基因工程載體

1、第三章 基因工程載體體外獲得的任一 DNA 片段 ,必須插入到可以自我復(fù)制的載體內(nèi) ,再轉(zhuǎn)入宿主細胞 ,才能得到復(fù)制和進行表達?；?因工程載體 （Vectors）就是攜帶外源基因進入受體細胞進行繁殖和表達的一種工具。 載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件基因工程中 3 種主要類型的載體：1.質(zhì)粒載體3.柯斯質(zhì)粒 （ cosmid）載體2. 噬菌體載體 基因工程對載體的要求（ 1）在宿主細胞內(nèi)能獨立復(fù)制。（ 4）分子量小， 拷貝數(shù)多。（ 2）有選擇性標記。（ 3）有一段多克隆位點。（5）容易從宿主細胞中分離純化。外源 DN

2、A 插入其中不影響載體的復(fù)制。第一節(jié) 質(zhì)粒 （plasmid） 載體質(zhì)粒是一種獨立于染色體外的雙鏈閉環(huán)的 DNA 分子， 具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力， 能在子代細胞中保持恒定 的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿 主細胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。（一）質(zhì)粒的構(gòu)形環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒 DNA 在提取過程中通常出現(xiàn)三種不同的構(gòu)型： 共價閉合環(huán)形 DNA （ cccDNA） 開環(huán) DNA （ open circular,ocDNA ） 線形 DNA （ linear,lDNA ）二）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性指質(zhì)粒從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞的特

3、性。接合型質(zhì)粒： 除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外， 還帶有一套控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如： F 質(zhì)粒（性質(zhì)?；?F 因子）甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到 原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。不符合基因工程的安全要求。非接合型質(zhì)粒： 帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因而不能從 一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞。如 R 質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒） 、 Col 質(zhì)粒（細菌素質(zhì)粒） 。符合基因工程的安全要求。R 質(zhì)粒： 帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。Col 質(zhì)粒： 細菌素通過與敏感細菌細胞壁的結(jié)合作用，抑制一

4、種或數(shù)種細胞生命過程。 帶有控制大腸桿菌素 （ colicin）合成的基因。 大腸桿菌素對不帶 Col 質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col 質(zhì)?；?R 質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。某些非接合型質(zhì)粒（ Col E1 ）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下也能 DNA 轉(zhuǎn)移，這個過程由 bom和 mob 基因決定。（三）質(zhì)粒的復(fù)制類型1.嚴緊型 質(zhì)粒（ stringent plasmid ）低拷貝數(shù) ，有 13 份的拷貝；（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴緊型）2.松弛型 質(zhì)粒（ relaxed plasmid ）高拷貝數(shù)， 10200 份拷貝。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受

5、宿主細胞蛋白質(zhì)合成的控制，因此，當用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素（Cml ）處理寄主細胞，使大腸桿菌染色體 DNA 復(fù)制受阻時，松弛型質(zhì)粒 DNA 仍可繼續(xù)擴增（氯霉素抗性質(zhì)粒例外） 。而嚴緊型 質(zhì)粒的復(fù)制受到宿主細胞蛋白質(zhì)合成的嚴格限制， 其拷貝數(shù)不能通過用氯霉素來增加， 對于有劑量限制的基因克 隆需要使用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體Col E1 、pMB1 派生質(zhì)粒 , 而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下） 仍能復(fù)制，達到每個細胞的拷貝數(shù) 10003000 個！適合大量增殖克隆基因或需要表達大量的基因產(chǎn)物。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體pSC101派生的載體 , p

6、LG338 、 pLG339 、 pHSG415 等,不適合大量擴增 DNA 用。 但當有些被克隆的基因的表達產(chǎn)物過多時會嚴重地影響寄主菌的正常代謝活動， 導(dǎo)致寄主菌死亡時， 就 需要低拷貝的載體。大多數(shù)的質(zhì)粒載體都有一個來源于 pMB1 質(zhì)粒的復(fù)制子，而且使用抗菌素抗性記號，主要有：四環(huán)素抗性（ Tetr ）氨芐青霉素抗性（ Ampr ）鏈霉素抗性（ Strr ）卡那霉素抗性（ Kanr ）氯霉素抗性（ Cmlr ）抗菌素抗性記號具有便于操作，易于選擇等優(yōu)點。（四）質(zhì)粒的不親和性：實驗觀察表明， 同一個大腸桿菌細胞中， 在沒有選擇壓力的情況下， 兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒一般是 不能夠同時共

