醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)試驗(yàn)講義

1、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)講義浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)課程組 2012 年 9 月 3 日實(shí)驗(yàn)一人類(lèi)外周血染色體標(biāo)本制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)了解和掌握人類(lèi)外周血染色體標(biāo)本培養(yǎng)和制備的基本方法。二、實(shí)驗(yàn)原理正常情況下，外周血中的小淋巴細(xì)胞，幾乎都處在Gi期或Go期，外周血細(xì)胞中是沒(méi)有分裂相的。1960年，Nowell和Morhead證實(shí)，外周血中的小淋巴細(xì)胞可以在植物血凝素 （phytohemagglutinin, PHA ）或其它有絲分裂刺激劑的影響下，在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞，在培養(yǎng)中進(jìn)行有絲分裂。這樣經(jīng)過(guò)短期培養(yǎng)（colchici ne），秋水仙素的處理，低滲和固定，就可以迅速而又簡(jiǎn)便地獲得體外生長(zhǎng)

2、的細(xì)胞群體和有絲分裂相。本方法已為臨床醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、遺傳毒理學(xué)等方面廣泛應(yīng)用。三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料人外周血（淋巴細(xì)胞）實(shí)驗(yàn)器具離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、培養(yǎng)瓶、刻度離心管、注射器和針頭（6 1/2號(hào)）、吸管、量筒、火柴、酒精燈、pH計(jì)、研缽、飯盒、超凈工作臺(tái)、鑷子、載玻片、玻片盒、燒杯、染缸、試管架、玻璃鉛筆或記號(hào)筆、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙等。藥品和試劑1. 培養(yǎng)液的配制RPMI1640培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉）80%小牛血清（56 C水浴滅活30分鐘，滅活可破壞補(bǔ)體及一些污染的病毒 ） 20% 植物血凝素PHA （主要成分是粘多糖和蛋白質(zhì)，可用培養(yǎng)基溶解）4%青霉素終濃

3、度100U/ml鏈霉素終濃度100U/ml用3.5%NaHCO3調(diào)pH7.07.2，用玻璃濾器，抽濾滅菌。在超凈工作臺(tái)，分裝到培養(yǎng) 瓶中（每瓶含培養(yǎng)基5 ml）。培養(yǎng)液置于-20C冰箱保存。使用前從冰箱中取出， 溫育至37C。2肝素濃度為0.2%，作為抗凝劑使用。200 mg肝素粉末溶于100 ml生理鹽水中。高壓滅菌， -4C冰箱保存?zhèn)溆谩?. KCl濃度為0.075 M , 0.559 g氯化鉀溶于100 ml雙蒸水中。氯化鉀作為低滲液的優(yōu)點(diǎn)是染 色體輪廓清楚，可染性增強(qiáng)，時(shí)間縮短。4. 秋水仙素10g/ml，作為有絲分裂的阻止劑，抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體形成，使細(xì)胞分裂停止在中 期。稱取10

4、 mg秋水仙素溶于100 ml生理鹽水中，配成 100 ,!_g/ml的原液，分裝小瓶，高 壓滅菌，-20 C冰箱保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)取上述原液用生理鹽水稀釋成10乜/ml。5. 甲醇6冰醋酸7.吉姆沙（Giemsa）染液吉姆沙原液：先將 0.5g吉姆沙粉末干研磨，時(shí)間越長(zhǎng)越好；加 33 ml 60C預(yù)熱的純甘 油，在研缽中研磨，放在 60C恒溫水浴中保溫 90分鐘。冷卻后，再加入 33 ml甲醇，充分 攪拌，用濾紙過(guò)濾，收集在棕色瓶中保存，作為原液。原液要提前半年配制。原液中按比例 加入磷酸緩沖液即可染染色體標(biāo)本。1份Giemsa原液+ 9份磷酸緩沖液&磷酸緩沖液（pH 6.8）溶液A :磷酸二

5、氫鉀（KH 2PO4.2H2O） 9.078 g溶于1000ml蒸餾水中。溶液B :磷酸氫二鈉 （Na2HPO4.2H 2O） 11.876 g溶于1000ml蒸餾水中。100ml緩沖液：需溶液 A50.8 ml，溶液B 49.2 ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟1 .米血先在供血者肘部用酒精棉球消毒，取2 ml干燥滅菌注射器，配上針頭（6 1/2號(hào)）并吸取肝素液0.2 ml濕潤(rùn)針筒，采靜脈血 2 ml，轉(zhuǎn)動(dòng)針筒使血與肝素混勻。2. 培養(yǎng)采血完畢立即將針頭插入含 RPMI 1640培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（瓶蓋預(yù)先用酒精棉球消毒） ，每瓶滴 入30滴血，搖勻。2 ml血可分裝三至四瓶。置 37C _ 0.5C恒溫中培養(yǎng)72

6、小時(shí)，其間可搖 動(dòng)23次。3. 秋水仙素（colchicine）處理在終止培養(yǎng)前23小時(shí)，加入秋水仙素，6 1/2號(hào)針頭3滴（每ml約60滴）,使細(xì)胞分 裂終止在中期。秋水仙素的濃度不宜過(guò)高和作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雖然這樣做可以得到較多的分裂相，但導(dǎo)致染色體過(guò)分縮短，不宜用于顯帶分析。4. 離心將培養(yǎng)物倒入刻度離心管內(nèi)，以1000rpm離心10分鐘，棄去上清液，留底層沉淀物并用吸管打勻。5. 低滲處理加8 ml預(yù)溫（37C）的0.075 M KCl低滲液，用吸管打勻使細(xì)胞懸浮于低滲液中，37C水浴箱靜止2530分鐘，使白細(xì)胞膨脹，染色體分散，紅細(xì)胞解體。低滲處理的效果與低滲的 成分、處理的時(shí)間和溫度有

