綠色熒光蛋白基因的克隆和表達(新手詳細注釋版)資料

1、綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆和表達背景知識綠色熒光蛋白(green fluoresce nt protein , GFP)是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔 腸動物體內的生物發(fā)光蛋白。當受到紫外或藍光激發(fā)時，GFP發(fā)射綠色熒光。它產生熒光無需底物或輔因子。發(fā)色團是其蛋白質一級序列固有的。GFP由3個外顯子組成，長2.6kb ; GFP是由238個氨基酸所組成的單體蛋白，相對分子質量為 27. 0kMr，其蛋白性質十分穩(wěn)定，能耐受 60C處理。1996年GFP的晶體結構被解出，蛋白質中央是一個圓柱形水桶樣結構，長420 nm ,寬240 nm,由11個圍繞中心a螺旋的反平行B折疊組成，熒光

2、基團的形成就是從這個螺旋開 始的，桶的頂部由3個短的垂直片段覆蓋，底部由一個短的垂直片段覆蓋，對熒光活性很重要 的生色團則位于大空腔內。發(fā)色團是由其蛋白質內部第65-67位的Ser-Tyr-Gly 自身環(huán)化和氧化形成.實驗一質粒DNA的分離與純化一、實驗目的掌握一種最常用的質粒 DNA提取方法：堿裂解法。該法用于 從小量培養(yǎng)物中抽提質粒 DNA ,比較方便、省時，提取的質粒DNA 質量較高，可用于 DNA的酶切、PCR甚至測序。二、基本原理質粒是一類在細菌細胞內發(fā)現的獨立于染色體外，能夠自主復制的穩(wěn)定的遺傳單位。迄今 為止，從細菌中分離得到的質粒都是環(huán)型雙鏈DNA分子，分子量范圍從 1kb到2

3、00kb。質粒DNA可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下又會可逆地整合到寄主染色體 上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。在大多數情況下質粒DNA復制10-200個拷貝。當宿主細胞的蛋白中的酶體系和細菌染色體復制時所用的酶是相同的。有些質粒復制受宿主細胞復制作用的嚴格 限制，因此每個細胞中只含一個或幾個拷貝，稱為嚴謹型質粒，有的質粒的復制受宿主細胞的 控制不嚴，稱為松弛型質粒，它們在每個細胞中的數目可達質合成受到抑制時（例如經氯霉素處理），細菌染色體雖不再增加，但松弛型質粒 DNA可繼續(xù)被復制，以至每個細胞內的拷貝數可以增至一千到幾千。質粒具有一定的生物功能，它們

4、往往帶有一些抗藥標記，當質粒DNA用人為的方法轉化進細菌時，轉化后的細菌會表現出質?；蛩哂械男碌纳锉憩F型，例如，把一個含有抗藥 基因的質粒轉入細菌后，原來無抗藥性的細菌則表現出抗藥的新表型。借助轉化菌獲得的新表 型特征，可證實質粒已轉入宿主細菌中，這樣就可以作為轉化菌的選擇性標記。質粒作為基因克隆載體分子的重要的條件是獲得批量的純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質粒 DNA的提取，它們都包括三個基本的步驟：細菌的生長和質粒的擴增； 菌體的收集裂解，質粒 DNA的分離；質粒 DNA的純化。1、細菌的生長和質粒的擴增從瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取一個單菌落，接種到含適當抗生素的液體培養(yǎng)基中

5、培養(yǎng)。對于松弛型質粒（如pUC系列）來說，只要將培養(yǎng)物放到標準的 LB或2YT培養(yǎng)基中生長到對數晚期， 就可以大量提取質粒，而不必選擇性地擴增質粒DNA。但對于嚴謹型質粒（如 pBR322）來說，則需在得到部分生長的細菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時，以便對質粒進行選擇性擴 增。2、 菌體的收集、裂解和質粒DNA的分離質粒分離的基本原理是利用宿主菌（一般是大腸桿菌菌株）DNA與質粒DNA之間的兩種主要性質差異：（1 ）大腸桿菌的染色體較一般的載體質粒DNA大得多。（2）從細胞中提取得到的大腸桿菌 DNA主體是變性的線性分子，而大多數質粒 DNA是共價閉合的環(huán)狀分子。這里 主要介紹堿裂解法的