7、存的，其中必有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這種現(xiàn)象就是質(zhì)粒的不親和性。兩種質(zhì)粒彼此之 間互不相容，這樣的質(zhì)粒屬于同一個不親和群，而彼此能夠共存的質(zhì)粒則屬于不同的不親和群。質(zhì)粒的不親和性，主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成的。大多數(shù)質(zhì)粒都會產(chǎn)生出一種控制 質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白， 其濃度是與質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比的。 當同一細胞中兩種不相容質(zhì)粒的拷貝數(shù)不相等時， 高 拷貝數(shù)的質(zhì)粒對復(fù)制抑制劑的敏感性較低拷貝數(shù)的質(zhì)粒要差一些， 于是在抑制劑濃度達到可抑制低拷貝質(zhì)粒復(fù)制 的水平時，高拷貝的質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，從而最終使低拷貝質(zhì)粒從混合細胞中消失。因此，如果同一個細胞中含有兩種相容的質(zhì)粒，由于它們的復(fù)

8、制機理不同，每種質(zhì)粒所產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì) 都不會影響另一種質(zhì)粒的復(fù)制，兩種質(zhì)粒都保持著自己正常的拷貝數(shù)，而與另一種質(zhì)粒毫不相關(guān)。相反，如果同 一個細胞含有的是兩種 不相容 的質(zhì)粒， 它們的 復(fù)制機理相同 ，各自產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)不僅調(diào)節(jié)自身的復(fù)制， 而且 也會調(diào)節(jié)另一種與之共存的不相容質(zhì)粒的復(fù)制。這種交叉抑制的結(jié)果，使細胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)比其單獨感染狀態(tài)下的正?？截悢?shù)減少許多。其原因是在這種 情況下，每一種質(zhì)粒的復(fù)制速率和拷貝數(shù)控制，都是由一對不相容質(zhì)粒產(chǎn)生的阻遏蛋白質(zhì)總濃度聯(lián)合調(diào)控的。天然質(zhì)粒載體：1. pSC101: 第一個成功地用于克隆實驗的大腸桿菌質(zhì)粒載體（克隆非洲爪蟾 ）。嚴緊型 質(zhì)粒, 1

9、2 個拷貝不能用氯霉素擴增2. ColE1 ：松弛型 質(zhì)粒，大小 6.3kb，可用氯霉素擴增，其拷貝數(shù)可達 10003000。二、理想質(zhì)粒載體的條件? 具有復(fù)制起點 這是質(zhì)粒自我增殖所必不可少的基本條件， 可使繁殖后的細胞維持一定的質(zhì)?？截悢?shù)。 一 般情況下，一個質(zhì)粒只含有一個復(fù)制起點，構(gòu)成一個獨立的復(fù)制子。? 帶有兩種抗菌素抗性基因 且抗性基因內(nèi)有若干單一的酶切位點，那么當該位點插入外源 DNA 時，就 會導(dǎo)致此抗性基因失活，從而便于篩選重組體。? 具有若干限制酶單一識別位點 這樣既可以有選擇地供帶有不同末端的外源 DNA 定點插入，又可方便 地將外源 DNA 片段回收。載體上的多克隆位點（

10、 MCS）即具有該功能。? 卻失 mob 基因 這樣質(zhì)粒就不會從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞， 即能轉(zhuǎn)化但不擴散。? 較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 小分子量的質(zhì)粒易于操作，更能抵抗機械剪切力的切割，可容納外源DNA 片段也更長（不超過 15kb ），且可有效地轉(zhuǎn)化給受體細胞；小分子量的質(zhì)粒往往屬于松弛型質(zhì)粒， 在細胞中拷貝數(shù)較高，擴增后回收率高。最后，低分子量的質(zhì)粒載體，相應(yīng)地對限制酶具有多重識別位 點的機率降低。三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建對天然質(zhì)粒加以人工改造的內(nèi)容： 刪除一些非必要區(qū)段及對宿主有不良影響的區(qū)段，削減載體分子量，使 載體具有更大的容納外源片段的能力； 加上易于選擇或檢測的標記； 限制性內(nèi)切