7、關(guān)。這是比較關(guān)鍵的一步，對(duì)任一組織和低滲液都要事先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定最合適的處理時(shí)間。6. 預(yù)固定在低滲2530分鐘后，加新配置的固定劑（甲醇 ：冰醋酸，3:1 ） 1ml，打勻。這樣有助 于細(xì)胞的均勻懸浮而不團(tuán)聚凝塊和防止細(xì)胞丟失。甲醇和冰醋酸要現(xiàn)配現(xiàn)用，如放置時(shí)間較長(zhǎng)，即不宜再用，以免影響固定效果。7. 再離心1000 rpm離心10分鐘，棄去上清液，留沉淀物。&固定沿離心管壁加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸，3:1 ）至5ml,將沉淀物打勻，固定1525分鐘。9. 再離心1000 rpm離心10分鐘，棄去上清液。10. 再固定：加入新配制的固定液（甲醇 ：冰醋酸，1:3）至5 ml打勻，

8、固定1525分鐘。11. 再離心1000 rpm離心10分鐘，棄去上清液。12. 再固定加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸，1:1 ）至5 ml打勻，固定1525分鐘，或冰箱中 放置數(shù)小時(shí)，也可以過(guò)夜。13. 制片經(jīng)上述固定后，1000 rpm離心留下約0.3 ml沉淀物，打勻。用吸管吸取細(xì)胞懸液，滴 在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即用嘴吹散，在酒精燈焰上通過(guò)幾次，使細(xì)胞平鋪于載玻片上，空氣干燥(或用電吹風(fēng)吹干)。14. 染色用Giemsa染液染色8分鐘，玻片用自來(lái)水沖洗，晾干。15. 鏡檢將染色后的玻片先用低倍鏡全面檢查，找到良好的分裂相，換用高倍鏡、油鏡觀察分析。五、注意事項(xiàng)1 在采血接種

9、培養(yǎng)時(shí)，注意不要加入太多的肝素。肝素過(guò)多時(shí)可能引起溶血和抑制淋 巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和分裂；但肝素也不能過(guò)少，以免發(fā)生凝血現(xiàn)象。2 培養(yǎng)基中不含 L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，則溶解有RPMI 1640培養(yǎng)基的液體可先用濃鹽酸調(diào)pH4.0，然后高壓滅菌(注意 121 C, 0.15 MPa，滅菌15分鐘)。冷卻后，再加入 L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、PHA、滅活小牛血清和雙抗，再調(diào) pH7.0，分裝備用。L-谷氨酰胺 和碳酸氫鈉用微孔濾膜過(guò)濾滅菌，不能高壓滅菌。3接種的血樣愈新鮮愈好，最好在24小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)。如果不能立刻培養(yǎng)，應(yīng)置于4C冰箱，保存時(shí)間過(guò)久會(huì)影響細(xì)胞活力。4 溫度 和培養(yǎng)液 的酸堿 度十分重 要。人

10、的 外周 血中淋巴 細(xì)胞培養(yǎng) 最適 溫度為 37C _0.5C，溫度過(guò)高過(guò)低都將影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，但細(xì)胞對(duì)低溫比對(duì)高溫耐受力強(qiáng)；若是中 途停電，可相應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。培養(yǎng)液的最適pH7.27.4，偏酸，細(xì)胞發(fā)育不良；偏堿，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)輕度固縮。5. PHA的質(zhì)量和濃度是培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵問(wèn)題。PHA如果保存時(shí)間太長(zhǎng)，效價(jià)會(huì)降低，應(yīng)在培養(yǎng)基中多加一些。6培養(yǎng)過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集可輕輕震蕩，使凝集塊散開(kāi)，繼續(xù)培養(yǎng)。7最好使用水平式離心機(jī)，離心速度不易過(guò)高，否則沉降在管底的細(xì)胞團(tuán)不易打散； 反之，離心速度太低，細(xì)胞會(huì)丟失。&培養(yǎng)失敗的可能原因(1) 培養(yǎng)瓶等器材洗滌不合要求。(2) 配制培養(yǎng)液使用的二或三蒸

11、水不合要求。(3) PHA和培養(yǎng)基存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。(4) 無(wú)菌操作不符合要求，發(fā)生細(xì)菌污染。9.標(biāo)本質(zhì)量不佳的原因(1) 秋水仙素處理不當(dāng)。秋水仙素的濃度、處理時(shí)間不夠，結(jié)果分裂相少；如果秋 水仙素的濃度過(guò)高、處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則使染色體過(guò)于縮短，難以進(jìn)行分析。工作時(shí)，需要摸 索處理時(shí)間和濃度。(2) 低滲處理不當(dāng)。低滲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞膜往往過(guò)早破裂，導(dǎo)致分裂細(xì)胞丟失或染色體丟失；低滲處理時(shí)間不足時(shí)，細(xì)胞膨脹不夠，染色體分散不佳，難以進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)和分析。低滲時(shí)間的掌握與氣溫有關(guān)。(3) 離心速度不合適。如果從培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞進(jìn)行離心時(shí)的速度太低，細(xì)胞丟失； 如低滲后離心速度過(guò)高，則往往分裂細(xì)胞過(guò)早破

