產(chǎn)甲烷菌的生化代謝途徑與基因改造

1、產(chǎn)甲烷菌的生化代謝途徑與基因改造產(chǎn)甲烷菌在地球碳循環(huán)中扮演著重要角色，是有機(jī)物厭氧降解的末端功能類群，能夠?qū)⒂袡C(jī)碳轉(zhuǎn)化為甲烷. 它們廣泛分布于地球的無氧環(huán)境中，從土壤到湖泊沉積物，從陸地到海洋，從零下的低溫環(huán)境到100 以上的高溫環(huán)境，都有產(chǎn)甲烷菌的存在. 進(jìn)化研究表明產(chǎn)甲烷菌是地球上最為古老的菌群，目前有兩個(gè)不同的假說均認(rèn)為產(chǎn)甲烷菌是真核生物的祖先1-2. 與細(xì)菌和真核生物相比，產(chǎn)甲烷菌以甲烷作為其厭氧呼吸終產(chǎn)物，具有更加獨(dú)特的生化代謝特性. 另一方面，甲烷作為一種清潔能源，正越來越受到關(guān)注3. 同時(shí)，甲烷的高紅外吸收以及對臭氧層的影響使之成為第二大溫室效應(yīng)氣體，其產(chǎn)生的溫室效應(yīng)是CO2的2

2、0-30倍4-5. 目前全球的甲烷排放量約為5×109-6×109kg/年6，其中大約74%的甲烷排放來自生物產(chǎn)甲烷7，大氣中的甲烷含量正以每年2%的速度遞增8. 因此研究產(chǎn)甲烷菌的生化代謝途徑不僅能夠增加我們對古菌特殊代謝途徑的了解，而且能夠?yàn)榻鉀Q全球能源緊缺以及氣候變暖等問題提供理論依據(jù). 產(chǎn)甲烷菌能夠利用的底物非常有限，僅能夠利用CO2、乙酸和簡單甲基化合物這3類物質(zhì)作為碳源產(chǎn)甲烷. 本文即綜述產(chǎn)甲烷菌利用這3類底物產(chǎn)甲烷的具體代謝過程，詳細(xì)闡述其中涉及到的能量轉(zhuǎn)化過程、電子傳遞途徑以及參與的關(guān)鍵酶和輔酶，介紹最新發(fā)現(xiàn)的電子歧化途徑，即包含F(xiàn)DA蛋白的復(fù)合體介導(dǎo)電

3、子在脫氫酶和氧化還原酶之間轉(zhuǎn)移，從而完成能量儲存的過程；同時(shí)還對目前通過一些新技術(shù)和新方法對產(chǎn)甲烷菌生化代謝過程研究的進(jìn)展情況予以總結(jié).1 產(chǎn)甲烷菌的特點(diǎn)產(chǎn)甲烷菌是嚴(yán)格厭氧的原核生物，是已知的唯一一種能夠代謝產(chǎn)甲烷的生物. 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上屬于古菌域廣古門菌門（Euryarchaeota）9. 已知的產(chǎn)甲烷菌分為7個(gè)目：甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷 八疊球菌目（Methanosarcinales）、甲烷火球菌目（Methanopyrales）、Methanocellales

4、和Methanoplasmatales（圖1）. 前5個(gè)目中已經(jīng)分離到很多純菌種，研究較多8. Sakai等于2008年從稻田里分離得到了一種僅利用H2或甲酸還原CO2生長產(chǎn)甲烷的菌株，提出了Methanocellales目10；Paul等于2012年在白蟻腸道中分離得到的一種與熱原體目類似的菌，僅能夠利用甲醇作為底物生長產(chǎn)甲烷，于是提出了Methanoplasmatales目11.產(chǎn)甲烷菌分布廣泛，主要存在于厭氧生態(tài)系統(tǒng)中，如：（1）湖泊、沼澤濕地、水稻田、污泥等；（2）生物體內(nèi)，如反芻動物的瘤胃和人類、昆蟲等的腸道內(nèi)；（3）土壤中的厭氧團(tuán)粒，如森林中的土壤團(tuán)粒；（4）人工生物降解設(shè)施，如沼