11、酶酶切位點的改造，便于外 源基因插入到載體中的特定位置； 加上一些調(diào)控元件，有利于克隆基因的表達； 安全性改造，限定載體的宿 主范圍。凡經(jīng)改建而適于作為基因克隆載體的所有質(zhì)粒 DNA 分子，都必定包括三種共同的組成部分，即 復(fù)制基因、 選擇性記號和克隆位點。四、常用的質(zhì)粒載體類型 （一）克隆質(zhì)粒載體1. pBR322 ： F.Bolivar 和 R.L.Rodriguez 人工構(gòu)建（ BR ， not bacterial resistence）1.元件來源 復(fù)制起點 ori pMB1 系列（來源于 Col E1）的高拷貝型復(fù)制起點 Ampr 基因pSP2124質(zhì)粒的 Ampr 基因 Tetr

12、基因 pSC101 的 Tetr 基因。pBR322 質(zhì)粒的優(yōu)點： 雙抗菌素抗性選擇標記插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細胞在 Amp 或 Tet 中都死亡。 獲得載體的寄主細胞在 Amp 或 Tet 其中之一中死亡。 分子小，克隆能力大 載體越小越好。 10kb 的 DNA 在純化過程中容易斷裂。 高拷貝數(shù) 氯霉素擴增之后，每個細胞可達 10003000copy 安全 失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因 mob （ mobilization ），不能通過接合轉(zhuǎn)移。2.pUC 系列選擇標記 Ampicillin 抗性和 lacZ 的肽互補（藍白斑）相結(jié)合。藍白斑選擇原理： Xgal （ 5-Bro

13、mo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside lacZ 的肽互補 受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成 4 聚體的活性酶，不能分解 Xgal 。pUC 質(zhì)粒載體上的 lacZ 編 碼肽與這個缺失突變的 -半乳糖苷酶“互補”，使它能形成 4 聚體，分解 Xgal ，產(chǎn)生藍色物質(zhì)。受體菌株： JM 系列、 TG1、TG2、XL1-blue 、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a互補的插入失活pUC 載體上 LacZ的 5端有一段多克隆位點 （MCS）區(qū)，本身雖不干擾 LacZ的合成，但插入外源基因就會 阻止 LacZ

14、的合成。不能互補 IPTG 的誘導(dǎo)作用IPTG 是乳糖的類似物。能誘導(dǎo) lac 操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄， 使受體菌基因組中的 lacZ 的 C 端部分和載體的 lacZ 肽都表達。從而互補。但載體 MCS 上插入外源 DNA 后，仍然不能產(chǎn)生 肽！pUC 系列載體的優(yōu)點：（ 1）更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。如pUC8 為 2750bp，pUC18 為 2686bp，不經(jīng)過氯霉素擴增，拷貝數(shù)即可達500 700 拷貝。（ 2）選擇方便。 Xgal 顯色、抗菌素雙重直接選擇。（ 3）具有多克隆位點 MCS 區(qū)段。可以使兩種不同粘性末端的外源 DNA 片段，無需借助其它操作而直接克隆到 pUC 質(zhì)粒載體上

15、。克隆載體 （cloning vector）為使插入的外源 DNA 序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。（ 二 ）表達載體 （expression vector）為使插入的外源 DNA 序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。（三）穿梭質(zhì)粒載體（ shuttle plasmid vectors）： 人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點和選擇標記、可以在兩種不同的寄主細胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。由于真核細胞基因的表達調(diào)控要比原核細胞基因復(fù)雜得多，所以用于真核細胞的克隆和表達載體大多 是穿梭載體。穿梭載體的優(yōu)點 利用大腸桿菌進行基因克隆、表達 也能利用其它細胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳

16、動物細胞等）進行基因表達 可以自如地在兩種不同寄主細胞之間來回轉(zhuǎn)移基因。 第二節(jié) 噬菌體載體 一、噬菌體的生物學(xué)特性噬菌體是一類細菌病毒（ Bacteriophage ）。噬菌體的 DNA 分子中除了 復(fù)制起點 外，還有 編碼外殼蛋白質(zhì)的 基因。噬菌體大多數(shù)由二十面體頭部和中空的尾部組成，在頭部的蛋白質(zhì)外殼中含有 DNA 。最常見的是雙鏈線 性 DNA ，此外還有雙鏈環(huán)形 DNA 、單鏈環(huán)形 DNA 和單鏈線性 DNA 等多種形式。噬菌體的感染效率極高， 只要有一個噬菌體顆粒感染了一個細菌細胞之后， 便可迅速地形成數(shù)百個子代 噬菌體顆粒，如此重復(fù)四次感染周期，一個噬菌體顆粒便能夠使數(shù)十億個的細