12、裂，分散良好的分裂相多被丟失。(4) 固定不充分。如固定液不新鮮，染色體形象模糊，呈毛刷狀，染色體周?chē)邪?漿背景。因此，固定液純度要高，臨用時(shí)新鮮配制。六、作業(yè)選擇觀察10個(gè)較好的細(xì)胞分裂相，計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。附 染色體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備 細(xì)胞培養(yǎng)和染色體制片過(guò)程中所用的培養(yǎng)瓶等玻璃器材和橡皮塞等在使用前， 都要經(jīng)過(guò) 嚴(yán)格的洗刷、浸泡、蒸餾水洗和滅菌等過(guò)程，以保證清潔無(wú)菌。一、器材的清洗1清洗液的配制重鉻酸鉀 120g濃硫酸160ml蒸餾水1000ml先將重鉻酸鉀倒入蒸餾水中， 然后慢慢加入濃硫酸， 邊加入邊用玻璃棒攪拌。 由于加入 濃硫酸時(shí)會(huì)產(chǎn)生高溫，所以不能用玻璃容器， 而可用塑料桶或陶瓷

13、缸。 配制好的清潔液，應(yīng) 儲(chǔ)存在有蓋的容器內(nèi)。 如清潔液已呈綠黑色時(shí)， 表明已經(jīng)失效， 不能再用。 硫酸的腐蝕性強(qiáng)， 操作時(shí)要戴防護(hù)手套，不能用金屬鑷子去夾玻璃瓶等。2一般玻璃器皿的處理30 分鐘后，趁熱刷洗干凈，用自來(lái)水沖1 天，然后取出，自來(lái)水充分沖洗，在蒸餾80C 烤箱中烘干。用牛皮紙包扎瓶口，干玻璃器皿先用自來(lái)水洗去贓物，用肥皂液煮沸 洗去掉肥皂殘跡，空氣干燥。放入清潔液中浸泡 水中浸泡一天，再換一次蒸餾水，浸泡一天。置 熱滅菌150 C 2小時(shí)。3玻璃細(xì)菌濾器的處理新購(gòu)濾器用自來(lái)水刷洗后，裝上新配洗滌液(化學(xué)純濃硫酸6ml ，化學(xué)純硝酸鈉 2g，蒸餾水100 ml),讓其自然濾過(guò)，然

14、后用自來(lái)水、蒸餾水反復(fù)濾過(guò)，接著用1M的NaOH溶液過(guò)濾至液體呈中性。空氣干燥，用牛皮紙或玻璃紙包好，高壓滅菌。用過(guò)的濾器必須立即進(jìn)行清洗， 先在清潔液中浸泡一天， 然后自來(lái)水沖洗， 蒸餾水浸泡 一天，蒸餾水抽濾多次，使堵塞濾孔的物質(zhì)完全除去。4橡膠類(lèi)制品的處理新橡膠類(lèi)制品用水刷洗后，用 2%的 NaOH 溶液煮沸 20 分鐘，然后用自來(lái)水沖洗，用 2%的 HCl 溶液煮沸 20 分鐘，自來(lái)水洗，蒸餾水中浸泡 24 小時(shí)，晾干，牛皮紙包扎，高壓 滅菌。用過(guò)的橡膠類(lèi)制品立即泡于清水中，用肥皂液刷洗后，用自來(lái)水沖洗，蒸餾水中浸泡24 小時(shí)，晾干，牛皮紙或玻璃紙包扎，高壓滅菌。5載玻片的處理 將載玻

15、片一片一片放入肥皂溶液煮沸 20 分鐘，刷洗干凈后，用自來(lái)水沖洗，蒸餾水中 浸泡 24 小時(shí)，放入裝有蒸餾水的飯盒中，置冰箱中冷凍待用。二、滅菌1干熱滅菌 ( dry heat sterilization ) 一般采用電熱鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行干熱滅菌。 一般玻璃和金屬器材都可使用干熱滅菌， 較為 方便。布類(lèi)、橡皮類(lèi)、液體不能用干熱滅菌。滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間是：150 C干烤2小時(shí)。必須注意以下事項(xiàng)：(1 ) 放置入烤箱的物品，要間隔一定距離，以免影響滅菌效果。特別不要將包扎紙 直接與烤箱箱壁或箱底接觸，以免在高溫下烤焦、起火。(2) 烤箱電源打開(kāi)后，門(mén)上應(yīng)掛一個(gè)標(biāo)示牌，以免他人誤開(kāi)箱門(mén)，使冷空氣突然進(jìn)

16、 入烤箱，造成玻璃器皿破裂。(3) 先加熱至80C左右，使箱內(nèi)空氣完全排空后，再關(guān)閉氣門(mén)， 150C烤2小時(shí)后 自然冷卻。( 4) 干熱滅菌過(guò)程中，應(yīng)有專(zhuān)人負(fù)責(zé)照看。2 .高壓滅菌(autoclaving sterilization)一般用手提式電熱高壓蒸汽滅菌鍋，既經(jīng)濟(jì)又省時(shí)，效果也好，是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常采用的方法。一般玻璃器材、玻璃濾器、橡膠類(lèi)制品、布類(lèi)和一些溶液都可用高壓滅菌。滅菌時(shí)不要裝的太滿， 液體不要裝瓶過(guò)滿，瓶塞上插上一個(gè)注射針頭，以免高壓過(guò)程中容器炸裂或瓶塞掉出。擰緊鍋蓋后，打開(kāi)電源，打開(kāi)排氣孔，待升溫至排氣孔排出氣流呈直線，冷空氣已基本排出時(shí)，關(guān)上排氣孔。直至氣壓達(dá)0.15 MPa