5、氣池和生物反應(yīng)器；（5）一些極端環(huán)境，如熱泉、含硫熱液口、水底的熱流等8, 13-14. 盡管產(chǎn)甲烷菌在自然界中分布廣泛，但其不能利用復(fù)雜的有機(jī)物作為能量來源，僅能夠利用幾種簡單化合物作為產(chǎn)甲烷的底物，這些物質(zhì)主要是CO2、乙酸和簡單甲基化合物. 根據(jù)其利用的底物可以將產(chǎn)甲烷菌分為3類：（1）還原CO2型，主要利用H2、甲酸作為電子供體還原CO2產(chǎn)甲烷，例如Methanobrevibacter15；（2）甲基營養(yǎng)型，通過H2還原甲基化合物中的甲基產(chǎn)甲烷或通過甲基化合物自身的歧化作用產(chǎn)甲烷，例如Methanococcus16；（3）乙酸型，通過裂解乙酸，將乙酸的羧基氧化為CO2，甲基還原為甲烷，

6、例如Methanosaeta17-18. Methanococcales、Methanobacteriales、Methanomicrobiales和 Methanopyrales目中幾乎所有的甲烷菌都利用H2和CO2途徑產(chǎn)甲烷，其中很多種也利用甲酸.Methanosarcinales由甲基營養(yǎng)型甲烷菌構(gòu)成，利用含甲基的化合物如乙醇、甲胺等，其中Methanosarcina和Methanosaeta屬能夠利用乙酸，有些種還可以同時(shí)利用H2/CO2，是代謝多樣性最高的甲烷菌群. 多數(shù)甲烷菌是中溫菌，但也有些為嗜熱菌和耐低溫菌.2 產(chǎn)甲烷菌的生化代謝途徑甲烷菌的產(chǎn)甲烷過程包括一系列步驟，有眾多酶參

7、與（圖2），最終將CO2或C1化合物中的甲基還原成CH4.2.1 關(guān)鍵酶2.1.1 輔 酶 生物產(chǎn)甲烷過程需要多種酶和輔酶共同參與.這些輔酶根據(jù)其功能的不同可以分為兩類，一類是C1的攜帶者，主要包括甲烷呋喃（MF）、四氫甲烷蝶呤（H4MPT）、四氫八疊甲烷蝶呤（H4SPT）、輔酶 M（HS-CoM）. 另一類是電子載體，主要包括鐵氧化還原蛋白（Fd）、輔酶B（HS-CoB）、輔酶 F430、細(xì)胞色素、FAD、甲烷吩嗪（MP）、輔酶F42018-20. 下面就生物產(chǎn)甲烷過程中的幾種特殊輔酶進(jìn)行簡單介紹.MF包含一個(gè)呋喃環(huán)和一個(gè)氨基基團(tuán)，其中氨基碳用于結(jié)合CO2；H4MPT和H4SPT類似，均為四

8、氫葉酸的衍生物，用于甲酰、甲叉和甲基水平上C1的轉(zhuǎn)移，其轉(zhuǎn)移方式與四氫葉酸類似21. HS-CoM是輔酶中分子量最小的一種，化學(xué)名稱為2-巰基乙磺酸（HS-CH2CH2SO3-）22，在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下巰基上的氫原子被甲基基團(tuán)取代，是甲烷形成過程中的末端甲基載體. HS-CoB的化學(xué)名稱為磷酸-7-巰基庚基蘇氨酸（7-mercaptoheptanoylthreonine phosphate），它包含一個(gè)巰基和磷酸基團(tuán)，其中巰基為其活性部位. 輔酶F430是一種位于細(xì)胞膜上的含鎳的類卟吩（Porphinoid）化合物，其中Ni為其活性中心，它具有3個(gè)價(jià)態(tài)（+1、+2和+3），通過這3個(gè)價(jià)態(tài)的相