17、菌細胞致死。噬菌體的生命周期分為 溶菌周期 和 溶源周期 兩種類型。只具有溶菌生長周期的噬菌體叫 烈性噬菌體 （virulent phage） 。 只有雙鏈 DNA 的噬菌體才具有溶源周期。既能進入溶菌生命周期又能進入溶源生命周期的噬菌體叫 溫和噬菌體 （temperate phage）。 具有一套完整的噬菌體基因組的細菌叫做溶源性細菌。在溶源性細菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體 DNA 叫做 原噬菌體 （prophage）。作為細菌寄生物的噬菌體， 它可以在脫離寄主細胞的狀態(tài)下保持自己的生命， 但一旦脫離了寄主細胞就既不 能生長也不能復(fù)制。 盡管大多數(shù)的噬菌體都具有編碼多種蛋白質(zhì)的基因， 可實

18、際上所有已知的噬菌體都是在寄主 細胞內(nèi)，利用寄主細胞的核糖體，合成蛋白質(zhì)的因子、各種氨基酸及產(chǎn)能體系，進行生長和生殖的。這種對于寄 主細胞的依賴性，是噬菌體最具特色的一種生物學(xué)特性。 噬菌體的 DNA 既可以以線性存在， 又可以環(huán)狀形式存在。 因為在 噬菌體線性 DNA 分子的兩端各有一個 12bp 組成的天然黏性末端， 當 DNA 被注入寄主細胞后，便會迅速地通過黏性末端的互補作用形成雙鏈環(huán)形。成環(huán) 后的黏性末端部位叫做 cos 位點 。 噬菌體還有以下一些優(yōu)點： （ 1）人們對其生物學(xué)特性及遺傳學(xué)背景都有深刻的研究，因而在設(shè)計 噬菌體載體時，有把握判斷 基因組中可刪除的區(qū)段和可利用的特點；

19、 （2）噬菌體較質(zhì)粒載體的寄主范圍要窄得多，因此 作為基因克隆載體自然也就更加安全； （3）DNA 的兩個 5，端具有 12bp 完全互補的粘性末端，可用來構(gòu)建柯 斯質(zhì)粒（ cosmid），這對構(gòu)建真核基因組片段的基因文庫是特別有用的載體。野生型的 噬菌體 DNA ，分子量大，對常用的核酸內(nèi)切限制酶具有過多的酶切位點 （如 5個 EcoR限制位點， 7個 Hin d限制位點） ，沒有選擇標記，而且具有感染性，顯然它本不適于用作基因克隆的載體，因此有必要將 噬菌體的非必要（ J 基因到 N 基因）區(qū)段和多余的酶切位點進行刪除，以便改造成適用的克隆載體。野生型的 噬菌體 DNA ，分子量大，對常用

20、的核酸內(nèi)切限制酶具有過多的酶切位點（如 5個 EcoR限制位點，7個 Hin d限制位點） ，沒有選擇標記，而且具有感染性，顯然它本不適于用作基因克隆的載體，因此有必要將 噬菌體的非必要（ J 基因到 N 基因）區(qū)段和多余的酶切位點進行刪除，以便改造成適用的克隆載體。噬菌體的改造：刪除約占總 DNA 長度 1/3 的非必要區(qū)段，減小分子量；通過體內(nèi)突變，消減酶切位點數(shù)，在非必要區(qū)保留 某些限制酶 1-2 個切口，以便外源 DNA 片段的插入或取代；添加選擇標記基因；通過某些基因的無義突變將它 改造成安全載體，以利于生物學(xué)防護。三、常用的 噬菌體載體（ 1）插入型載體（ insertion ve

21、ctors ）：可插入長度 10kb的外源 DNA 。當外源 DNA 插入到 載體分子上，會使 噬菌體的某種生物功能喪失效力， 即插入失活效應(yīng)。 根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性， 插入型的 載體又分免疫功能 失活和大腸桿菌 -半乳糖苷酶失活兩種亞型。（a）免疫功能失活型：插入位點位于載體合成活性阻遏物區(qū)域（ cI 基因）內(nèi)。 選擇標記：插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物， 載體不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。無外源 DNA 插入的 載體感染受體菌形成渾濁的噬菌斑。（ 2） 置換型載體（ substitution voctors ）：兩個多克隆位點區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于 DNA 的非必要區(qū)

