二硫鍵蛋白表達(dá)策略的研究新進(jìn)展(3)

1、二硫鍵蛋白表達(dá)策略的研究新進(jìn)展(3)3.3.1 Erv1p 體系在二硫鍵蛋白表達(dá)中的應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)隔室的情況相反，它們存在二硫鍵從頭形成的催化酶，如巰基氧化酶，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ero1、釀酒酵母線粒體內(nèi)膜空間的 Erv1p 等。如果向大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)引入二硫鍵從頭形成體系，可能會(huì)大幅提高活性蛋白的產(chǎn)率。但是，此類巰基氧化酶不是直接作用于底物，它們需要媒介蛋白的輔助，如 Ero1 依賴 PDI,Erv1p 依賴 Mia40 等34.另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adeninedinucleotide, FAD）存在時(shí)，釀酒酵母的 Erv1p 可能獨(dú)立于 Mia40,直接利用氧氣分子催化巰

2、基形成二硫鍵35.另外，人們發(fā)現(xiàn)沒(méi)有任何輔因子時(shí)，Erv1p能有效地使變性牛胰胰蛋白酶抑制劑（含兩對(duì)二硫鍵）重新恢復(fù)自然狀態(tài)34.因此 Erv1p 可能是一種單獨(dú)的催化二硫鍵從頭形成的氧化酶。利用這一特性，2010 年 Hatahet 等34將釀酒酵母的 Erv1p 引入野生型大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)，首次獲得比 （trxB-, gor-） 菌株產(chǎn)率更高的活性目標(biāo)蛋白。他們的結(jié)果不僅顛覆了長(zhǎng)久以來(lái)野生型原核細(xì)胞質(zhì)不能產(chǎn)生二硫鍵的普遍觀點(diǎn)，還使人們認(rèn)識(shí)到蛋白的氧化折疊除與反應(yīng)環(huán)境相關(guān)，還與催化酶類有關(guān)。隨后，Nguyen 等36報(bào)道，利用預(yù)表達(dá)體系可進(jìn)一步提高 Erv1p 對(duì)蛋白氧化的促進(jìn)效應(yīng)。但同時(shí)還需

3、要融合標(biāo)簽防止折疊中間體聚集。他們通過(guò)在細(xì)胞質(zhì)預(yù)先表達(dá) Erv1p 與二硫鍵異構(gòu)酶，使活性 vtPA（含有 9 對(duì)二硫鍵）的產(chǎn)量比過(guò)去僅依靠 DsbC 共表達(dá)時(shí)提高 800 倍以上。另外，該體系也可應(yīng)用于分子間二硫鍵蛋白，如人類抵抗素（Resistin）是一種抑制脂肪細(xì)胞攝取糖分的激素，成熟的 Resistin 含有 5 對(duì)二硫鍵，并依靠 1 對(duì)分子間二硫鍵形成同源二聚體。以往的表達(dá)體系難以獲得可溶的或均質(zhì)蛋白，利用上述方法顯著提高Resistin 同型二聚體的產(chǎn)率。由此可見(jiàn)，這類巰基氧化酶似乎可以促進(jìn)多二硫鍵蛋白的高效表達(dá)。3.3.2 QSOX 體系在二硫鍵蛋白表達(dá)中的應(yīng)用另一類靜息巰基氧化

4、酶 （quiescin-sulfhydryloxidase, QSOX） 是目前已知的唯一具有多功能域的氧化酶。QSOX 包括兩個(gè)類似硫氧還蛋白的功能域、富含螺旋的間隔區(qū)以及 FAD 結(jié)合功能域。與其他單功能域巰基氧化酶 Ero1,Erv1 等類似，QSOX 可催化二硫鍵的從頭形成，且具有更強(qiáng)的氧化能力37.利用這一特點(diǎn)，2012 年 Abskharon 等38報(bào)道了一種新的大腸桿菌表達(dá)體系，他依靠人源重組靜息巰基氧化酶（HsQSOX），在細(xì)胞質(zhì)中成功獲得具有生物活性的朊蛋白。隨后研究人員針對(duì) QSOX 催化二硫鍵形成展開(kāi)了深入研究。2014 年 Zhang 等39將 QSOX 與PDI 在

5、Origami B 細(xì)胞質(zhì)中融合表達(dá)，構(gòu)建了一種超氧化性細(xì)胞（superoxidizing cells）。他們以一類新近報(bào)道的對(duì)氧化還原敏感的綠色熒光蛋白（redox-sensitive green fluorescent protein, roGFP） 監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)巰基-二硫鍵氧化還原電位，發(fā)現(xiàn)新型超氧化細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)氧化還原電位為-196 mV,比哺乳動(dòng)物或酵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（約為-230 mV）還高。因此，這種超氧化性細(xì)胞非常利于二硫鍵的形成，明顯提高富含二硫鍵蛋白 Gluc、vtPA 等的氧化折疊效率，為利用大腸桿菌異源表達(dá)真核生物多二硫鍵蛋白提供了新策略。4 展望蛋白的氧化折疊除了具有熱力學(xué)

6、、動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)之外，還涉及復(fù)雜的分子體系，所以它是一個(gè)難以解決的科學(xué)問(wèn)題。如果蛋白還存在二硫鍵、糖基化等修飾，其表達(dá)折疊將更加復(fù)雜和難以控制。雖然近年來(lái)，人們利用（trxB-, gor-）工程菌株、超氧化性細(xì)胞或者二硫鍵從頭形成體系，已成功地在大腸桿菌中表達(dá)多種二硫鍵蛋白。但是這些方法存在局限性，它們或許只適用于小范圍的蛋白。隨著生產(chǎn)、研究的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越需要更多新型、通用的二硫鍵蛋白表達(dá)菌株或體系，這將是一個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。但值得一提的是，2014 年 Georgescauld 等28發(fā)表的研究成果解析了分子伴侶輔助蛋白折疊組裝的作用機(jī)制，這為科學(xué)家們理解蛋白折疊的分子機(jī)制帶來(lái)了巨大幫助。

7、同時(shí)，這些理論成果也有助于優(yōu)化已有的方法策略，或?yàn)檠邪l(fā)高效的二硫鍵蛋白表達(dá)體系創(chuàng)造新的契機(jī)。參考文獻(xiàn)（References）：1 DEMAIN A L, VAISHNAV P. Production of recombinant pro-teins by microbes and higher organismsJ. Biotechnology Ad-vances, 2009,27（3）：297-306.2 WONG J W, HO S Y, HOGG P J. Disulfide bond acquisitionthrough eukaryotic protein evolutionJ. M

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