細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟

1、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAIE.細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟轉(zhuǎn)化(transformation )是指一段同源或異源的DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并得到表達(dá) 的水平基因的轉(zhuǎn)移過(guò)程，是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究和基因工程不可缺少的重要技 術(shù)。關(guān)鍵詞：細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 以pGLO質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌為例，學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)化的基本原理及方法。2. 驗(yàn)證DNA是遺傳物質(zhì)，加深對(duì)中心法則的理解。二. 實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化(transformation)是指一段同源或異源的DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并得到表達(dá) 的水平基因的轉(zhuǎn)移過(guò)程，是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究和基因匸程不可缺少的重要技 術(shù)。

2、口前常用的轉(zhuǎn)化方法有CaCl2法(化學(xué)轉(zhuǎn)化法)和電轉(zhuǎn)化法。本實(shí)驗(yàn)是用 PGLO細(xì)菌轉(zhuǎn)化試劑盒中提供的pGLO質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，所用方法為CaCI 2 轉(zhuǎn)化法。pGLO質(zhì)粒：pGLO質(zhì)粒上主要含有兩個(gè)基因，一個(gè)為編碼綠色熒光蛋口(GFP)的基因，一個(gè) 為抗生素氨茱青霉素抗性基因。此外，該質(zhì)粒還整合有一個(gè)特殊的參與受體細(xì) 胞中綠色熒光蛋白表達(dá)的基因調(diào)控體系，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的綠色熒光蛋口基因只有 在培養(yǎng)基中存在阿拉伯糖時(shí)才能啟動(dòng)表達(dá)。轉(zhuǎn)化子細(xì)胞將在不含阿拉伯糖的培 養(yǎng)基上呈白色而在含阿拉伯糖的培養(yǎng)基上顯綠色熒光，這種熒光在長(zhǎng)波紫外燈 下即可觀(guān)察到。aoGFP操縱子三. 實(shí)驗(yàn)材料受體菌：K12HB101

3、質(zhì)粒：pGLO plasmid轉(zhuǎn)化液（CaCl2 ）氨節(jié)青霉素（amp ）阿拉伯糖（ara ）培養(yǎng)基：固體LB、液體LB接種環(huán)、移液器等四. 實(shí)驗(yàn)步驟1 準(zhǔn)備平板：每組：1塊LB平板，2塊LB/amp平板，1塊LB/amp/ara平板2. 準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞：用250 nl無(wú)菌水或轉(zhuǎn)化液懸浮試劑盒中提供的大腸桿菌菌 粉，此即感受態(tài)細(xì)胞。3. 活化受體細(xì)胞：挑取1環(huán)K12 HB101菌液，于LB培養(yǎng)基上37 C活化16- 24h o 4轉(zhuǎn)化：ICA25D |d1）在兩只無(wú)菌離心管上分 別標(biāo)i己 +DNA, -DNA o2）在上述兩管中分別加入 250卩I轉(zhuǎn)化液。3）迅速置于冰上。4）各挑取活化好的受體菌 的一個(gè)單菌落，懸浮于兩管轉(zhuǎn)化 液中。5）在標(biāo)有+DNA的管中加 入一環(huán)質(zhì)粒DNA ,而標(biāo)有-DNA 的管中不加。6）將上述兩管于冰上放置lOmin a7）在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基底部 如左圖。IceWater bathlee42 X Ur8 ）兩只小管放入42 C水 浴中處理50秒，再迅速放 于冰上2 min o51氏A/Lw10 ）從+DNA小管中分別 吸取100 p I滴加在兩個(gè)標(biāo) 仃+DNA的平板上，從 DNA小管中分別吸取100卩 I滴加在兩個(gè)標(biāo)有-DNA的 平板上。11）用無(wú)菌接種環(huán)將滴加 的液體均勻涂布在平板上。9）在兩只小管中分別加入 250 p I LB-