洋蔥伯克霍爾德菌T1828質(zhì)粒消除方法及條件

1、微生物學(xué)通報(bào)microbiology chinatongbaojun 20, 2011, 38(6): 847852 2011 by institute of microbiology, cas洋蔥伯克霍爾德菌t1828 質(zhì)粒消除方法及條件鐘義軍 1,2,3吳曉玉 1,3*劉好桔 1,3武琳 2饒志強(qiáng) 1,3王園秀 1,3(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院江西 南昌330045)(2. 江西省紅壤研究所江西 南昌331717)(3. 南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西 南昌330045)摘 要: 采用十二烷基硫酸鈉和提高生長(zhǎng)溫度結(jié)合法、紫外線涂布平板法、凍融法、吖啶橙法和黃芩甙提取液消除法等

2、方法消除洋蔥伯克霍爾德菌 t1828 菌株質(zhì)粒, 探討適合洋蔥伯克霍爾德菌 質(zhì)粒消除的方法, 并研究最佳質(zhì)粒消除條件。結(jié)果表明十二烷基硫酸鈉和提高生長(zhǎng)溫度結(jié)合法 最適合于洋蔥伯克霍爾德菌 t1828 質(zhì)粒消除, 同時(shí)最佳消除條件為: 在 t1828 培養(yǎng) 16 h 后加入 sds 使其終濃度 0.1%, 36 c 處理 18 h, 消除率達(dá)到 49%。篩選到的無(wú)質(zhì)粒突變株可以用于進(jìn)一步 的研究。關(guān)鍵詞: 洋蔥伯克霍爾德菌 t1828, 質(zhì)粒消除, 質(zhì)粒提取, 消除條件plasmid elimination method and conditionsof burkholderia cepacia

3、 t1828zhong yi-jun1,2,3wu xiao-yu1,3*liu hao-ju1,3wang yuan-xiu1,3wu-lin2rao zhi-qiang1,3(1. college of bioscience and engineering, jiangxi agricultural university, nanchang, jiangxi 330045, china)(2. red soil institute of jiangxi province, nanchang, jiangxi 331717, china)(3. nanchang key laboratory

4、 of fermentation application and technology, nanchang, jiangxi 330045, china)abstract: to explore the suitable for burkholderia cepacia plasmid elimination method and study the op-timal conditions for plasmid elimination, we eliminated plasmid of burkholderia cepacia t1828 by using sodium dodecyl su

5、lfate and improving the growth temperature combination method, uv-coated plate method, freeze-thaw method, acridine orange method and baicalin extraction methods such as elimination methods. the results showed that sodium dodecyl sulfate and improving the growth temperature combina-tion method is be

6、st suited to burkholderia cepacia t1828 plasmid elimination, while the best conditions基金項(xiàng)目：江西 省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(no. 2008gjn0016); 江西省教育廳科技項(xiàng)目(no. gjj09171); 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)?；痦?xiàng)目(no. 2548)* 通訊作者： : wuxiaoyu58收稿日期：2010-10-15; 接受日期：2011-02-23for the elimination are t1828 culture after 16 h by adding sds to 0.1% of the f

7、inal solubility dealt with18 h at 36 c, the elimination rate reach 49%. the plasmid-free mutant strains can be used for further study.keywords: burkholderia cepacia t1828, plasmid elimination, plasmid extraction, eliminate conditions冠菌素(也稱冠毒素, coronatine, 簡(jiǎn)稱 cor)是微生物產(chǎn)生的高活性次生代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn), cor類似茉莉酸甲酯(met

8、hyl jasmonaste, 簡(jiǎn)稱 meja)誘 導(dǎo)水稻穎花快速開(kāi)放12, 且 cor 的作用效果高于黃 芩 甙 消除法 等方 法處理 菌株 t1828, 獲 得菌株 t1828 質(zhì)粒消除的適宜方法與條件, 為探討菌株產(chǎn) 冠菌素性能與質(zhì)粒之間關(guān)系提供材料。1 材料與方法1.1 供試材料1.1.1 菌株: 洋蔥伯克霍爾德菌 t1828 由南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離獲得。1.1.2 培養(yǎng)基: (1) lb 培養(yǎng)基(g/l): 胰蛋白胨 10,酵母提取物 5, 氯化鈉 5, 3 mol/l naoh 調(diào)節(jié) ph 至7.0, 1105 pa 滅菌 20 min。(2) 固體 lb 培養(yǎng)基 :

