一種CAST基因過表達(dá)小鼠建立

1、鈣蛋白酶抑制蛋白基因過表達(dá)Balb/C小鼠的繁育及鑒定虞 勇，李明輝，劉桂劍，李冰玉，鄒云增，陳瑞珍*（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心血管病研究所實(shí)驗(yàn)室，上海 200032）收稿日期2016-02-03 接受日期2016-06-04基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金(31070786). Supported by National Natural Science Foundation of China（31070786）. 作者簡(jiǎn)介虞 勇，主管技師. E-mail: yu.yong1zs-*通信作者(Corresponding author). Tel:8543, E-mail: c

2、hen.ruizhenzs-摘要目的：建立Balb/C小鼠遺傳背景的鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin, CAST）基因過表達(dá)小鼠的培育方法，并探討堿性裂解液提取基因組DNA在子代鼠基因型鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。方法：將雄性C57BL/6-CAST+/-轉(zhuǎn)基因小鼠與雌性Balb/C野生型小鼠雜交，子代小鼠中取雄性鑒定為CAST+/-雜合子小鼠與雌性Balb/C野生型小鼠雜交，連續(xù)雜交直至消除C57BL/6小鼠遺傳背景。取子代小鼠鼠尾組織，采用堿性裂解液提取基因組DNA，PCR法擴(kuò)增CAST基因片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。采用柯薩奇B3病毒（CVB3）感染Balb/C-CAST-/-小鼠以建立

3、急性病毒性心肌炎小鼠模型。結(jié)果：C57BL/6-CAST+/-轉(zhuǎn)基因小鼠與雌性Balb/C野生型小鼠連續(xù)雜交10代可消除C57BL/6小鼠遺傳背景。采用堿性裂解液提取的基因組DNA數(shù)量、純度能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要，且產(chǎn)物大小與目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST-/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。結(jié)論：成功建立Balb/C-CAST基因過表達(dá)小鼠，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)；堿性裂解液提取基因組DNA簡(jiǎn)單、高效，值得推廣。關(guān)鍵詞鈣離子依賴性蛋白酶；鈣蛋白酶抑制蛋白；柯薩奇B3病毒；轉(zhuǎn)基因；基因型鑒定中圖分類號(hào) R 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 ABreeding of calpastatin gene ove

4、rexpression and identification in Balb/C mice YU Yong, LI Ming-hui, LIU Gui-jian, LI Bing-yu, ZOU Yun-zeng, CHEN Rui-zhen*Laboratory of cardiovascular disease research institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China AbstractObjective：To establish methods for the breeding of c

5、alpastatin (CAST） gene overexpression mice on Balb/C background and to investigate the application of alkaline lysis solution extracted genomic DNA in genotyping. Methods： Tg-C57BL/6-CAST+/- male mice were backcrossed to Balb/C wild type female mice. In the filial generations, CAST+/- heterozygous m

6、ale mice were backcrossed to Balb/C wild type female mice for more than 10 generations to remove C57BL/6 genetic background. Then, Balb/C-CAST-/- mice from the same brood were infected with coxsakievirus（CVB3）to establish the mouse model of acute viral myocarditis.Genomic DNA was isolated from filia

7、l generation mice tails. Then CAST gene fragment was amplified by PCR. Results：The reproduction of the filial generations with different phenotypes(CAST+/-, CAST-/-) is basically in accordance with Mondels Genetics Law. To remove C57BL/6 genetic background,CAST+/- heterozygous male mice should be ba

8、ckcrossed to Balb/C wild type female mice for at least 10 generations. the Mouse model of VMC with Balb/C-CAST-/- mice was established. The agarose electrophoresis showed that the molecular weight of PCR products were consisted with that of objective gene fragments. Conclusions：Calpastatin gene over

9、expression transgenic mice on Balb/C background is a comparatively ideal experimental animal to study the interaction between calpain and CAST in the context of viral myocarditis and other diseases.The method of DNA extraction in our study can isolate genomic DNA from large number of tissue samples