6、基本原理：在細菌懸浮液中加入SDS （十二烷基硫酸鈉）和 NaOH使菌體裂解（有時需要先使用溶菌酶水解細胞壁）。此處理可破壞堿基配對，故可使細菌的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。當條件恢復正常時（如加入酸性的NaAc或Kac中和堿性NaOH），質粒DNA鏈迅速得到準確配對，重新恢復成天然 的超螺旋分子。通過離心，可以使染色體DNA與變性蛋白質、RNA分子一起沉淀下來，而質粒超螺旋分子仍滯留于上清中。3、質粒 DNA的提純對于小量制備的質粒 DNA，經過苯酚抽提、 蛋白質及RNA，達到純化的目的。質粒DNA分子具有三種構型：共價閉合環(huán)形 構型）和線性分

7、子（L構型）。在細菌體內，質粒RNA酶消化和酒精沉淀等簡單步驟除去殘余DNA （ cccDNA，SC 構型）、開環(huán) DNA （ OCDNA是以負超螺旋構型存在的。在瓊脂糖凝膠電泳中不同構型的同一種質粒DNA，盡管分子量相同，但具有不同的電泳遷移率。其中走在最前沿的是 SC DNA，其后依次是 L DNA和OC DNA。三、實驗材料、儀器及試劑1. 在含有pEGFP N3質粒的DH5a平板上菌落上挑取菌種，置于含有5mL LB培養(yǎng)基的試管中。搖晃過夜。（DH5z是一種大腸桿菌的誘變菌株，主要表現對外源DNA勺免疫缺乏，是用于基因工程的菌種）在含有pET-28a質粒的平板上挑取單菌落于另外一個試管

8、中，同樣搖蕩培養(yǎng)過夜。2、使用儀器恒溫培養(yǎng)箱，超凈臺，恒溫搖床，制冰機，臺式離心機，小型混合器，冰箱四、實驗步驟1.取1.5ml DH5 培養(yǎng)液倒入1.5mL eppendof 管（一種離心管） 中，13000rpm離心1min。2. 重復1。3. 棄上清 ,將管倒置于衛(wèi)生紙上數分鐘 ,使液體流盡。4. 菌體沉淀重懸浮于100卩溶液I中（需劇烈振蕩）,室溫下放置10min。（溶液 I , 50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-CI / 10 mM EDTA ，pH 8.0 ;溶液 I 的作用；mM為 mmol/L。 任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH,因此用適當濃度的和適當 pHf

9、直的Tris-Cl溶液。50m葡萄糖最大的好處是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。EDTA1 Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase勺活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達10 mM的EDTA無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子 都螯合掉。菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。）5. 加入新配制的溶液n 200I,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendof管5次,以混勻內容物（千萬不 要振蕩 ）,冰浴 5min。（溶液II , 0.2 M NaOH / 1% SDS ;溶液II的作用；這是用新鮮的 0.4 N的NaOl和2%的SDS

10、等體 積混合后使用的。 要新從濃NaO稀釋制備0.4N的NaOH保證NaO沒有吸收空氣中的CO2而減弱堿 性。其實破細胞的主要是堿，而不是SDS所以才叫堿法抽提。事實上 NaOl是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜 發(fā)生了從 bilayer （雙層膜）結構向 micelle （微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的 0.4 N NaOH即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得 到質粒。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為堿性條件下基因組 DNAt斷會慢慢斷裂； 第二，必須溫柔混合，不然