9、液體培養(yǎng)基中加 20%的 瓊脂。 (3) 無(wú)質(zhì)粒菌株篩選培養(yǎng)基: 固體 lb 培養(yǎng)基中加入終濃度為 100 mg/l 的氨芐青霉素。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1十二烷基硫酸鈉(sds)和逐步提高生長(zhǎng)溫度 結(jié)合法13: (1) 將 t1828 接種于 30 ml lb 肉湯培養(yǎng)液, 30 c、180 r/min 振蕩培養(yǎng) 1618 h; (2) 取 300 l接種于 0.1% sds 的 lb 肉湯培養(yǎng)基中, 30 c 振蕩 培養(yǎng) 20 h; (3) 取 300 l 接種于 30 ml 不含 sds 的 lb 肉湯內(nèi), 39 c 振蕩培養(yǎng) 20 h; (4) 重復(fù)(2)、(3) 步 2 次; (5

10、) 取 300 l 接種于 30 ml 不含 sds 的 lb肉湯培養(yǎng)基中, 30 c 振蕩培養(yǎng) 1618 h; (6) 以堿裂解法快速提取質(zhì)粒 dna, 電泳檢測(cè)。后者3,cor 還可引起植物莖塊的肥厚癥, 誘導(dǎo)植物過(guò)度生長(zhǎng)、抑制根的伸長(zhǎng)及刺激乙烯的生成46,在農(nóng)業(yè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離篩 選得到一株產(chǎn)冠菌素的菌株 bcc933, 并以此為出發(fā)菌株 , 經(jīng)選育篩選出高產(chǎn)冠菌素菌 株 y5.7 和t1828, 經(jīng)鑒 定為洋蔥伯 克霍爾德 菌 burkholderia cepacia, 該菌 屬產(chǎn)冠 菌素 的性能 為國(guó) 內(nèi)外首 次報(bào) 道 7 8。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的

11、產(chǎn)冠菌素的菌株大部分屬于 假 單 胞 菌 屬 , 包 括丁香 假單胞大 豆褐斑病 菌pseudomonas syringae pv. glycinea、丁香假單胞李潰 瘍病菌 p. syringae pv. morsprunorum、丁香假單胞麥 葉褐斑病菌 p. syringae pv. atropurpurea 和丁香假 單胞番茄葉斑 病菌 p. syringae pv. tomato, 除丁香假單胞斑點(diǎn)病 菌 p. syringae pv. maculicola 外 , 其 他假單胞菌冠菌素合成基因均位于質(zhì)粒上 , 其基 因大小約為 90 kb9。質(zhì)粒是染色體外具有獨(dú)立復(fù)制能力的、對(duì)細(xì)菌

12、生存非必需的小型共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈 dna 分子,細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)普遍存在10。細(xì)菌的某些表型特征,在包括抗性、代謝能力、致病性、共生現(xiàn)象、結(jié)合轉(zhuǎn)移紫外線涂布平板照射法10: (1) 將試驗(yàn)菌株等往往由質(zhì)?？刂?。某些質(zhì)?？勺匀粊G失,為 102108, 用某些物理、化學(xué)方法處理,頻率僅可使子1.2.2接種于固體 lb 斜面, 30 c 培養(yǎng) 20 h; (2) 用 5 ml生理鹽水洗下菌苔, 稀釋, 取 200 l 用 lb 玻棒涂 布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板; (3) 將涂布的平板在 30 w 紫外燈下照射 2 min, 同時(shí)取不照射的涂布平板作為對(duì)照以便觀察試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的影響, 30 c 溫箱 培養(yǎng) 20

13、 h; (4) 挑取單個(gè)菌落 , 接種至 無(wú)質(zhì)粒菌株篩選培養(yǎng)基中, 37 c、200 r/min 振蕩培養(yǎng) 20 h; (5)以堿裂解法快速提取質(zhì)粒 dna, 電泳檢測(cè)。代細(xì)菌中的質(zhì)粒消除, 其消除頻率比自然丟失增加102105 倍。質(zhì)粒消除后其控制的表型特性不再恢復(fù), 除非外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 11 。目前質(zhì)粒的消除方法很多 , 由于結(jié)構(gòu)及生理上的獨(dú)特性, 不同菌株的質(zhì)粒消除機(jī)制 各不 相 同 , 到目 前為 止 , 尚沒(méi) 有普 遍適 用 的 質(zhì)粒消除方法12。本文擬采用十二烷基硫酸鈉和逐步提高生長(zhǎng)溫 度結(jié)合法、紫外線涂布平板、凍融法、吖啶橙法和凍融法10:在濃度為 21094109 個(gè)/ml 的1