22、兩側(cè)。 可插入長度約為 20kb 的外源 DNA 。在可取代的區(qū)段中帶有 lacZ 基因的相應(yīng)序列時， 重組體亦可用 -半乳糖 苷酶失活法進行篩選。Spi正選擇取代型載體：改良的 噬菌體載體還有一個特點，在它們其中心限制片段上具有 噬菌體的 red 和 gam兩個基因。野生型的 噬菌體，不能夠在 P2 噬菌體溶源性細菌中生長，其表型為Spi+ 。如果噬菌體喪失了red 和 gam 基因， 噬菌體突變體則獲得了 Spi的表型， 能夠在噬菌體 P2溶源性的大腸桿菌細胞中生長并形成噬 菌斑。在應(yīng)用具有 red 和 gam 基因的置換型載體作基因克隆時，可以按照 Spi 特性來選擇重組體， Spi表型

23、為 我們提供了一種正選擇標記。噬菌體作為載體的優(yōu)點：1. 基因組中有 1/3 的非必要區(qū)， 可以被置換， 改造后的載體克隆片段可達 20kb，而質(zhì)粒載體僅有幾個 kb。2. 用噬菌體 DNA 作為載體，即使不進行體外包裝，轉(zhuǎn)染的頻率也比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率高，包裝后效率更高。3. 可通過溶源化反應(yīng)整合到寄主染色體上，當不需要外源基因大量表達時，可讓它以溶源性存在，若要 表達，可通過誘導(dǎo)進入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體，得到的重組 DNA 的拷貝數(shù)就更多。噬菌體作為載體的不足：1.需要包裝，其操作比較麻煩，包裝率又不穩(wěn)定，購買包裝蛋白的費用高； 2.沒有質(zhì)粒的用途廣泛。（ 1）大小46kb（2）組成

24、DNA ： cos 序列和控制包裝的 的序列。pBR322 :質(zhì)粒的復(fù)制子 抗藥性基因 幾個限制性酶的單一位點（ 3） cosmid vector 的特點具有 噬菌體的特性：在寄主細胞內(nèi)形成環(huán)化 DNA （但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌） 克隆外源 DNA 后可以體外包裝成噬菌體顆粒。 具有質(zhì)粒載體的特性：大多帶有 pMB1 或 Col E1 的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。 方便的選擇：有抗菌素抗性基因和插入失活的克隆位點。 高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于 30kb）。51kb-5kb=45kb 包裝限制作用（ 4） cosmid 克隆的一般過程用特定的核酸內(nèi)切酶消化真核生物 DNA

25、 。 用同樣的內(nèi)切酶消化 cosmid 載體。連接 產(chǎn)物中將有一定比例的分子是兩端各有一個cos位點、長度 40kb 左右的真核 DNA 與載體的連接物。 Ter 體系識別并切割 切割合適長度的雜種 DNA 連接物，并包裝入噬菌體頭部。 感染大腸桿菌 注入到細菌體內(nèi)的雜種 DNA 分子環(huán)化，并按質(zhì)粒的方式 復(fù)制?！岸嗦?lián)體 ”復(fù)制： 噬菌體的生命周期中，會產(chǎn)生數(shù)百個 DNA 通過 cos位點連接的 “多聯(lián)體 ”分子。Ter 體系：在包裝的時候， 噬菌體具有位點特異的末端酶（ terminase）體系（ Ter 體系），識別 cos位點，把多聯(lián) 體切成單個 DNA 長度。兩個 cos位點之間，必須保持 3845kb 的 DNA ， Ter 體系才能識別。（ 5） cosmid 載體克隆的缺點 cosmid 分子之間的自我連接。外源 DNA 片段之間的連接并插入載體。為解決這一問題， 可采用 pJB8 的一種特殊克隆方案。 該載體在 BamH 識別位點的兩側(cè)各有一個 Eco R識 別位點，若在 BamH位點克隆了外源 DNA 片段，可通過 EcoR的切割作用，將外源片段重新刪除下來。（ 6） cosmid 載體的改良 Ish-Horowice-Burke 改良方案 pJB8 cosmid 載體1981 年， D. Ish-Horowice