9、互轉(zhuǎn)變實(shí)現(xiàn)電子的轉(zhuǎn)移23. MP是一種僅存在于甲烷八疊球菌目中的一種輔酶，其功能與其它細(xì)菌呼吸鏈中的醌類相似20, 23. 輔酶F420是一種去氮黃素衍生物，其在波長為420 nm的紫外光下發(fā)出藍(lán)綠色熒光，可以利用這一特點(diǎn)初步鑒定是否存在產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞24-25. 輔酶F420的電勢較低，既可作為氫化酶、甲酸脫氫酶和一氧化碳脫氫酶的電子受體，又可作為NADP+還原酶的電子供體26.2.1.2 關(guān)鍵酶 圖2中反應(yīng)（12）和反應(yīng)（13）是生物產(chǎn)甲烷過程中共有的步驟. 其中反應(yīng)（12）是生物產(chǎn)甲烷過程的最后一步，它是由含鎳的甲基輔酶M還原酶（Mcr）催化，以HS-CoB為直接的電子供體還原CH3-S-

10、CoM產(chǎn)生甲烷和CoB-S-S-CoM的過程. 甲基輔酶M還原酶是產(chǎn)甲烷菌所特有的一種酶（除甲烷營養(yǎng)型古菌外）28. 因此，編碼Mcr其中的一個(gè)亞基基因（mcrA）可用于產(chǎn)甲烷菌的分類學(xué)研究29-31. Mcr由α、β和γ三種不同的亞基組成一個(gè)（αβγ）2六聚體結(jié)構(gòu)，同時(shí)，每分子Mcr中含有2分子位于酶的活性中心的含鎳輔酶F43032-33. 目前通過對該酶的晶體結(jié)構(gòu)分析推測該酶的催化過程分為3步，Ni(I)親核攻擊CH3-S-CoM形成中間產(chǎn)物HS-CoM和F430Ni(III)-CH3，隨后，Ni(III)氧化HS-CoM

11、形成硫自由基（Thiylradical）·S-CoM和F430Ni(II)-CH3，最后，HS-CoB作為電子供體還原·S-CoM形成CoB-S-S-CoM并將多余的電子轉(zhuǎn)移給Ni（II）產(chǎn)生Ni（I），H+裂解F430Ni(II)-CH3產(chǎn)生甲烷18, 34. Mcr具有兩種系統(tǒng)發(fā)育不同的同工酶，分別為McrI和McrII. Sabine等通過對Methanobacterium thermoautotrophicum的研究發(fā)現(xiàn)，該菌中同時(shí)具有兩種Mcr，在H2濃度高時(shí)，該菌以McrII為主，而在氫濃度低時(shí)，主要以McrI為主起催化作用35. 后期研究表明M. th

12、ermoautotrophicum中編碼這兩種同工酶的操縱子在該菌的生長初期主要編碼合成McrII，而在該菌的生長后期則主要編碼合成McrI，但對這個(gè)過程的具體機(jī)制目前還不清楚36-37.反應(yīng)（13）也是所有生物產(chǎn)甲烷所必需的. 其中CoB-S-S-CoM可以被視為產(chǎn)甲烷過程的末端電子受體，它被異質(zhì)二硫化物還原酶（Hdr）還原，重新釋放出HS-CoB和HS-CoM，其反應(yīng)方程式為CoB-S-S-CoM + 2e-+ 2H+→CoB-SH + CoM-SH38. Hdr是一種與膜相結(jié)合的蛋白，目前發(fā)現(xiàn)有兩種類型，一類是從Methanosarcina barkeri中分離得到的HdrED

13、，它由一個(gè)細(xì)胞色素，兩個(gè)嵌膜的Hdr亞基組成39. HdrED在還原CoB-S-S-CoM時(shí)以H2、F420H2或Fdred作為電子供體，通過細(xì)胞色素和甲烷吩嗪來傳遞電子，在這個(gè)過程中會消耗細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)子，產(chǎn)生跨膜質(zhì)子梯度用于合成ATP. 這種酶對于利用乙酸的產(chǎn)甲烷菌是必須的. 另一類是從Methanothermobacterthermoautotrophicum和 Methanothermobacter marburgensis中分離得到的HdrABC. 含有HdrABC的甲烷菌能夠利用CO2+ H2生長，不能合成細(xì)胞色素和甲烷吩嗪40. Thauer等利用模型推測，在這些沒有細(xì)胞色素的產(chǎn)甲