14、.2.3鐘義軍等: 洋蔥伯克霍爾德菌 t1828 質(zhì)粒消除方法及條件849受試菌株細(xì)胞懸液中加入 5% 的甘油, 置于20 c徹底冷凍后, 在 37 c 完全融化, 再于20 c 速凍, 然后再融化, 如此重復(fù) 3035 次后取 200 l 菌液涂 布無(wú)質(zhì)粒菌株篩選平板, 挑取單菌落接種至無(wú)質(zhì)粒菌株篩選培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后, 以堿裂解法快速提取質(zhì)粒 dna, 電泳檢測(cè)。1.2.4 吖啶橙法(ao)14: 在 lb 培養(yǎng)基中添加 10%的 ao 母液, 使 ao 終濃度為 200 mg/l, 接種 t1828種子液, 30 c、180 r/min 培養(yǎng) 48 h。然后取 200 l 菌液涂布無(wú)質(zhì)粒菌

15、株篩選平板, 挑取單菌落接種至 無(wú)質(zhì)粒菌株篩選培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后, 以堿裂解法快速提取質(zhì)粒 dna, 電泳檢測(cè)。1.2.5 黃芩甙法15: 將 t1828 接種于液體 lb 培養(yǎng) 基中過(guò)夜培養(yǎng) , 再經(jīng) 過(guò) 4 h 活化后調(diào)菌液溶度至 9108 個(gè)/ml, 加入黃芩甙使其終溶度為 100 mg/l。 于 37 c 避光振蕩培養(yǎng) 48 h 后, 取 200 l 菌液涂布無(wú)質(zhì)粒菌株篩選平板, 挑取單菌落接種至無(wú)質(zhì)粒菌 株篩選培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后, 以堿裂解法快速提取質(zhì)粒 dna, 電泳檢測(cè)。2結(jié)果與分析2.1sds 和高溫高濃度處理交替培養(yǎng) t1828 結(jié)果菌株 t1828 經(jīng)過(guò) sds 和高溫高濃度處

16、理交替培養(yǎng)后, 涂布平板挑出了 24 株菌株, 接種到 lb 肉湯 中過(guò) 夜培 養(yǎng) 后 , 用堿 裂解 法快 速提取 細(xì)菌 質(zhì)粒 , 電泳檢測(cè)結(jié)果(圖 1)表明在挑出的 24 株細(xì)菌中, 2、3、4、5、6、7、8、15、16、23 和 24 號(hào)菌株沒(méi)有質(zhì)粒 條帶, 表明這 11 株菌株質(zhì)粒得到消除。2.2紫外線涂布平板照射法消除 t1828 質(zhì)粒結(jié)果 t1828 菌株在 30 w 紫外線燈處理 2 min 后, 挑 出了部分菌株, 接種到 lb 肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)后, 用堿 裂解法快速提取細(xì)菌質(zhì)粒, 電泳檢測(cè)結(jié)果顯示紫外 線對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌 t1828 菌株質(zhì)粒消除沒(méi)有效果,2.3沒(méi)有得到無(wú)質(zhì)

17、粒突變株。凍融法消除 t1828 質(zhì)粒質(zhì)粒結(jié)果t1828 菌株在經(jīng)過(guò) 34 次凍融后, 涂布平板挑出部分單菌落, 接種到 lb 肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)后, 用堿裂解法快速提取細(xì)菌質(zhì)粒, 電泳檢測(cè)結(jié)果顯示凍融法 對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌 t1828 菌株質(zhì)粒消除沒(méi)有效果, 沒(méi)有得到無(wú)質(zhì)粒突變菌株。推測(cè)其原因可能是洋蔥伯克霍爾德菌質(zhì)粒過(guò)大, 大約 90 kb 以上, 一般的物 理方法難于消除該菌屬質(zhì)粒。2.4 吖啶橙法消除 t1828 菌株質(zhì)粒結(jié)果菌株 t1828 經(jīng) 200 mg/l 的吖啶橙處理 48 h 后,取 200 l 涂布平板, 培養(yǎng) 24 h 后挑取部分單菌落過(guò) 夜培 養(yǎng) , 用堿 裂解 法快速