10、of mice which providing a solution for genotyping.Key Words calpain；calpastatin；coxsakie virus group B type3（CVB3）; transgenic；genotypingCalpain是一類主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白酶，激活后能通過有限酶切作用切割其底物，參與包括心血管疾病在內(nèi)的多種病理過程1-2。研究3發(fā)現(xiàn)，Calpain在急性病毒性心肌炎（VMC）發(fā)病過程中被激活，介導(dǎo)柯薩奇B3病毒（CVB3）直接感染導(dǎo)致的心肌損傷作用。在許多炎癥性疾病模型的研究中，calpain抑制

11、劑表現(xiàn)出相應(yīng)的器官保護(hù)作用4。Calpastatin（CAST）是Calpain的內(nèi)源性抑制劑，在心肌細(xì)胞內(nèi)兩者共定位，CAST負(fù)向調(diào)控Calpain的活性，在體內(nèi)及體外過表達(dá)CAST均可抑制Calpain活性5。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型常用于致病機(jī)制的探討及治療藥物的篩選，2011年本研究室從加拿大西安大略大學(xué)病理生理學(xué)系彭天慶教授實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了C57BL/6-CAST基因過表達(dá)小鼠。因此，本研究以C57BL/6-CAST基因過表達(dá)小鼠為基礎(chǔ)，嘗試建立穩(wěn)定的Balb/C小鼠遺傳背景CAST基因過表達(dá)模型，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 主要材料及試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6-CAST+/-雜

12、合子轉(zhuǎn)基因小鼠雌、雄各1只（56周齡）引進(jìn)于加拿大西安大略大學(xué)病理生理學(xué)系彭天慶教授實(shí)驗(yàn)室，Balb/C雌性野生型小鼠（56周齡）購于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。試劑：2PCR Master mix、DNA Marker購自Thermo Fisher公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；小鼠cTnI ELISA試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司； CVB3（Nancy株，由本實(shí)驗(yàn)室保存復(fù)制），在Vero細(xì)胞上復(fù)制?；蚪MDNA裂解液配制：溶液A成分為25 mmol/L NaOH，0.2 mmol/L EDTA；溶液B成分為40 mmol/L Tris-HCl，pH值5.0。小鼠組織基因組DN

13、A提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。儀器：Thermo Fisher公司高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；美國Bio-Rad公司PCR儀、電泳槽、ChemiDoc MP System 全能型成像系統(tǒng)；Eppendorf紫外分光光度計(jì)。1.2 Balb/C遺傳背景CAST基因過表達(dá)小鼠的培育 轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，光照及黑暗每隔12 h循環(huán)，恒溫恒濕，自由飲水進(jìn)食，自然交配。采用1雄配3雌合籠的方法將雄性C57BL/6-CAST+/-小鼠與雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖，F(xiàn)1代子鼠在3周齡時(shí)與親代分離，提取鼠尾DNA，用PCR方法鑒定出CAST基因表達(dá)陽性小鼠，將雄性CAST基因表

14、達(dá)陽性小鼠與雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖，獲得的F2代雄性CAST+/-小鼠繼續(xù)與雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖，連續(xù)交配直至可獲得遺傳背景穩(wěn)定的Balb/C- CAST基因過表達(dá)小鼠，具體繁殖方案見圖1。C57-CAST+/- Balb/CP100%C57BL/60%Balb/CCAST+/-CAST+/-Balb/CF150%C57BL/650%Balb/CCAST+/-N225%C57BL/675%Balb/CCAST+/-Balb/CCAST+/-N100.1%C57BL/699.9%Balb/C圖1 Balb/C遺傳背景CAST基因過表達(dá)小鼠繁育方法此圖不清楚，請(qǐng)?zhí)峁┣逦?/p>

15、圖片！1.3堿性裂解液提取子代小鼠基因組DNA及PCR鑒定 子代小鼠斷奶打耳號(hào)標(biāo)記后剪取12 mm鼠尾，采用堿性裂解液法提取DNA，放入1.5 mL EP管，加入50 L溶液A，于金屬浴上95孵育40 min，室溫放置1.5 h，再加入50 L溶液B，充分震蕩混合，4 10 000g離心5 min，放4冰箱待用。基因組DNA提取試劑盒（北京天根）操作按說明書進(jìn)行?；蚪MDNA擴(kuò)增：CAST基因引物上游，5-GTT GGC TTA GGC TGC TTT TCG T-3；下游，5-CCA GAC TCC GTG ACA CCC CTT-3。目的基因片段長(zhǎng)度為518 bp。PCR反應(yīng)體系：2PCR