17、后，繼續(xù)滅菌20分鐘。滅菌完畢后，關(guān)上電源，待壓力自然下降，溫度降低后再打開(kāi)鍋蓋，取出物品。趁熱放 入80 C烘箱內(nèi)烘干待用。3. 過(guò)濾除菌 (filter sterilizatio n )細(xì)胞培養(yǎng)中的常用的生物性物質(zhì)，如培養(yǎng)液、血清、酶溶液等不能用高熱或高壓滅菌， 只能用過(guò)濾法除菌。此外， NaHCO3等類(lèi)物質(zhì)遇高熱時(shí)會(huì)發(fā)生分解，故需要用過(guò)濾法除菌。(1) 玻璃濾器有六個(gè)型號(hào)，其中 G6型濾器可以有效的除菌。玻璃濾器在高壓滅菌之后，板上將析出少量堿性物質(zhì)，所以，用它過(guò)濾后，液體的pH值將會(huì)有所增高，因此，在調(diào)配液體時(shí)應(yīng)考慮這一情況。用玻璃濾器抽濾時(shí)，抽濾不要過(guò)快，以濾液分滴濾下較為合適。注

18、意避免液體抽干后仍在繼續(xù)抽濾。(2) 微孔濾器濾膜常用醋酸纖維薄膜，具有靈敏度高、方便、經(jīng)濟(jì)省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。濾器的后方接一個(gè)5ml的注射器。濾膜可以耐高壓滅菌，0.2m孔徑的內(nèi)膜的除菌效果即與G6型玻璃濾器相當(dāng)。23實(shí)驗(yàn)二 人類(lèi)染色體核型分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)實(shí)驗(yàn)掌握染色體核型分析的常用方法以及 G 帶的帶型特征和識(shí)別技巧，初步學(xué)會(huì) 識(shí)別 G 帶染色體。二、實(shí)驗(yàn)原理 將一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的染色體按照一定的順序排列起來(lái)構(gòu)成的圖像就稱之為該細(xì)胞的核型（karyotype） ，這通常是用顯微攝影得到的染色體相片剪貼而成（目前可通過(guò)相關(guān)軟件在電腦 中自動(dòng)排列） 。在顯帶技術(shù)問(wèn)世以前，人們主要根據(jù)染色體的大小、著絲

19、粒的位置，將人類(lèi) 染色體順次由 1 編到 22 號(hào)，并分為七組。但要想精確、有把握地鑒別每條染色體是比較困 難的。 70 年代初出現(xiàn)了染色體顯帶技術(shù)，不僅解決了染色體識(shí)別困難的問(wèn)題，而且為深入 研究染色體異常及基因定位創(chuàng)造了條件。將染色體標(biāo)本用顯帶方法處理后，再用 Giemsa 染 色，這類(lèi)技術(shù)就稱為 G 分帶，通過(guò)顯微攝影，就可得到 G 帶染色體的顯微相片。三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)材料：顯微相片 1 份 2 張。實(shí)驗(yàn)器材：鑷子、剪刀、膠水、實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙。四、實(shí)驗(yàn)步驟 1先貼一張相片于報(bào)告紙上方。2將另一相片上的染色體逐個(gè)剪下，按丹佛和人類(lèi)染色體遺傳學(xué)命名的國(guó)際體制（ISCN ）排列編號(hào)。粘貼時(shí)短臂向

20、上，長(zhǎng)臂向下。 3在分析結(jié)果中，寫(xiě)出該細(xì)胞的核型式，注明性染色體。五、作業(yè)剪貼正常男性或女性染色體顯微相片一張。附 人類(lèi)染色體 G 分帶特征描述1 號(hào)染色體 最突出的特征是在長(zhǎng)臂近著絲粒處有一塊濃染的塊狀物質(zhì)。長(zhǎng)臂有5 條深帶，中央一條最寬最深。 短臂近著絲粒端1/2處有2條寬闊的深帶，遠(yuǎn)端有 34條較窄的淡帶。2 號(hào)染色體與 1 號(hào)染色體相比為亞中著絲粒并缺乏明顯的界標(biāo)。長(zhǎng)臂有45 條分布均勻的深帶，中央 2個(gè)常融合為 1個(gè)帶。3 號(hào)染色體中央著絲粒染色體， 帶型近乎對(duì)稱。 兩臂的近端和遠(yuǎn)端染色甚深， 而中心部位染色較淺。4 號(hào)染色體與 5染色體相比著色均勻。長(zhǎng)臂上有 45條很均勻的深帶，短

21、臂中央有 12條深帶。5 號(hào)染色體長(zhǎng)臂中部有一寬的中央帶，遠(yuǎn)端有 2個(gè)深帶。短臂可見(jiàn) 12條深帶，遠(yuǎn)端的深帶寬且 色濃。6 號(hào)染色體長(zhǎng)臂有 4 條均勻的帶， 短臂中部有一明顯而寬闊的淺帶，其近、 遠(yuǎn)端各有一深帶， 近端 深帶緊貼著絲粒。7 號(hào)染色體長(zhǎng)臂有 3 條帶，遠(yuǎn)端一條較淺。 短臂上有 3 條深帶， 遠(yuǎn)端一條較寬且色深， 有如“瓶蓋”。8 號(hào)染色體長(zhǎng)臂中部有一寬帶，短臂有 2條分布均勻的深帶，中部有一較明顯的淺帶。9號(hào)染色體長(zhǎng)臂有2條均勻隔開(kāi)的明顯深帶，短臂有特別的心形外貌，近端和中部各有一深帶。10號(hào)染色體長(zhǎng)臂有3條明顯的深帶，其中近端一條帶最深，短臂近端和近中部有一寬帶。11長(zhǎng)臂緊貼著