14、烷菌中存在由HdrABC中的黃素（Flavin）介導(dǎo)的電子歧化（Bifurcation）過程，認(rèn)為HdrABC不直接參與能量的儲存，而是與產(chǎn)甲烷過程第一步中的鐵氧化還原蛋白（Ferredoxin）的還原過程相偶聯(lián)，產(chǎn)生鈉離子梯度，用于ATP的合成19. Buckel等對這個(gè)過程進(jìn)行了詳細(xì)闡述41，具體過程見圖3. Buan等通過對5種Methanosarcinales進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，這些菌株的基因組中含有hdrED基因，也包含hdrACB基因，但是通過生化方法在Methanosarcinales中還未發(fā)現(xiàn)HdrABC；他們推測要么HdrED或HdrABC對細(xì)胞的生長條件存在偏好性，要么HdrED

15、或HdrABC具有特殊的生理功能42.2.2 生化代謝過程2.2.1 還原CO2途徑 還原CO2途徑廣泛存在于自然界中，除少數(shù)幾種產(chǎn)甲烷菌沒有還原CO2途徑外，絕大多數(shù)產(chǎn)甲烷均可以利用該途徑產(chǎn)甲烷19. 在還原CO2途徑中，絕大部分產(chǎn)甲烷菌以H2作為電子供體，在氫酶作用下將電子傳遞給Fdox還原CO2，因此這些菌又被稱作氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌（Hydrogenotrophic methanogen）. 大多數(shù)產(chǎn)甲烷菌也能夠利用甲酸作為電子供體還原CO2，它們通過依賴F420的甲酸脫氫酶和F420還原性氫酶將4分子甲酸轉(zhuǎn)化為4CO2和4H2，再利用H2和CO2產(chǎn)甲烷43. 也有少數(shù)產(chǎn)甲烷菌利用CO作為

16、電子供體，在這個(gè)過程中3CO先被氧化為3CO2產(chǎn)生電子，用于CO2還原產(chǎn)甲烷44-45. 下面就氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生化過程進(jìn)行詳細(xì)介紹.在圖2中，反應(yīng)（1）至（5）是利用H2還原CO2途徑的反應(yīng)過程. 反應(yīng)（1）至（4）由位于細(xì)胞質(zhì)中的酶復(fù)合體催化；反應(yīng)（5）是由位于細(xì)胞膜上的蛋白復(fù)合體催化. 反應(yīng)（1）由甲酰甲烷呋喃脫氫酶（Fdh）以還原的鐵氧化還原蛋白（Fdred）作為電子供體，還原CO2為甲酰基共價(jià)連接于甲烷呋喃（MF）的氨基基團(tuán)形成CHO-MF和氧化的鐵氧化還原蛋白（Fdox）46，F(xiàn)dox隨后利用H2作為電子供體，在能量轉(zhuǎn)化NiFe氫酶（Ech）的催化下產(chǎn)生Fdred，這個(gè)過程需要消

17、耗能量或需要反向電子流（Reverse electron transfer）. 不同產(chǎn)甲烷菌的Fdh的結(jié)構(gòu)具有一定的差異，但是其催化功能基本相似47. 接下來四氫甲烷蝶呤甲酰轉(zhuǎn)移酶催化甲酰甲烷呋喃上的甲?；D(zhuǎn)移到H4MPT的N5基團(tuán)上形成CHO-H4MPT 反應(yīng)（2）. 隨后甲酰四氫甲烷蝶呤環(huán)化水解酶和甲酰四氫甲烷蝶呤脫氫酶催化完成反應(yīng)（3）. 其中甲酰四氫甲烷蝶呤脫氫酶（Mtd）根據(jù)其利用的電子供體分為兩類：一類是輔酶F420依賴型，以輔酶F420H2作為電子供體48；另一類是H2依賴型，以H2作為電子供體. 隨后由甲酰四氫甲烷蝶呤還原酶以輔酶F420H2作為電子供體催化完成反應(yīng)（4）. 研