11、基因組DNAL會斷裂。）6. 加入150 1預冷的溶液川，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩3次,使沉淀混勻，冰浴中15分鐘,13000rpm 離心 5min。（溶液III , 3 M醋酸鉀/ 2 M 醋酸。溶液川含3M醋酸鉀/ 2M 醋酸。溶液III加入后就會有 大量的沉淀，這其實是 SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（ PDS，而PDS是水不溶的，因 此發(fā)生了沉淀。而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。SDS易與蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀。大腸桿菌的基因 組DNA也會一起被共沉淀，因為基因組DNAt長，容易被PD洪沉淀，注

12、意SDS并不與DNA分子結合。2M的醋酸是為了中和 NaOH因為長時間的堿性條件會打斷 DNA所以要中和之?；蚪M DNAr旦發(fā)生斷裂，只要是50 100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要 短，而且不得激烈振蕩， 不然最后得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入后基因組DNAt法快速復性就被沉淀 了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產物，與它是不是沉淀下來其實沒有關系。溶液III加入并

13、混合均勻后在冰上放置，目的是為了PD飢淀更充分一點。）7. 上清液移入干凈eppendof管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24: 1）,振蕩混勻，13000rpm離心2min 。（PDS沉淀的形成后有些蛋白質不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然后進行酒精沉淀才能得到質量穩(wěn)定的質粒DNA不然時間一長就會因為混入的DNase而發(fā)生降解。這里用25:24： 1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的。酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大于氯仿，但是 水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得

14、酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水 相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），而用酚 /氯仿的混合液進行抽提，跑到 水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進 行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的 回收。）8. 將水相移入干凈eppendof管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24 : 1）振蕩混勻，13000rpm離心2min 。9. 將水相移入干凈 eppendorf 管中 ，加入2 倍體積的無水乙醇 ，振蕩混勻后，置于室溫下 2

15、min， 然后 13000rpm 離心 5min。（回收后的水相含有足夠多的鹽， 因此只要加入 2倍體積的乙醇， 在室溫放置幾分鐘后離心就可 以將質粒DNA沉淀出來。）10. 棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1mL 70 %乙醇洗沉淀一次，振蕩混勻后，13000rpm離心 5min。（高濃度的鹽會水合大量的水分子， 因此DN分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70%的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上， 并用移液槍槍頭（tip ） 將沉淀打碎，就能得到好的樣品。）11. 吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫干燥。12. 將沉淀溶于3

16、0卩L TE緩沖液（pH8.0,含20卩g/mL RNaseA中，保存在-20C冰箱中。（溶解已經講解的RNA防止未降解的RNA會干擾電泳結果。）13. 按照同樣的流程和方法將pET-28a的質粒也提出來，保存在 -20 C冰箱中。五、實驗結果實驗二質粒DNA濃度的測定、實驗目的學習利用核酸蛋白測定儀測算核酸的濃度和純度。:、基本原理核酸分子在260nm下有最大吸光值，因此可以通過 260nm下核酸的吸光值計算核酸濃度（mg/ml）,并通過測定與 280nm和230nm的比值，估算 DNA的純度。（除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A 260 / A 280的

17、比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280 nm.純凈的樣品，比值大于1.8 （ DNA或者2.0 （ RNA。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A 230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物 ,多肽,苯酚等，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比 值大于2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A 320 一般是0。）三、實驗材料與儀器1實驗材料pEGFP- N3和 pET-28a DNA2.使用儀器Eppendof核酸蛋白測定儀，移液槍四、實驗步驟1. 按下Eppendof核酸蛋白測定儀 dsDNA|，比色皿中加入 100卩I

18、 ddHzO, blank|空白對照。2. 取一 0.5ml離心管，吸取質粒 DNA 5卩l(xiāng)，然后再加入95卩l(xiāng) ddHzO，混勻。3. 將100卩l(xiāng)的溶液轉移到比色皿中，注意不要出現氣泡。4. 按下 sample，記錄 260nm 下 DNA 的濃度（mg/ml）。并同時記錄OD260nm/280nm,OD260nm/230nm的比值，估測 DNA的純度。5. 計算質粒DNA母液的濃度=OD260nm下的濃度x 20 （mg/ml）,DNA的純度：OD260nm/280nm=1.8 0.1（如果低于1.7，說明樣品中蛋白質去除的不完全，或樣品中有苯酚的污染；如果高于1.9，說明樣品中RNA去