22、絲粒有一深帶，遠(yuǎn)端可見(jiàn)一明顯的較寬的深帶，這條深帶與近端的深帶之間的1條寬闊的淺帶。短臂近中部有一深帶。12號(hào)染色體長(zhǎng)臂緊貼著絲粒有一深帶，中部有一寬的深帶，這條深帶與近端深帶之間有一明顯淺帶。 但與11號(hào)染色體比較，這條淺帶較窄，是區(qū)別11、12號(hào)染色體的主要特征。13號(hào)染色體長(zhǎng)臂可見(jiàn)4條深帶。14號(hào)染色體長(zhǎng)臂近端有一深帶，其遠(yuǎn)端也有一明顯的深帶。15號(hào)染色體長(zhǎng)臂近中部有一明顯的深帶，遠(yuǎn)端著色淺，有時(shí)可見(jiàn)2條淺帶。16號(hào)染色體長(zhǎng)臂中和遠(yuǎn)端各有一深帶，有時(shí)遠(yuǎn)端不明顯。短臂染色淺，可有12條帶。17號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端有一深帶，這條帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶。短臂上的一條窄帶緊貼著絲粒。18號(hào)

23、染色體長(zhǎng)臂有2條寬帶，近端一條較遠(yuǎn)端的寬些，短臂上有一窄帶。19號(hào)染色體 著絲粒及周?chē)鸀樯顜?，其余均為淺帶。20號(hào)染色體兩臂的遠(yuǎn)端著色，短臂著色較長(zhǎng)臂深些。21號(hào)染色體長(zhǎng)臂近端有一寬闊深帶，遠(yuǎn)端淺染。22號(hào)染色體長(zhǎng)臂上有2條深帶，近端的一條著色深， 緊貼著絲粒。近中部的一條著色淺，有時(shí)不顯 現(xiàn)。X染色體長(zhǎng)臂可見(jiàn)45條深帶，近中央有一與短臂相似的深帶，似“竹節(jié)”狀。短臂中部有明 顯中央深帶。Y染色體長(zhǎng)臂有2條遠(yuǎn)端帶，有時(shí)整個(gè)長(zhǎng)臂被染成深帶。帶型識(shí)別口訣一禿二蛇三蝶飄四象鞭炮五黑腰六號(hào)1、4小白臉七上八下九苗條十號(hào)q肩帶好十一低來(lái)十二咼十三、十四、十五號(hào)(3.2.1)十六q縊痕大十七q帶腳鐐十八人

24、小大肚泡十九是黑腰二十頭重腳底淺二一象個(gè)葫蘆瓢二十二頭小，身子大X扁擔(dān)，兩頭挑人類(lèi)染色體核型分析實(shí)驗(yàn)報(bào)告班級(jí) 姓名 標(biāo)本編號(hào)：分析結(jié)果：4 B9 10 111213 14 15 D 16 17 18 E 1920F 21 22 G 性染色體實(shí)驗(yàn)三 人類(lèi)染色體 G 帶標(biāo)本制備及觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)掌握 G 帶標(biāo)本制備的基本方法，學(xué)會(huì)在顯微鏡下直接觀察 G 帶分裂相。二、實(shí)驗(yàn)原理有許多顯示G帶的方法，最常用的是將已經(jīng)過(guò)老化的染色體制片放到37C胰酶中進(jìn)行處理， 然后用 Giemsa 染色。通過(guò)胰酶處理使 G 帶區(qū)的疏水蛋白被除去或使它們構(gòu)型變?yōu)楦?疏水狀態(tài)，由此可見(jiàn)在 G帶區(qū)中抽取的蛋白往往是

25、疏水蛋白。Giemsa染料是由天青和伊紅組成的，染色首先取決于二個(gè)天青分子同 DNA 結(jié)合，在此基礎(chǔ)上結(jié)合一個(gè)伊紅分子，其次 取決于一個(gè)有助于染料沉淀物積累的疏水環(huán)境。 關(guān)于顯帶機(jī)理有多種論點(diǎn)， 總的來(lái)說(shuō)， 還不 能完全解釋顯帶的機(jī)理問(wèn)題。三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料常規(guī)的人類(lèi)體外周血染色體制片。實(shí)驗(yàn)器材恒溫水浴箱、燒杯、染缸、顯微鏡附油鏡頭、香柏油、擦鏡紙、恒溫培養(yǎng)箱、鑷子、記 號(hào)筆或鉛筆等。藥品和試劑1 Hanks 液NaCI2.0 gKCI0.1 gNa2HPO4.12H2O0.0375 gK2HPO40.015 g葡萄糖0.25 g加雙蒸水250 ml及1%酚紅0.5 ml，成Hanks液。2

26、胰酶液稱取胰酶0.2 g溶于100 ml Hanks液中，攪拌半小時(shí)，用1N NaOH調(diào)pH7.07.2，冷凍保存。（最好現(xiàn)配現(xiàn)用）3磷酸緩沖液 （ pH6.8 ）4 Giemsa 染液5生理鹽水四、實(shí)驗(yàn)步驟1.先將胰酶液水浴加熱到37 C。2將染色體標(biāo)本浸入胰酶液中，作用時(shí)間幾秒到幾十秒不等，依樣本存放時(shí)間長(zhǎng)短而 定。（標(biāo)本需預(yù)先經(jīng)6070 C烤2小時(shí)，或37C恒溫老化57天。標(biāo)本太新鮮，染色體有 些毛）3. 取出玻片標(biāo)本，在生理鹽水中過(guò)一下，再經(jīng)過(guò)蒸餾水洗。4. Giemsa 染液染色 8 分鐘。5. 自來(lái)水洗、晾干。6. 鏡檢。選擇分散及顯帶良好的分裂相，在油鏡下觀察。如觀察到染色體變粗