18、究發(fā)現(xiàn)該酶是輔酶F420依賴型酶，由一個(gè)亞基組成，沒有檢測到輔基49-50. 最后輔酶M甲基轉(zhuǎn)移酶（Mtr）催化完成反應(yīng)（5）將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到HS-CoM的硫醇基上形成CH3-S-CoM，伴隨著甲基的轉(zhuǎn)移會產(chǎn)生鈉離子梯度，用于ATP的合成51. Mtr是由mtrECDBAFGH操縱子編碼的，由8個(gè)亞基組成的嵌膜蛋白復(fù)合體52. 其中亞基MtrA中含有一個(gè)鈷胺素（I）輔基，它在催化循環(huán)中不斷地被甲基化和去甲基化，去甲基化的過程中伴隨著鈉離子被泵出細(xì)胞膜，產(chǎn)生鈉離子梯度53；從Mtr復(fù)合體中分離得到的MtrH能夠利用CH3-H4MPT催化自由鈷胺素（I）輔基轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆拟挵匪兀↖）輔基54；亞基

19、MtrE被認(rèn)為能夠?qū)trA中的類咕琳（Corrinoid）輔基上的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到輔酶M的巰基上，該反應(yīng)是依賴鈉離子的反應(yīng)55.2.2.2 乙酸途徑 自然界中約2/3的生物產(chǎn)甲烷來自于乙酸途徑，然而僅Methanosarcina和Methanosaeta能夠利用乙酸途徑產(chǎn)甲烷27. 它們通過裂解乙酸，還原甲基碳產(chǎn)CH4，同時(shí)氧化其羧基碳產(chǎn)生CO2. 在乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A的過程中，這兩種產(chǎn)甲烷菌具有不同的反應(yīng)機(jī)制. Methanosarcina通過乙酸激酶催化反應(yīng)（7）和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶催化反應(yīng)（8）利用1分子ATP催化乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A；而Methanosaeta則通過乙酰輔酶A合成酶利用2分

20、子ATP催化乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A56. 乙酰輔酶A再由一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合成酶復(fù)合體（Codh/Acs）催化以Fdox作為電子受體完成反應(yīng)（9），產(chǎn)生CO2和CH3-H4SPT. Codh/Acs是解乙酸途徑中的關(guān)鍵酶，用于剪切乙酰輔酶A上的CC和CS鍵. 在將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到H4SPT上形成CH3-H4SPT的同時(shí)，利用Fdox作為電子受體氧化CO產(chǎn)生CO2和Fdred，并將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到H4SPT上形成CH3-H4SPT. 不同的產(chǎn)甲烷菌所具有的Codh/Acs結(jié)構(gòu)有所差別，Methanosarcina thermophila中該酶由5個(gè)亞基（α、β、&gamm

21、a;、δ、ε）組成，包含α和ε亞基組成的Ni/Fe-S、γ和δ亞基組成的Co/Fe-S以及β亞基這3個(gè)部分57；M. barkeri中的Codh/Acs與其結(jié)構(gòu)相似58-59，但它包含一個(gè)獨(dú)特的類咕琳蛋白，推測其功能為接收甲基基團(tuán)60；而在Methanothrix soehngenii中僅由一個(gè)類似M.thermophila中Ni/Fe-S部分的α2β2組成61. 產(chǎn)生的Fdred在Ech的催化下產(chǎn)生H2和Fdox用于后續(xù)反應(yīng)，這個(gè)過程伴隨著離子梯度的產(chǎn)生. 反應(yīng)（9）中產(chǎn)生的CO2

22、可以在碳酸酐酶的作用下與H2O反應(yīng)生成碳酸反應(yīng)（10），這個(gè)過程可以移去細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多余的CO2，增加產(chǎn)甲烷的效率. 隨后四氫八疊甲烷蝶呤甲基輔酶M轉(zhuǎn)移酶催化完成反應(yīng)（11）產(chǎn)生CH3-S-CoM，這個(gè)過程與反應(yīng)（5）相似，也能夠產(chǎn)生鈉離子梯度，用于合成ATP.2.2.3 甲基營養(yǎng)途徑 自然界中，僅甲烷八疊球菌目以及甲烷球菌目中的Methanosphaera能夠利用甲基營養(yǎng)途徑產(chǎn)甲烷27.該途徑包含兩種代謝模式，第一種為H2依賴型代謝模式，它以H2作為電子供體，還原甲基化合物中的甲基基團(tuán)產(chǎn)甲烷62-63.第2種模型為嚴(yán)格的甲基營養(yǎng)型，一部分甲基化合物被氧化產(chǎn)生CO2以及還原當(dāng)量，用于還原甲基化合物