19、除的不完全。）正常OD260nm/230nm 約為2.5, OD260nm/230nm小于2.0，表示樣品中存在一些污染物， 如碳水化合物，多肽,苯酚等鹽和小分子。實驗三瓊脂糖凝膠電泳一、實驗目的學習掌握一種最常用的分離、鑒定、純化DNA片段的比較方便、省時的技術：瓊脂糖凝膠電泳的基本原理和操作方法。二、基本原理影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素主要有：(1) DNA分子的大小 雙鏈DNA分子在凝膠基質中遷移的速率與其堿基對數的常用對數成反比。分子越大，遷移的越慢，因為摩擦阻 力越大，也因為大分子通過凝膠孔徑的效率低于較小的分子。(2)瓊脂糖濃度 給定大小的線狀DNA片段在不同濃度的瓊脂糖

20、凝膠中遷移速率不同。在DNA電泳遷移速率的對數和凝膠濃度之間存在線性相關。(3) DNA的構象 超螺旋環(huán)狀(I型)、切口環(huán)狀(H型)和線狀(川型) DNA在瓊脂糖凝膠中以不同速率遷移。其相對遷移速率主要取決于瓊脂糖凝膠的濃度和類型， 其次是電流強度、緩沖液離子強度和I型超螺旋絞緊的程度或密度。一些條件下，1型DNA比川型遷移得快；在另一些條件下，順序可能相反。(4)所用的電壓低電壓時，DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。電場強度升高時，高分子量片段的遷移率遂不成比例的增加。所以， 當電壓增大時瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用電壓不應高于 5-8V

21、/cm。(5)電泳緩沖液 DNA的泳動受電泳緩沖液的組成和離子強度的影 響。缺乏離子則電導率降低，DNA或者不動或者遷移很慢。高離子強度時(如10X buffer ),電導率升高，使得應用適中的電壓也會產生大量的熱能，最嚴重時凝膠會熔化，DNA變性。三、實驗材料、儀器及試劑1實驗材料質粒DNA2、使用儀器核酸電泳儀，小型混合器，冰箱，藍盾可見光透射儀四、實驗步驟1 1%瓊脂糖凝膠的配制(1) 加20ml 1 X TBE緩沖液于三角瓶中。(TBE緩沖液為Tris硼酸-EDTA緩沖溶液，適合長時間電泳，但測得分子質量大于實際分 子質量，;TAE緩沖液為Tris醋酸-EDTA緩沖溶液，運用最廣泛，較

22、準確但不適合長時間； TPE緩沖液為Tris磷酸-EDTA緩沖溶液，磷酸鹽易在乙醇沉淀過程中析出，不適合DNA回收。)(2) 精確稱取0.2g瓊脂糖加到三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化，(3) 冷卻至60 C左右，(4) 輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上，(5) 將膠板除去封膠帶，放入電泳緩沖液(TBE )中，使電泳緩沖液剛好沒過凝膠約1mm, 輕輕拔除梳子，(6) 取5卩I質粒DNA及2卩I Genefinder混勻上樣。(也可使用 GelRed熒光核酸凝膠染色 試劑，用凝膠成像儀顯影)(7) 50-100v 約電泳 0.5-1 小時。(8) 藍盾可見光透射儀觀

23、察結果。五、實驗結果實驗四酶切及連接1. 實驗目的2. 實驗原理迄今已發(fā)現了 3000多種限制性內切酶。傳統(tǒng)上將限制性內切酶按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素劃分為三大類。II型酶在其識別位點之中或臨近的確定位點特異地切開DNA鏈。它們產生確定的限制片段，因此是三類限制性內切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類。II型限制性內切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III 、BamHI和Not I這樣在識別序列中進行切割的酶。這一類酶是構成商業(yè)化酶的主要部分。大部分這類酶都以同二聚體的形式結合到DNA上，因而識別的是對稱序列；但有極少的酶作為單聚體結合到DNA上，識別非對稱序列。