18、提取 細(xì)菌質(zhì) 粒 , 電泳 檢測(cè) 結(jié)果(圖 2)顯示, 洋蔥伯克霍爾德菌 t1828 經(jīng)吖啶橙處理后, 在挑出的單菌落中篩選到 1 株無(wú)質(zhì)粒菌株,即 1 號(hào)泳道菌株。1.2.6無(wú)質(zhì)粒突變株傳代穩(wěn)定性試驗(yàn): 將出發(fā)菌 株 t1828 和 11 株無(wú)質(zhì)粒突變株分別在 lb 肉湯中繁殖 50 代后, 提取質(zhì)粒, 電泳檢測(cè)是否有質(zhì)粒重現(xiàn) 現(xiàn)象。1.2.7 sds 和提高生長(zhǎng)溫度結(jié)合法消除質(zhì)粒條件優(yōu) 化: 考察 sds 濃度、生長(zhǎng)溫度、sds 處理時(shí)間和 sds 加入時(shí)間對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌 t1828 質(zhì)粒消除的影 響, 并計(jì)算消除率。消除率(%)=無(wú)質(zhì)粒突變株總數(shù)/lb 固體平板上 菌落總數(shù)100%圖

19、 1質(zhì)粒消除株電泳圖fig. 1 plasmid dna electrophoresis map after plasmid elimination electrophoresis注: m: /hind ; 0: 出發(fā)菌株 t1828 質(zhì)粒; 124: 處理后菌株.note: m: /hind ; 0: plasmid dna of t1828; 124: treated strains.圖 2吖啶橙法處理菌株電泳圖fig. 2 plasmid dna electrophoresis map after plasmid elimination electrophoresis by ao注: m

20、: /hind ; 0: 出發(fā)菌株 t1828 質(zhì)粒; 19: 處理后菌株.note: m: /hind ; 0: plasmid dna of t1828; 19: treated strains.2.5 黃芩甙消除 t1828 菌株質(zhì)粒結(jié)果用終濃度為 100 mg/l 的黃芩甙避光處理菌株t1828 48 h 后, 取 200 l 涂布平板, 培養(yǎng) 24 h 后挑 取部分 單菌落過(guò)夜 培養(yǎng) , 以堿裂解法快速 提取細(xì) 菌質(zhì) 粒 , 電泳檢測(cè)結(jié)果顯示黃芩甙對(duì)洋蔥伯克霍爾2.7sds 和提高生長(zhǎng)溫度結(jié)合法消除質(zhì)粒條件優(yōu)化2.7.1sds 濃度對(duì)質(zhì)粒消除的影響: sds 濃度對(duì)消除細(xì)菌的質(zhì)粒有很

21、大影響, 低濃度不能完全改變質(zhì) 粒在細(xì)胞膜上的結(jié)合位點(diǎn), 不能使某些與質(zhì)粒復(fù)制及分配有關(guān)的蛋白部分或完全失活, 質(zhì)粒消除效果 偏低。而高濃度的 sds 則能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng), 消除率同樣偏低。在 lb 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入一定量 的 10% sds, 使最后處理終濃度 分別 為 0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.15%; 并在各種培養(yǎng)基中接種 50 l 的 t1828 種子液, 使各試管最后總體積達(dá) 到 5 ml。接種后 30 c、180 r/min 培養(yǎng) 1618 h 后, 取德菌 t1828 菌 株質(zhì)粒 消除 沒(méi)有效 果 ,質(zhì)粒菌株。 2.6無(wú)質(zhì)粒突變株穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果沒(méi) 有得