23、中的甲基基團(tuán)產(chǎn)甲烷18, 21. 這也是大多數(shù)甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的代謝途徑，它們僅以甲基化合物為底物產(chǎn)甲烷，具體反應(yīng)過程見圖2.甲基化合物首先在特殊的輔酶M甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（Mt）的作用下以HS-CoM作為電子供體，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到HS-CoM的巰基上產(chǎn)生CH3-CoM 反應(yīng)（6）. 不同的底物所對應(yīng)的Mt不同，甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌能夠利用的底物主要包括甲醇（Mta）64、一甲胺（Mtm）65、二甲胺（Mtb）66、三甲胺（Mtt）67、甲硫醇（Mts）68. 每種Mt均包含一個(gè)具有底物特異性的類咕琳蛋白和兩個(gè)不同的甲基轉(zhuǎn)移酶，分別表示為MT1（MtaB、MtmB、MtbB和MttB）和MT2（M

24、taA、MtbA和MtsA），其中MT1催化還原態(tài)的類咕琳蛋白甲基化，MT2催化類咕琳蛋白上的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到HS-CoM上，僅二甲硫醚所具有的Mt是由兩個(gè)相同的MtsA組成69-70. 通過對這些甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的基因序列對比分析發(fā)現(xiàn)，MT2蛋白序列具有高度相似性，其活性中心均含有鋅，同時(shí)其對應(yīng)的類咕琳蛋白的序列也具有一定的相似性，而用于激活底物的MT1蛋白不具有系統(tǒng)發(fā)育相似性23.隨后，在H2存在的條件下，CH3-CoM利用H2作為電子供體經(jīng)反應(yīng)（12）和（13）產(chǎn)甲烷；在沒有H2的條件下，一部分CH3-CoM經(jīng)過反應(yīng)（4）至反應(yīng)（1）的逆反應(yīng)被氧化產(chǎn)生CO2、F420H2和H2，另一部分CH

25、3-CoM利用F420H2和H2作為電子供體經(jīng)反應(yīng)（12）和（13）產(chǎn)CH4.2.3 能量產(chǎn)生比較產(chǎn)甲烷菌的能量產(chǎn)生主要依賴于鈉離子或質(zhì)子跨膜梯度，驅(qū)動位于細(xì)胞膜上的ATP合成酶將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，反應(yīng)（1）、（5）、（9）、（11）、（12）、（13）與鈉離子或質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)相偶聯(lián). 不同途徑生物產(chǎn)甲烷過程的總反應(yīng)方程式及其自由能見表1，其中還原CO2產(chǎn)甲烷途徑產(chǎn)生的凈能量最高，甲基營養(yǎng)型次之，乙酸途徑最低.在絕大多數(shù)產(chǎn)甲烷過程中，甲基轉(zhuǎn)移過程是能量儲存的關(guān)鍵步驟，它能夠直接驅(qū)動鈉離子異位. 然而甲基營養(yǎng)型和氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的能量儲存過程存在一定的差異71. 甲基營養(yǎng)型甲烷菌具有細(xì)胞色素和一個(gè)質(zhì)

26、子移位電子傳輸鏈，它們用于在反應(yīng)最后儲存產(chǎn)甲烷過程中釋放的能量. 而氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌不具備這些組分，同時(shí)，其反應(yīng)第一步反應(yīng)（1）是耗能反應(yīng)，還不清楚在能量儲存過程中如何獲得反應(yīng)（1）所需的能量. 近期，Thauer等提出了電子歧化機(jī)制（即釋能的電子流動直接驅(qū)動耗能的電子流動）來解釋這個(gè)問題19. 它們將利用H2/甲酸還原CO2產(chǎn)甲烷的途徑根據(jù)菌體中是否含有細(xì)胞色素分為兩類（I類：不含細(xì)胞色素；II類：含有細(xì)胞色素）. 總體而言，這兩類途徑中涉及到能量消耗過程均為反應(yīng)（1），儲能的過程均為反應(yīng)（5）、（12）、（13）. 但是這兩類途徑在反應(yīng)（1）和反應(yīng)（13）的能量消耗和儲存過程中存在一定的差