27、并顯得 毛糙邊緣，有時(shí)甚至呈糊狀，是處理過(guò)度了。觀察細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)：（1）細(xì)胞完整，輪廓清晰，染色體在同一平面上均勻分布。（ 2） 染色體形態(tài)和分散良好，最好無(wú)重疊現(xiàn)象，即使染色體個(gè)別重疊，也要能明顯辨別。（ 3） 所觀察的染色體長(zhǎng)短大致一樣，處于同一有絲分裂時(shí)期。（ 4） 在所觀察的染色體周?chē)鷽](méi)有多個(gè)或單個(gè)散在的染色體。五、注意事項(xiàng)1帶效果的好壞，主要決定于染色體的標(biāo)本質(zhì)量。標(biāo)本染色體要長(zhǎng)，染色體分散合適，背景無(wú)胞漿，標(biāo)本未老化即保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。2要注意胰酶處理的溫度和時(shí)間，穩(wěn)定顯帶的條件，才能保證顯帶效果。 3磷酸緩沖液的 pH 值不要過(guò)堿，偏酸為宜，否則著色不鮮明。4G 帶制備有許多種方法，各

28、個(gè)實(shí)驗(yàn)室在細(xì)節(jié)處理上均不同，最好總結(jié)出適合自己實(shí) 驗(yàn)室采用的方法。如果使用效果良好，不要輕易更換新方法。六、作業(yè)畫(huà)出顯微鏡下你所觀察的分裂相，要求標(biāo)明染色體號(hào)數(shù)，請(qǐng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師復(fù)核。實(shí)驗(yàn)四Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD )基因檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誅uchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥基因(DMD )檢測(cè)的簡(jiǎn)便方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1985 年，Kary Mullis 創(chuàng)建了聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction， PCR)技術(shù)，簡(jiǎn) 稱PCR技術(shù)。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，對(duì)待檢原始材料質(zhì)量 要求低等特點(diǎn)。PCR反應(yīng)是由變性(denaturation

29、)、模板與引物結(jié)合(復(fù)性annealing)及延伸(extension)三個(gè)步驟為一個(gè)周期的不斷重復(fù)過(guò)程，經(jīng)過(guò)2530次循環(huán)之后，理論上可擴(kuò)增109倍。PCR反應(yīng)中通常只有一對(duì)寡核苷酸引物，而多重PCR (multiplex PCR )貝U是用幾對(duì)引物在同一個(gè) PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以同時(shí)擴(kuò)增出幾個(gè)不同專(zhuān)一靶區(qū)域的 片段。Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy , DMD)是一原發(fā)于肌肉組織的 遺傳病，特點(diǎn)是進(jìn)行性加重的肌肉萎縮和無(wú)力，臨床表現(xiàn)腿的假性肥大， 血清酶學(xué)明顯升高。本病呈X連鎖隱性遺傳，一般男性兒童發(fā)病。DMD基因定位于Xq

30、21.2-21.3之間，全長(zhǎng)2300kb左右，由79個(gè)外顯子組成，編碼含 3 685個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白 (dystrophin),這種蛋白具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的功能。DMD基因有多種突變形式，60%是外顯子缺失突變，5%是重復(fù)突變，35%可能是很小的 DNA片段缺失或點(diǎn)突變。通常 選擇DMD基因中9個(gè)缺失熱點(diǎn)的外顯子擴(kuò)增，可檢出缺失突變中的 90%。為節(jié)省經(jīng)費(fèi)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為擴(kuò)增 DMD基因中4個(gè)外顯子，其中外顯子 45和48在中國(guó)患者中的檢出率分 別為26%和48%。DMD基因4個(gè)外顯子的引物順序外顯子PCR產(chǎn)物大小引物F引物R8360gtcctttacacactttac

31、ctgttgagggcctcattctcatgttctaattag19459ttctaccacatcccattttcttccagatggcaaaagtgttgagaaaaagtc45547aaacatggaacatccttgtggggaccattcctattagatctgtcgccctac48506ttgaatacattggttaaatcccaacatgcctgaataaagtcttccttaccacac三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料正常對(duì)照DNA樣本、DMD患者DNA樣本?；蚪M DNA 稀釋至100ng/山，備用。 實(shí)驗(yàn)器材微量加樣器、槍頭(101|, 1001| )、Eppendof管、PCR儀、

32、臺(tái)式高速離心機(jī)、電泳 儀、水平電泳槽、紫外透射反射儀。藥品和試劑PCR試劑盒、dNTPs、Primer R + F 混合液：包括外顯子 8、19、45和48，終濃度 各25pmol/川、石蠟油、瓊脂糖、 6 X載樣緩沖液、溴化乙錠、 pUC19/Msp I、1 TBE電 泳緩沖液。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.正常對(duì)照 DNA樣本、DMD患者DNA樣本分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR操作如下：每一個(gè)薄壁離心管中加入：(反應(yīng)總體積為25山)雙蒸水17.5 -10 XBuffer2.5 JlMgCl 22 JldNTPs0.5 JlPrimer R+F (混合)2川DNA模板0.5川Taq-DNA聚合酶0.3川石蠟