16、 Master Mix 12.5 L，Primer（25 mol/L）0.4 L，DEPC-H2O 10.1 L，cDNA 2 L，總體積25 L。PCR反應(yīng)條件：(1)預(yù)變性94，3 min；(2)變性94，30 s；(3)退火60,30 s；(4)延伸72，60 s；重復(fù)步驟(2)(4)40次循環(huán)；(5)最后延伸72，10 min；(6)4保存。瓊脂糖凝膠電泳:用0.5TBE緩沖液配置1%瓊脂糖凝膠，加熱融化，待溫度降至60左右加入溴化乙啶（EB）12 L（10 mg/mL），混勻后鋪板，室溫放置30 min，待凝膠完全凝固后放入電泳槽，25 L PCR樣本+5 L 6Loading Bu

17、ffer，上樣量30 L，電壓90 V，電泳40 min，使用Bio-Rad凝膠成像儀進(jìn)行凝膠掃描。Eppendorf紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)各樣本濃度在600800 ng/mL，D260/280值在1.61.8。1.4 Balb/C-CAST-/-小鼠急性心肌炎模型的建立 以第10代同窩34周齡、基因型鑒定為CAST-/-的雄性小鼠腹腔注射100 TCID50的CVB3 0.1 mL/只，對(duì)照組腹腔注射Eagle液0.1 mL/只，正常條件飼養(yǎng)7 d時(shí)斷頸處死，取心肌組織在10%中性甲醛中固定，H-E染色觀察心肌組織病變程度；取小鼠外周血分離血清，ELISA法檢測(cè)外周血中cTnI含量。1.5 統(tǒng)

18、計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以xs表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，組間顯著性檢驗(yàn)采用單因數(shù)方差分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（）=0.05。2 結(jié) 果2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠大體觀察 結(jié)果（圖2）表明：經(jīng)過連續(xù)10代以上雜交，得到遺傳背景穩(wěn)定的Balb/C-CAST基因過表達(dá)小鼠。圖2 不同遺傳背景CAST基因過表達(dá)小鼠A: C57BL/6-CAST基因過表達(dá)小鼠;B: 雜交F1代CAST基因過表達(dá)小鼠;C: 雜交第10代Balb/C-CAST基因過表達(dá)小鼠2.2 堿性裂解液法及商品化試劑盒提取基因組DNA效果的比較 結(jié)果（圖3）表明：堿性裂解液提取DNA效果與市售DNA提

19、取試劑盒完全符合。圖3 雜交第10代Balb/C-CAST小鼠不同基因型PCR鑒定結(jié)果15：堿性裂解液法提取DNA；6：DNA marker; 711: 試劑盒提取DNA. 1,7: 同一標(biāo)本（Balb/C-CAST+/-）補(bǔ)充具體基因型！下同 ；2,8：同一標(biāo)本（Balb/C-CAST+/-）；3,9：同一標(biāo)本（Balb/C-CAST-/-）；4,10：同一標(biāo)本（Balb/C-CAST-/-）；5，11：同一標(biāo)本（Balb/C-CAST+/-）2.3 Balb/C-CAST-/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型的建立 同窩基因型鑒定為CAST-/-的雄性小鼠感染CVB3進(jìn)行急性心肌炎造模7 d

20、后，可見心臟表面有點(diǎn)狀、片狀白斑（圖4）。H-E染色（圖5）顯示：心肌組織可見明顯病灶和炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維排列紊亂，局部存在鈣化現(xiàn)象。CVB3模型組小鼠外周血cTnI定量檢測(cè)，與注射Eagles液對(duì)照組小鼠相比，外周血cTnI濃度顯著上升（P圖6刪除，提供原始數(shù)據(jù)！0.01）。（ng/ml） 1 2 3 4 5 6 平均數(shù) SD P值對(duì) 照 組 0.02 0.01 0.65 0.33 0.23 0.16 0.233 0.24CVB3組 8.33 6.52 1.23 3.42 9.25 6.48 5.872 3.03 0.00106圖4 VMC造模小鼠心臟外觀A: 正常對(duì)照小鼠心臟；B: C