27、異. I類途徑利用黃素介導(dǎo)的電子歧化過程，利用Ech和Hdr酶復(fù)合體以及黃素蛋白和Fd作為電子載體，將反應(yīng)（1）Fdox的還原過程（耗能過程）與反應(yīng)（13）異質(zhì)二硫化物的還原過程（產(chǎn)能過程）偶聯(lián)在一起，并產(chǎn)生鈉離子梯度41.II類途徑反應(yīng)（1）和反應(yīng)（13）獨(dú)立進(jìn)行. 反應(yīng)（1）所需的能量直接由鈉離子所產(chǎn)生的電化學(xué)電勢提供，反應(yīng)（13）利用甲烷吩嗪還原性氫酶氧化H2，并且以甲烷吩嗪和細(xì)胞色素作為電子載體，還原CoB-S-S-CoM，這個(gè)過程會產(chǎn)生鈉離子梯度23. II類途徑產(chǎn)生的能量略高于I類途徑19.對比表1數(shù)據(jù)可知，在甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑中，利用甲醇產(chǎn)甲烷過程中產(chǎn)生的凈能量相對于其它甲基化

28、合物更高，并且含氮的甲基化合物所產(chǎn)生的能量相近，但是都明顯低于還原CO2途徑. 甲基營養(yǎng)途徑中，由于產(chǎn)生CO2的過程是反應(yīng)（5）至反應(yīng)（1）的逆反應(yīng)，故產(chǎn)生CO2的過程是耗能反應(yīng)27.因此甲基營養(yǎng)途徑產(chǎn)生的凈能量低于還原CO2途徑.對于乙酸途徑，其消耗能量的過程為反應(yīng)（7），至少需要1個(gè)ATP用于活化乙酸；其能量產(chǎn)生的過程為反應(yīng)（9）、（12）和（13），其中反應(yīng)（12）和（13）產(chǎn)生的能量與另兩個(gè)途徑相近，而反應(yīng)（9）產(chǎn)生的能量較低，從而導(dǎo)致其為產(chǎn)生凈能量最低的產(chǎn)甲烷途徑.3 產(chǎn)甲烷菌的基因改造及代謝模型近年來，通過傳統(tǒng)研究方法主要包括菌種分離技術(shù)、酶分離技術(shù)、同位素示蹤等方法已分離了約20

29、8個(gè)產(chǎn)甲烷菌種，研究了其生理特征、關(guān)鍵酶以及電子傳遞過程等，對產(chǎn)甲烷菌的基本代謝途徑已經(jīng)有了深入系統(tǒng)的認(rèn)識. 但是，自然界中仍然還存在許多難以分離的產(chǎn)甲烷菌，其可能具有某些特殊的代謝途徑. Andrew等在海洋沉積物中分離到3株Methanococcoides，它們能夠通過部分脫甲基化作用，利用甜菜堿作為底物產(chǎn)甲烷72. 同時(shí)，由于部分產(chǎn)甲烷菌中的酶難以分離，因此一些認(rèn)識是基于生物信息學(xué)比對或理論推測得到的.隨著基因改造、基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展，對產(chǎn)甲烷菌的代謝途徑和過程調(diào)控的認(rèn)識已越來越深入全面. Methanococcus和Methanosarcina這兩個(gè)屬分別代表H2/CO2和甲基營養(yǎng)（包括乙酸）途徑，對這兩個(gè)屬已經(jīng)開發(fā)了一些遺傳工具，研究其生化代謝和遺傳特征，包括可復(fù)制的穿梭載體73-74、反選擇75-76和異位整合75, 77等基因操作技術(shù). Farkas等對古菌基因工程技術(shù)的方法及應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)78. 基因工程改造不僅可以拓寬產(chǎn)甲烷菌的代謝底物79，也有助于發(fā)現(xiàn)新的代謝途徑80. Daniel等通過基因工程的方法成功地將好氧細(xì)菌Pseudomonas veronii中的酯酶（可以水解多種酯