24、一些酶識別連續(xù)的序列（如EcoR I識別GAATTC Hind III 識別AAGCTT;BamH識別GJ GATCC;Not I識別GC! GGCCGC;而另一些識別不連續(xù)的序列（如 Bgl I識別GCCNNNNNGGC限制性內切酶酶切 DNA后形成兩種類型的末端：（i）兩條鏈斷裂的位置是交錯地，產生粘性末端，如EcoR I酶切后產生5 -G! AATTC-33 -CTTAAJ G-5末端；（ii）兩條鏈的斷裂位置處在一個對稱結構的中心，產生平末端，如HaeHI酶切后產生5 -GGJ CC-33 -CC! GG-5。DNA連接酶能夠催化在兩條 DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，這種酶需要在一條DN

25、A鏈的3-P）。3. 實驗材料、儀器及試劑3.1實驗材料pEGFP N3 禾口 pET-28a DNA3.2儀器準備水浴鍋、移液器、電泳槽、電泳儀、振蕩器、制冰機、藍盾可見光透射儀、凝膠成像儀3.3試劑BamH l（10U/ 卩 L） （TaKaRa 公司）;Not I （10U/ 卩 L） （TaKaRa 公司）,T4 ligase4. 操作步驟4.1酶切按如下雙酶切體系（30卩L）混合：反應物（卩L）pEGFP-N3pET-28a質粒1818BamH I22Not I2210X buffer K330.1%BSA緩沖液33（BSA緩沖液為牛血清白蛋白，穩(wěn)定酶的活性。）1. 離心10s,混勻

26、。2. 37 C水浴酶切 3-4h。3. 配制1.0% （ M/V普通瓊脂糖凝膠 30ml。（1% （m/v）指：一般是固體溶于液體的，1g固體溶于100mL水中。）4. 適當放置冷卻，45 C左右倒于電泳膠板上，插好梳子。5. 待凝膠凝固好以后，撥下梳子。6. 酶切樣品中加入5訕溴酚藍-GeneFinder混合液混勻，上樣。7. 1X TBE Buffer , 80V（3-4V/cm）下電泳 30min。8. 熒光激發(fā)器觀察質粒 DNA條帶的酶切情況，并照像。4.2回收酶切產物（采用天為時代 DNA回收試劑盒進行回收）1）配30mL 1 %進口瓊脂糖凝膠，盡量長一些（用粗梳子），對酶切產物進

27、行電泳分離;2）將酶切產物全部加入加樣孔中3）跑膠，觀察結果，并且拍照。4）用干凈的刀片將需要的 DNA條帶從凝膠上切下來，稱取重量。5）以0.1g凝膠對應300卩L的體積加入PN （溶膠液）。6）50C水浴放置10min，期間不斷溫和上下翻動離心管至膠完全融解。13000rpm離心 60s ,7）將上一步得到的溶液加入到一個吸附柱中，吸附柱再放入收集管,棄掉廢液。ABCDEF 1樣本 裂解過柱結合洗滌 洗脫純化的核酸（吸附柱，用于吸附層析）8） 加入800卩L漂洗液PVy 13000rpm離心60s，棄掉廢液。（PV是去鹽的洗脫液，目的是洗脫脂類、蛋白及鹽類等雜質）9）加入500卩L漂洗液P

28、Vy 13000rpm離心60s，棄掉廢液。10）將離心吸附柱放回收集管，13000rpm離心2min。11）取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間位置加入適量洗脫緩沖液EB30卩L,洗脫緩沖液先在65C水浴預熱，室溫放置 2min , 13000rpm離心1min，然后將離 心的溶液重新加回離心吸附柱中，13000rp m離心1mi n。12）置于20 C保存。4.3連接按照連接體系進行，16 C連接過夜。反應物體積/卩L回收純化的pET-28a質粒5gfp基因片段12T4連接酶1緩沖液（10X）2實驗五大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化一、實驗目的了解和掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備

