝固酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn) 玻片法：玻片法： 1.1.取數(shù)環(huán)生理鹽水于干凈玻片一端，取取數(shù)環(huán)生理鹽水于干凈

14、玻片一端，取3-43-4環(huán)血漿于玻片另一端。環(huán)血漿于玻片另一端。 2.2.用接種環(huán)取葡萄球菌用接種環(huán)取葡萄球菌5 51010個(gè)菌落在生理鹽水內(nèi)研磨成細(xì)菌懸液（個(gè)菌落在生理鹽水內(nèi)研磨成細(xì)菌懸液（濃菌液濃菌液），）， 然后取此懸液然后取此懸液2-42-4環(huán)與血漿混勻。環(huán)與血漿混勻。 3.103.10秒內(nèi)觀察結(jié)果，有凝塊出現(xiàn)，即為陽(yáng)性；若無(wú)凝塊出現(xiàn)，則為陰性秒內(nèi)觀察結(jié)果，有凝塊出現(xiàn)，即為陽(yáng)性；若無(wú)凝塊出現(xiàn)，則為陰性 試管法：試管法： 1.1.試管中加入試管中加入新鮮新鮮血漿（血漿（EDTAEDTA抗凝）抗凝）0.5ml0.5ml，取葡萄球菌，取葡萄球菌5-65-6個(gè)菌落，在個(gè)菌落，在 試管中充分研磨

15、混勻。試管中充分研磨混勻。 2.2.將試管置將試管置3737孵育，每隔孵育，每隔3030分鐘觀察一次結(jié)果。分鐘觀察一次結(jié)果。 3.3.血漿凝固呈膠凍狀血漿凝固呈膠凍狀, ,為陽(yáng)性為陽(yáng)性; ;若不凝固仍流動(dòng)若不凝固仍流動(dòng), ,為陰性為陰性 血漿凝固酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn) 耐熱核酸酶試驗(yàn)?zāi)蜔岷怂崦冈囼?yàn) 原理：原理： 平板劃線法：平板劃線法： 24h24h培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)的肉湯 沸水處理沸水處理15min15min（已處理好已處理好） 接種環(huán)劃線刺種接種環(huán)劃線刺種在甲苯胺藍(lán)在甲苯胺藍(lán)DNADNA平板中平板中 3737培養(yǎng)培養(yǎng)24h,24h,觀察結(jié)果觀察結(jié)果 陽(yáng)性：劃線刺種區(qū)出現(xiàn)陽(yáng)性：劃線刺種區(qū)出現(xiàn)粉紅色

16、粉紅色 膽汁溶菌試驗(yàn)?zāi)懼芫囼?yàn) 滴加滴加100g/L去氧膽酸鈉于菌落上，去氧膽酸鈉于菌落上，35 1530min。 結(jié)果：平板上菌落消失結(jié)果：平板上菌落消失+ 第三天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第三天實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1.1.觀察昨天實(shí)驗(yàn)結(jié)果：桿菌肽試驗(yàn)觀察昨天實(shí)驗(yàn)結(jié)果：桿菌肽試驗(yàn) CAMPCAMP試驗(yàn)試驗(yàn) 膿標(biāo)本鑒定結(jié)果膿標(biāo)本鑒定結(jié)果 2.2.卡他莫拉菌：菌落形態(tài)觀察、卡他莫拉菌：菌落形態(tài)觀察、涂片染色涂片染色、氧化酶、氧化酶 3.3.抗鏈球菌溶血素抗鏈球菌溶血素“O O”試驗(yàn)（膠乳法）試驗(yàn)（膠乳法） 4.4.淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌涂片革蘭染色涂片革蘭染色：示教：示教 5.5.A A鏈和鏈和B B鏈：鏈：涂片革蘭染色；

17、涂片革蘭染色；觸酶試驗(yàn)觸酶試驗(yàn) （B B群鏈球菌即無(wú)乳鏈球菌）群鏈球菌即無(wú)乳鏈球菌） -以上試驗(yàn)每人均做以上試驗(yàn)每人均做 桿菌肽試驗(yàn)桿菌肽試驗(yàn)bacitracin test ： 抑菌環(huán)直徑抑菌環(huán)直徑=10 =10 敏感敏感 14mm CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性試驗(yàn)陽(yáng)性 CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性 CAMP試驗(yàn)陰性試驗(yàn)陰性 膿汁、分泌物膿汁、分泌物 直接涂片直接涂片 （第一天第一天） 接種血平板接種血平板 （第一天第一天） 革蘭染色革蘭染色 觀察菌落觀察菌落 （第二天第二天） 鏡檢鏡檢 涂片革蘭陽(yáng)性球菌（涂片革蘭陽(yáng)性球菌（第二天第二天） 觸酶（觸酶（+ +） 觸酶（觸酶（- -）（）（第二天第二

18、天） 初步報(bào)告初步報(bào)告 耐熱核酸酶耐熱核酸酶 血漿凝固酶血漿凝固酶 甘露醇甘露醇 DNADNA酶酶 其他生化反應(yīng)其他生化反應(yīng) （第二天第二天） 革蘭陽(yáng)性球菌，觸酶革蘭陽(yáng)性球菌，觸酶(-)(-) 血清學(xué)血清學(xué) 桿菌肽桿菌肽 CAMP Optochin CAMP Optochin 膽汁膽汁 膽膽 6.5%6.5% 鑒鑒 定定 溶菌溶菌 七七 NaClNaCl 試劑盒試劑盒 A A群群 B B群群 A A、B B、 化膿化膿 無(wú)乳無(wú)乳 肺炎肺炎 腸腸 C C、D D、 性鏈性鏈 鏈球鏈球 鏈球鏈球 球球 F F、G G群群 球菌球菌 菌菌 菌菌 菌菌 甘露醇試驗(yàn)甘露醇試驗(yàn) 陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性 溴甲酚紫

19、溴甲酚紫 血漿凝固酶試驗(yàn)試管法陽(yáng)性血漿凝固酶試驗(yàn)試管法陽(yáng)性 血漿凝固酶試驗(yàn)玻片法血漿凝固酶試驗(yàn)玻片法 耐熱核酸酶試驗(yàn)?zāi)蜔岷怂崦冈囼?yàn) 平板劃線法：平板劃線法： 接種環(huán)劃線穿刺或點(diǎn)種穿刺在甲苯胺藍(lán)接種環(huán)劃線穿刺或點(diǎn)種穿刺在甲苯胺藍(lán)DNADNA平板平板 3737培養(yǎng)培養(yǎng)24h,24h,觀察結(jié)果觀察結(jié)果 劃線或點(diǎn)種區(qū)出現(xiàn)劃線或點(diǎn)種區(qū)出現(xiàn)粉紅色粉紅色 錯(cuò)誤結(jié)果錯(cuò)誤結(jié)果結(jié)果正確結(jié)果正確 金葡菌DNA酶試驗(yàn)陽(yáng)性 巧克力平板：巧克力平板：淺棕色、淺棕色、 不透明、光滑、不透明、光滑、 凸起的菌落凸起的菌落 可用接種環(huán)完整可用接種環(huán)完整 推過(guò)平板表面推過(guò)平板表面 卡他莫拉菌卡他莫拉菌 卡他莫拉菌（血平板，培養(yǎng)卡他