33、油1滴放置在PCR循環(huán)儀上，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：Step 1（1個(gè)循環(huán)）94 C5分鐘Step 2（30個(gè)循環(huán)）-94 C30秒i56 C30秒-72 C30秒Step 3（1個(gè)循環(huán)）72 C7分鐘2. PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。(1 )配制2%的瓊脂糖凝膠配制1XTBE電泳緩沖液70 ml于三角燒瓶中，稱取1.4 g的瓊脂糖粉放入后，沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至60 C，加入溴化乙錠至終濃度為0.5ig/ml，混勻凝膠，倒入電泳槽中，插入梳子，待凝固。（2）向電泳槽中倒入 1XTBE，其量以沒(méi)過(guò)膠面 2mm為宜，小心移去梳子。（3） 取PCR擴(kuò)增樣品10山加入3川的6X載樣緩沖液

34、，混勻后，加入樣品孔內(nèi)。（4） 接通電源，一般紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記 DNA羊品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近 加樣孔的一端為負(fù)極）。電壓為15 V/cm （長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算 ）。140 V，電泳 2小時(shí)左右。根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳。（5） 卸下凝膠，紫外儀上觀察電泳條帶，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker pUC19/Msp I 比較，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)及片段大小。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以觀察到正常對(duì)照樣本有4條帶，從負(fù)極往正極分別為外顯子45、48、19和8。11 1093765432 1MDMD患者缺失不同的外顯子，如有缺失需3次以上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)：501 bp404bp

35、一 331bp 2 42 bp泳道1、2、5、7和8是正常對(duì)照；泳道 3、4和9是第19外顯子缺失的患者；泳 道6是外顯子48缺失的患者；泳道10和11是外顯子45缺失的患者。M：pUC19/Msp I。 六、注意事項(xiàng)1 .引物設(shè)計(jì)時(shí)長(zhǎng)度 15 30個(gè)堿基為宜，G + C含量一般為40% 60%。2 .退火溫度決定 PCR反應(yīng)的特異性，退火溫度高，PCR反應(yīng)的特異性好；溫度低，有時(shí)會(huì)有非特異性條帶。3. Mg2+濃度對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性及產(chǎn)量有顯著影響，Mg2+濃度低，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異 性好，但有時(shí)產(chǎn)量低； Mg2+濃度高，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性差，有非特異性條帶。4. PCR循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板

36、DNA的濃度。理論上 25 30次循環(huán)后PCR產(chǎn)物 積累即可達(dá)到最大值。在滿足產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)五 遺傳病基因突變分析、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)掌握 DNA 的提取、聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR ）以及 DNA 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分 析（SSCP）等幾種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，并了解SSCP分析法是檢測(cè)基因突變的一種基本方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1 DNA 抽提核基因 DNA 可以從任何有核細(xì)胞中提出， 人外周靜脈血的淋巴細(xì)胞是抽提核基因DNA 最方便的材料。 EDTA 抗凝的外周靜脈血經(jīng)離心處理后，可分離得到大量淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核。由于 DNA 在細(xì)胞核內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的，因此提取

37、過(guò)程中必須將其中的蛋白質(zhì)除去，蛋白酶 K 可用于消化細(xì)胞核膜及核內(nèi)蛋白質(zhì)，消化的蛋白質(zhì)用飽和 NaCl 沉淀，核 DNA 最后用酒精析出。2聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（ polymerase chain reaction， PCR ）是一種體外由引物介導(dǎo)的特定DNA 序列的酶擴(kuò)增方法，由于此方法對(duì)樣本要求的微量性以及它特異、敏感、高速 的特性，近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用。全過(guò)程是基于一套“三步曲”的若干輪次的循環(huán)組合 而成的。依次為 DNA 模板熱變性，雙鏈 DNA 解鏈成單鏈；在低溫下與引物退火，引 物與單鏈 DNA 互補(bǔ)配對(duì)；在適宜溫度下 Taq DNA 聚合酶催化引物延伸。以上三步為 一個(gè)循環(huán)，循

38、環(huán) 2535次，模板DNA可擴(kuò)增100萬(wàn)倍左右，整個(gè)反應(yīng)在23小時(shí)內(nèi)完成（見(jiàn)圖） 。廠驀撓蓿諌L1 I l_l II-I IIJ I I.l I I_i 1 I- I II I il 1 - u”+第2輪祜環(huán)HFaf 11 11 ii 11ji iiuuammfliJ -jrj-i04 ii I+第3輪循環(huán)RO価|耐M1m _模板DNA變性和引物復(fù)性引物延伸變性和引物復(fù)性引物延伸變性和引物復(fù)性引物延伸至比輪循環(huán)PCR反應(yīng)原理示意圖3 .單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性(si ngle Strand Con formation Polymorphism, SSCP)分析法是一種DNA單鏈凝膠電泳

39、技術(shù) ，該法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏和適用于大樣本篩查的特點(diǎn)， 可有效檢出堿基置換、缺失、插入等基因變異。目前，已廣泛用于癌基因、遺傳病基因診斷等領(lǐng)域。SSCP原理是在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中，單鏈DNA遷移率除與DNA長(zhǎng)度有關(guān)外，更主要取決于 DNA單鏈所形成的空間構(gòu)象，相同長(zhǎng)度的單鏈DNA因其順序不同或單個(gè)堿基差異，所形成的構(gòu)象就會(huì)不同。PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后進(jìn)行單鏈 DNA凝膠電泳時(shí)，每條單鏈處于一定的位置，靶DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個(gè)堿基置換時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而提示該片段有基因突變存在(見(jiàn)圖)。對(duì)于小于 300bp單鏈DNA片段，SSCP分析的檢測(cè)靈敏度可達(dá)90%99%。