29、方法的原理和操作要點，以及質粒DNA轉化大腸桿菌細胞的原理和方法。二、基本原理外源DNA只有轉化到大腸桿菌細胞內才能得到擴增。感受態(tài)指細菌細胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。大腸桿菌的感受態(tài)可用 CaCS處理而誘導產生：將正在生長的 大腸桿菌細胞在 0C下加入到低滲的 CaCl2溶液中，便會使細胞膜的透性發(fā)生改變，此時的細胞即呈現為感受態(tài)。這一方法可以用于批量制備感受態(tài)細胞，其轉化效率可達到5X 106-2 x 107個轉化克隆子/卩g超螺旋質粒DNA。制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞可在-70 C凍存。在0C下外源DNA可吸附到感受態(tài)細胞表面，短時間的熱刺激（42C, 90s）誘導細胞

30、吸收DNA。 （Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核 酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導細胞成為感受態(tài)細胞。將該體系熱激，細胞膜的液晶結構 會發(fā)生劇烈擾動，并隨機出現許多間隙，外源DNA就可能被細胞吸收。進入細胞的外源DNA分子通過復制、表達，實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。）轉化了質粒DNA勺大腸桿菌隨后在培養(yǎng)基中 37C培養(yǎng)1hr，可使質粒DNA中編碼抗生素抗性的基因得以表達，因此，轉化了質粒DNA勺大腸桿菌細胞可在含有相應抗生素的培養(yǎng)基上生長，而沒有轉化的細胞則無法生長。三、實驗材料、儀器1.實驗材料DH5a BL21, pET-28

31、a重組質粒 DNA2. 使用儀器水浴鍋，高壓滅菌鍋、移液器、超凈工作臺、離心機、振蕩培養(yǎng)箱，制冰機四、操作步驟1. LB (Luria-Bertain )液體和固體培養(yǎng)基的配制(參考附錄)氨芐青霉素和卡那霉素等抗生素不抗熱，如果培養(yǎng)基溫度過高，容易導致抗生素失效，應使培養(yǎng)基降溫至60C左右后，再加入抗生素。但也不應使培養(yǎng)基的溫度過低，否則容易出現氣泡。 75mm 直徑的培養(yǎng)皿約需 15ml 培 養(yǎng)基。2感受態(tài)細胞的制備 (CaCl 2法)(1) 挑一大腸桿菌單菌落放入 3ml LB液體培養(yǎng)基(含Kan+), 37C培養(yǎng)過夜。(2) 活化大腸桿菌：取3ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基加入50-150卩I

32、的過夜菌，培養(yǎng)2-3個小時。(3) 將昨夜搖出來的DH5z或BL21培養(yǎng)液轉入離心管中，冰上放置10min,然后于4 C下4000rpm離心 5min。(4) 棄去上清，用預冷的O.1mol/L 的CaCL溶液600卩L輕輕懸浮細胞，冰上放置20min, 4 C下4000rpm離心 5min。(5) 棄去上清，加入300卩L預冷的0.1mol/L的CaCS溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置5min,即 成感受態(tài)細胞懸液，可-80 C長期保存。3. 轉化涂板(1 )取2個無菌離心管，分別加入 100卩L DH5 a感受態(tài)細胞懸液，第1管加5卩l(xiāng)無菌水，第2管加入質粒DNA溶液5卩l(xiāng),輕輕搖勻，冰上放置

33、30min。(2) 42C水浴中熱激90s,熱激后迅速置于冰上冷卻 5min。(3) 分別向管中加入100卩L LB液體培養(yǎng)基，混勻后在37C振蕩培養(yǎng)30min。(4) 從管1中取50卩L涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上，從管2中取50卩L和100卩L涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置約10分鐘，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37 C培養(yǎng)20小時。（50卩L和100卩L構成濃度梯度，便于后續(xù)篩選菌落密度合適的平板）管2管250 卩 L100 卩 L實驗六重組質粒DNA的鑒定（雙酶切法和菌落 PCR法）一、實驗目的掌握雙酶切法鑒定重組質粒DNA的基本原理和操作步驟，以及菌落PCR法鑒定

