銀染考染膠內(nèi)酶解

1、膠內(nèi)酶解試劑及材料準(zhǔn)備:EP管清洗液：100ml終濃度0.1%的三氟乙酸（TFA）和50%的乙腈涮洗TFA0.1%0.1ml乙腈50%50ml水定容至100ml脫色液：100ml現(xiàn)配A液：30 mM儲(chǔ)液室溫下鐵氰化鉀（k3Fe（CN）6） 0.99 g 去離子水100mlB液：100 mM儲(chǔ)液室溫下硫代硫酸鈉（Na2S2O3H2O）2.48 g去離子水100 ml脫色工作液：A與B等體積混合,100 mM NH4HCO 3： 250ml 室溫保存NH4HCO 3去離子水1.975 g250ml,100 mM DTT還原緩沖液：1ml 現(xiàn)配（二維凝膠銀染不用）Dll100 mM NH4HCO 3

2、15.4 mg1 ml55 mM碘乙酰胺（iodoacetamide）烷化緩沖液：1ml現(xiàn)配（二維凝膠銀染不用）碘乙酰胺100mM 的 NH4HCO310.2 mg1 ml酶解緩沖液：1ml(含 9%乙腈(acet on itrile ), 40 mM NH4HCO 3)100 mM NH4HCO3乙腈加水至0.4 ml0.09 ml1 ml胰酶儲(chǔ)液：1ml -20 C保存，可用4周凍干的胰酶（trypsin）粉劑20 ug/管（sigma）。溶于100ul 1 mM的HCI ,再加入900 ul含9 % 的乙腈（aceto nitrile ）、40 mM NH4HCO 3的酶解緩沖液中。終濃

3、度為 20 ug/ml，分裝成20ul/ 管。20 ug100 ul900 ul胰酶1 mM HCI酶解緩沖液萃取液：10ml1.90 %乙腈與10 %三氟乙酸10ml乙腈90%9ul三氟乙酸10%1ul水定容至10ml2. 50%乙腈與5%三氟乙酸10ml乙腈50%5ul三氟乙酸5%0.5ul水定容至10ml膠內(nèi)酶解: 一、脫色（銀染）1. 去離子水沖洗凝膠，每次10 min，23次（搖床）2. 用刀片割下的蛋白點(diǎn)置于eppendof管中，注意盡可能接近蛋白點(diǎn)以減小背景膠，同時(shí) 用非蛋白區(qū)域膠做空白3. 用去離子水沖洗兩次后，把膠切成小塊（可?。＜尤胄迈r制備的脫色工作液50 ul，約12

4、min可見(jiàn)膠的棕色消失，吸去溶液。用水沖洗至無(wú)淡黃色溶液產(chǎn)生，加入50 ul 100mM的NH4HCO3沖洗一遍4. 吸掉所有液體，加入 50ul無(wú)水乙腈脫水兩遍，直至膠縮小變白為止5. 置于真空干燥離心機(jī)中抽干脫色（考染）1. 同上2. 同上3. 加入100ul含30%乙腈的100 mM的NH4HCO3溶液脫色，可振搖，直到藍(lán)色脫去為止4. 同上5. 同上二、還原和烷化（二維凝膠銀染不需要）1. 加入50 ul還原緩沖液（100 mM DTT ） , 57 C保溫1 h還原蛋白30 min，使之碘2. 室溫冷卻，去掉過(guò)量液體，迅速加入同體積烷化緩沖液，室溫暗處放置 乙?；?. 反應(yīng)完成后用100 mM NH4HCO3沖洗兩次，用乙腈脫水，凍干三、酶解1. 每管抽干的膠塊中加入約20ul酶液，置冰上30 min，使其充分吸脹2. 吸脹后將多余的酶液吸去，再加入 20 ul不含胰酶的酶解緩沖液覆蓋，37 C消化過(guò)夜（1012 h）,注意酶解過(guò)程中保持膠塊濕潤(rùn)四、萃取1 . 酶解后的上清液移至另一eppendorf 管中取液萃取兩次：90乙腈： 10 TFA15 min50乙腈： 5