21、VB3感染7 d小鼠心臟圖5 VMC造模小鼠心肌組織H-E染色AC:正常對(duì)照小鼠心肌組織；DF: VMC小鼠心肌組織.Original magnification: 10(A,D); 100(B,E); 400(C,F)3 討 論Calpain是一類主要存在于胞質(zhì)中的鈣離子依賴性的半胱氨酸蛋白酶，與許多疾病相關(guān)6，是許多疾病的潛在分子治療靶點(diǎn)7-8。前期研究3已證實(shí)，Calpain在急性病毒性心肌炎（VMC）發(fā)病過程中被激活，介導(dǎo)CVB3直接感染導(dǎo)致的心肌損傷作用。CAST是Calpain的內(nèi)源性抑制劑，通過其C末端的I、IV結(jié)構(gòu)域結(jié)合Calpain抑制其活性，同時(shí)通過其特定的氨基酸序列調(diào)節(jié)C

22、a2+通道的啟閉，調(diào)控Calpain活性9。Balb/C小鼠是公認(rèn)的病毒性心肌炎模型動(dòng)物，而C57BL/6-CAST基因過表達(dá)小鼠因其C57BL/6小鼠遺傳背景導(dǎo)致的免疫偏離不適合用作病毒性心肌炎模型小鼠10。因此，需要用C57BL/6-CAST基因過表達(dá)小鼠與Balb/C小鼠進(jìn)行雜交，以去除C57BL/6小鼠遺傳背景。一般認(rèn)為，通過至少10代的回交，同類系基本可以去除C57BL/6小鼠遺傳背景，8代及以上的代數(shù)種群小鼠，可基本認(rèn)為遺傳背景一致11。本研究以第11代同窩3周齡基因型鑒定為Balb/C-CAST-/-的雄性小鼠感染CVB3制作VMC小鼠模型，CVB3模型組5只小鼠造模均成功，提示

23、該類系小鼠已排除C57BL/6小鼠遺傳背景影響，完全可用于VMC小鼠模型制作。本研究采用堿性裂解液裂解法提取DNA，所用試劑均為常規(guī)化學(xué)試劑，不需用蛋白酶K，DNA得率較高、成本低廉；不使用酚、氯仿等試劑，不污染環(huán)境；不需要?jiǎng)驖{操作，避免交叉污染；鑒定結(jié)果與市售商品化DNA提取及基因型鑒定試劑盒相比，完全一致。此外，使用堿裂解法提取DNA能節(jié)約大量實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，尤其是進(jìn)行大批量小鼠的基因型鑒定時(shí)。本研究室自2012年起使用該方法對(duì)轉(zhuǎn)基因/基因敲除小鼠進(jìn)行基因型鑒定，取得了穩(wěn)定、可靠的鑒定結(jié)果，證明其是一種高效、低成本的解決方案，完全能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。綜上所述，本研究成功建立Balb/C-CA

24、ST基因過表達(dá)小鼠，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)；采用的堿性裂解液提取基因組DNA具有高效、可靠、低成本的特點(diǎn)，值得推廣。參考文獻(xiàn)1Ono Y, Sorimachi H. Calpains:an elaborate proteolytic systemJ. Biochim Biophys Acta, 2012,1824(1):224-236.2Inserte J, Hernando V, Garcia-Dorado D. Contribution of calpains to myocardial ischaemia/reperfusion injuryJ.Cardiovasc Res, 2012,

25、96(1):23-31.3李明輝,汪云開,虞勇,陳瑞珍,楊英珍.急性病毒性心肌炎小鼠心肌中Calpain mRNA表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究.中國分子心臟病學(xué)雜志, 2009, 9(5):277-281此文獻(xiàn)沒有檢索到！請(qǐng)?zhí)峁┰嘉墨I(xiàn)和正確的著錄格式，必要時(shí)更換文獻(xiàn).4Li X, Li Y, Shan L, et al. Over-expression of calpastatin inhibits calpain activation and attenuates myocardial dysfunction during endotoxaemiaJ. Cardiovasc Res, 2009, 83(1):72-79.5 Campbell RL, Davies PL. Structure-function relationships in calpainsJ. Biochem J, 2012, 447(3):335-351.6 Carragher NO.