34、重組質粒DNA的基本原理。了解菌落 PCR法鑒定菌落及保存的操作方法。二、基本原理重組質粒DNA是利用限制性內切酶（如 BamH I和Not I）分別酶切基因片段和質粒后，利用基因片段和質粒 DNA 一端帶有相同的粘性末端連接起來的重組質粒，如果再利用相同的限制性內切酶識別重組基因片段兩側的酶切位點，通過酶切下的重組片段的大小與連接的基因 片段大小是否相同判斷質粒 DNA是否為重組質粒。單菌落或提取的質粒DNA也可以通過 PCR方法鑒定正確克隆。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）是體外酶促合成特異 DNA片段的一種方法。典型的PCR由高溫變性、低溫

35、退火和適溫延伸等三步反應組成一個循環(huán)周期，通過多次循環(huán)反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的DNA置于高溫下使之解鏈，人工合成的兩個寡核苷酸引物在低溫下分別在目的片段兩側與DNA兩條鏈互補結合；DNA聚合酶在72 C將單核苷酸從引物的 3端開始摻入，沿模板從 5宀3方向延伸，合成 DNA的新互補鏈。具體地說，PCR反應系統(tǒng)有寡核苷酸引物，反應緩沖液，熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶），脫氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分組成，缺一不可。DNA片PCR技術能在試管中建立反應，經數小時之后，就能將極微量的某一特定的目的段擴增106倍以上，而無需經過煩瑣的基因克隆程序便可獲得足

36、夠數量的精確的DNA拷貝。它操作簡單，易于掌握，結果也較為可靠，為基因的分析和研究提供了一種強有力的手段，對整個生命科學的研究與發(fā)展都有深遠的影響。因此，PCR技術產生的時間雖不長，卻以驚人的速度廣泛地應用于分子生物學的各個領域。它可用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析、突變體和重組體的構建、基因表達調控的研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機制的探索及法醫(yī)鑒定等諸多方面。三、實驗材料、儀器及試劑1. 實驗材料pET-28a重組質粒DNA或菌落2. 使用儀器PCR儀，掌中寶離心機，冰箱，小型混合器，電泳槽和電泳儀，1.5ml離心管，移液器及吸頭，藍盾可見光透射儀，恒溫培養(yǎng)箱3.

37、試劑BamH l（10U/ 卩 L） （TaKaRa 公司）;Not I （10U/ 卩 L） （TaKaRa 公司）四、實驗步驟1.雙酶切法（1）隨機挑取2個單菌落，接種，37C振蕩培養(yǎng)過夜。（2） 質粒DNA勺提取（堿裂解法）。（3）雙酶切鑒定體系（10卩I）。反應物（卩l(xiāng)）管1管2質粒DNA22BamH I0.50.5Xho I0.50.510X buffer KddHO/ 卩 l(4) 室溫酶切2.5- 3h。(5) 配制1.0% ( M/V普通瓊脂糖凝膠20ml。(6) 酶切樣品中加入5山溴酚藍-GeneFinder混合液混勻，上樣。(7) 1X TBE Buffer , 80V(3

38、-4V/cm)下電泳 30min。(8) 熒光激發(fā)器觀察質粒 DNA條帶的酶切情況，并照像。并確定最終的陽性克隆2.菌落PCR法(1) 挑取菌落隨機挑取5個菌落。首先使用無菌槍頭挑取菌落，在已準備好的含有卡那抗菌素， 分好區(qū)的固體培養(yǎng)基中輕劃一下(為保菌種)，然后將余下菌置于eppendorf管中(作為PC阪應模板)。(2) PC阪應體系(20卩l(xiāng) )反應物體積/dNTP (10mM2左引物0.5右引物0.5丁玄口酶(5U/卩L)0.5MgCb(25mM)1.210X Buffer2ddHaO13.3(3) PCRf 環(huán):95 C 5min予變性（95 C 60s ; 58 C 60s ; 7