40、隨著DNA長(zhǎng)度增加，其檢測(cè)靈敏度相對(duì)減弱。野生型DIU夷變DNA.單鏈多態(tài)性泳胡不同ESCP原理示意圖（一條染色體）wt：卿生型m：突變型三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料人外周靜脈血實(shí)驗(yàn)器材吸管、Eppendof管、薄壁離心管、PCR儀、高速臺(tái)式離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、紫外透射反射儀、注射器（2ml）、針頭、10ml玻璃離心管、10ml塑料離心管、各種微量加樣器、槍頭（10 W、100 M、1000 W ）、天平、各種試管架、燒杯、石蠟?zāi)ぁ?量筒、恒溫水浴箱、記號(hào)筆、不銹鋼燒鍋、高壓滅菌鍋、搪瓷盤(pán)、玻璃紙、電磁爐等。藥品和試劑1. 用于DNA提取藥品和試劑10mg/ml蛋白酶 K （-20 C冰箱保存）0

41、.5 M EDTA （ pH8.0，滅菌保存）TE緩沖液（pH8.0，滅菌保存）緩沖液 A （ buffer A ）:蔗糖109.536g2M Tris.HCI5mlTrito n-X-10010ml2M MgCI 22.5ml雙蒸水加至1000ml，過(guò)濾，4 C冰箱保存。2M Tris.HCI （ pH8.0 ）（滅菌保存）2M MgCI 2 （滅菌保存）5M NaCl （滅菌保存）10% SDS瓊脂糖（進(jìn)口分裝）5 XTBE蛋白酶K工作液1份樣本為2 ml血10 samples20 samples10mg/ml蛋白酶 K100川200山10% SDS100屮200山0.4M EDTA5 J

42、10山dd H2O794山1590 山咼壓火菌保存total volume1000 川2000 川1乜/川EB （溴乙錠）6 X加樣緩沖液2 .用于PCR反應(yīng)核溶解緩沖液(nu clei lysis buffer)廠 5M NaCI0.5M EDTA2M Tris.HCI雙蒸水(pH8.0 )(pH8.0 )40 ml2 ml2.5 ml455.5 ml10 XBufferMgCl 2、dNTPs、Taq-DNA聚合酶由所購(gòu)試劑公司統(tǒng)一提供。DNA 模板：正常對(duì)照來(lái)自實(shí)驗(yàn)者的血液樣本，基因突變樣本來(lái)自1例角膜營(yíng)養(yǎng)不良癥患者。擴(kuò)增片段為角膜營(yíng)養(yǎng)不良癥基因BIGH3第11外顯子，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為22

43、3bp。Primer F :CTCGTGGGAGTATAACCAGT引物序列如下:Primer R : TGGGCAGAAGCTCCACCCGG3 .用于SSCP雙甲基丙烯酰胺（Bis ）丙烯酰胺(Acr)TEMED30%貯存液:Acr29 g-Bis1 g-溶于100ml滅菌雙蒸水中10% APS （過(guò)硫酸胺）臨用時(shí)配1% HNO 30.2% AgNO 3 顯影液rNa2CO32.96 g雙蒸水加至 100ml，臨用時(shí)配，4 C冷藏。甲醛臨用時(shí)加54H10%硫代硫酸鈉臨用時(shí)加10Jl10%乙酸10%乙醇蔗糖載樣緩沖液（loading buffer ）95% 甲酰胺20 mM EDTA溴酚藍(lán)，

44、少許二甲苯氰，少許四、實(shí)驗(yàn)步驟1. DNA抽提（1）抽取人靜脈血 2ml , EDTA抗凝。（2） 加buffer A至5ml刻度線,混勻后，冰箱中冷藏保存10分鐘。（3）7000rpm離心10分鐘，棄去上清液。重復(fù)上述操作兩次。（4）加核溶解緩沖液 0.3ml，震蕩20秒。（5） 力口 10% SDS 0.02ml和蛋白酶 K工作液0.05ml，混勻后，37 C恒溫水浴箱 中消化過(guò)夜。（6） 消化結(jié)束后，加 0.1ml飽和NaCl，劇烈震蕩后，4000rpm離心30分鐘。（7） 將含有DNA的上清液吸入另一新玻璃離心管中。加兩倍體積的95%酒精,緩慢晃動(dòng)，DNA逐漸被析出來(lái)。然后將DNA移至

45、裝有100山TE緩沖液的eppendorf 管中。（8） 冰箱中放置一天后測(cè)濃度。DNA 稀釋至100ng/備用。2. PCR操作每一個(gè)薄壁離心管中加入:雙蒸水（反應(yīng)總體積為25）18.5 川配制電泳2%的瓊脂糖凝膠，3山的6X30分鐘。在紫外燈下觀察結(jié)3.(1)SSCP實(shí)驗(yàn)步驟8%的聚丙烯酰胺凝膠10ml，包括：I蔗糖30%聚丙烯酰胺5 X TBE5.3 ml6 %2.7 ml2 ml50 Jl5 Jl用夾子夾好后，靜置10%APSTEMED1小時(shí)聚合。聚合過(guò)程中凝膠會(huì)收縮，所以靜置一些時(shí)（2）間，待凝膠聚合后，應(yīng)在梳子上加少量雙蒸水。（3） DNA樣品的處理與加樣7.5 7 PCR產(chǎn)物與15 Jl loading buffer 混合后，100 C沸水中加熱變性8分鐘，冰MgCl 22 md