39、2 C 90s ） 30cycles72 C 10min 延伸（4）PCR產物的檢測PCR產物加入5卩l(xiāng)溴酚藍-GeneFinder混合液，分別按編號加入DNA瓊脂糖凝膠電泳的加樣孔，使用1%瓊脂糖電泳分離。（5）用熒光激發(fā)器看結果，確定陽性克隆的位置。五、實驗結果實驗七GFP蛋白的誘導表達一、實驗目的掌握用IPTG誘導GFP基因表達的基本原理及基本操作步驟。二、實驗原理IPTG （異丙基硫代3 -L半乳糖苷）是一種常見的誘導基因表達的誘導劑，結構類似乳糖。GF基因連接到pET-28a的多克隆位點（MCS , GFf基因的表達受其上游 T7啟動子和操縱基 因0位點以及結合到這些順式作用元件的蛋

40、白因子的控制。LacI基因編碼調節(jié)蛋白， 可以四聚體 的形式結合到操縱基因 O位點上，關閉GFI基因的表達。IPTG可與四聚體調節(jié)蛋白結合，從而改變調節(jié)蛋白的構象，使調節(jié)蛋白不再與O位點結合。接著BL21編碼的T7 RN驟合酶結合到T7啟動子位點，從而啟動 GF基因的表達。三、實驗材料和儀器1. 實驗材料BL21, pET-28a重組質粒 DNA2. 使用儀器 離心機，冰箱，小型混合器，移液器，恒溫培養(yǎng)箱，手持式紫外燈，超凈工作臺。四、實驗步驟1. 取陽性克隆質粒DNA?；疊L21;2. 在含有Kan*的固體培養(yǎng)基上，37 C培養(yǎng)20h;3. 挑取單菌落，37 C振蕩培養(yǎng)過夜；4. 取4支無菌

41、帶蓋試管，加入新鮮 LB夜體培養(yǎng)基(含有Kan*) 5ml，按1： 20稀釋比例加入 過夜菌，37 C培養(yǎng)至生長期，約2-3小時。5. 加入 IPTG (1 : 1000)至終濃度 1mmol/L，分別誘導 0h, 1h, 2h, 4h。6. 分別取1.5ml , 10000rpm離心5min,去除上清，收集沉淀，再重復一次收集沉淀。7. 分別取IPTG誘導培養(yǎng)液20卩l(xiāng)涂布在含Kan*的固體培養(yǎng)基上，37C培養(yǎng)20小時。8. 觀察蛋白表達用紫外線照射菌體沉淀及培養(yǎng)平板, 可以看到綠色熒光。 分別對均勻涂布的平板以及表 達蛋白的樣品管照相,保存照片。附錄:1. LB培養(yǎng)基的配制：組成液體固體蛋

42、白胨（Trypton）10g10g酵母提取物（Yeast Extract）5g5gNaCI10g10g瓊脂（Agar）15g蒸餾水定容至1000ml定容至1000ml2. 溶液I:50mM葡萄糖25mM Tris-HCl （ pH8.0 ）10mM EDTA3. 溶液n （現用現配）：0.2N NaOH1% SDS（先加水，再加 NaOH和SDS）4. 溶液川（100ml）: 5M KAc 60ml冰醋酸 11.5ml5. DNase-free RNase A :溶解 RNase A 于 TE 緩沖液中，濃度為 10mg/ml,煮沸 10-30min , 除去DNase活性，-20 C貯存。6. TE 緩沖液（pH8.0 ） 10mM Tris-HCl ; 1mM EDTA的配制：藥品名稱1M Tris-HCl（pH8.0）10ml1ml0.5M EDTA2ml0.2mlddfO定容至1000ml定容至100ml7. 20 X TBE : 216g Tris 堿，110g 硼酸，80ml 0.5M EDTA （ pH8.0），定容至 1000ml。8.