22、到無(wú) 將出發(fā)菌株 t1828 和 11 株無(wú)質(zhì)粒突變株一起繁殖 50 代后, 提取質(zhì)粒, 檢驗(yàn)是否有質(zhì)粒重現(xiàn)現(xiàn)象。 電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖 3。11 株無(wú)質(zhì)粒突變株仍無(wú)質(zhì)粒 條帶, 說(shuō)明這 11 株突變株質(zhì)粒消除的性能穩(wěn)定, 可 以此為材料進(jìn)行相關(guān)的產(chǎn)冠菌素性能研究。50 l 培養(yǎng)液加入到不含 sds 的 lb 培養(yǎng)基中, 35 c、180 r/min 培養(yǎng) 1618 h。如此重復(fù) 3 次。篩選無(wú)質(zhì)粒突變株后計(jì)算消除率, 得到如圖 4 所示的結(jié)果。圖 3第 50 次繁殖無(wú)質(zhì)粒突變株質(zhì)粒 dna 電泳圖fig. 3no. 50 of plasmid dna electrophoresis map of

23、 plasmid elimination strains注: m: /hind ; 0: 出發(fā)菌株 t1828 質(zhì)粒; 111: 無(wú)質(zhì)粒突變株.note: m: /hind ; 0: plasmid dna of t1828; 111: plasmid elimination strains.圖 4sds 濃度對(duì)質(zhì)粒消除的影響fig. 4sds concentration on the impact of plasmidelimination鐘義軍等: 洋蔥伯克霍爾德菌 t1828 質(zhì)粒消除方法及條件851從圖 4 可以看出, 低濃度的 sds 對(duì)消除 t1828質(zhì)粒效果不佳, 培養(yǎng)基中 sd

24、s 終濃度為 0.02%時(shí)質(zhì) 粒消除率為 25.3%, 濃度為 0.1%時(shí)消除率則達(dá)到了 最高, 為 50.7%, 而 0.15%時(shí)質(zhì)粒消除率僅為 44.8%。表明冠菌素產(chǎn)生菌 t1828 質(zhì)粒消除的最佳 sds 濃度是 0.1%。2.7.2生長(zhǎng)溫度對(duì)質(zhì)粒消除的影響: 溫度可以使細(xì) 菌質(zhì)粒的復(fù)制受到抑制, 或者使部分細(xì)菌質(zhì)粒不夠穩(wěn)定, 從而使質(zhì)粒丟失。提高溫度是一種物理方法,單獨(dú)使用時(shí)消除效果不佳, 一般需要和化學(xué)方法連 用。同時(shí), 提高的溫度幅度對(duì)質(zhì)粒消除和細(xì)菌生長(zhǎng)都有很大 影 響 , 因此需 要考察提 高 溫度的程 度 。在 lb 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 50 l 的 10% sds, 使sds

25、 處理濃度為 0.1%, 接種 50 l 的 t1828 種子液 ,30 c、180 r/min 培養(yǎng) 1618 h 后 , 取 50 l 培養(yǎng) 液加入 到 不 含 sds 的 lb 培養(yǎng) 基中 , 選取 30 c、33 c、 36 c、39 c 和 42 c 5 個(gè)不同溫度分別培 養(yǎng) 1618 h。如此重復(fù) 3 次。篩選無(wú)質(zhì)粒突變株后計(jì)算消除率的結(jié)果見(jiàn)圖 5。培養(yǎng)菌液 1618 h。重復(fù) 3 次。消除率結(jié)果見(jiàn)圖 6。圖 6 的結(jié)果表明消除率隨 sds 處理時(shí)間變化而 變化, 處理時(shí)間為 14 h 和 22 h 時(shí)消除率很低, 分別 為 34.7%和 35.2%, 處理時(shí)間為 18 h 時(shí)質(zhì)粒

26、消除效 果達(dá) 到最 佳 , 消除率 為 46.9%, 所以 洋蔥 伯克 霍 爾德菌質(zhì)粒消除最佳 sds 處理時(shí)間為 18 h。圖 6sds 處理時(shí)間對(duì)質(zhì)粒消除的影響fig. 6 sds treatment time effects on plasmid elimination2.7.4 sds 添加時(shí)間對(duì)質(zhì)粒消除的影響: 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種培養(yǎng) 0、8、16、24 和 36 h 時(shí)分別加入sds, 使 sds 處理濃度為 0.1%, 30 c、 180 r/min培養(yǎng) 18 h 后 , 取 50 l 培養(yǎng)液加入到不含 sds 的 lb 培養(yǎng)基中 , 36 c 培養(yǎng) 1618 h。重復(fù) 3 次。

27、篩 選 無(wú)質(zhì)粒突變株后計(jì)算消除率, 得到如圖 7 所示的結(jié)果。圖 7 結(jié)果表明在細(xì)菌生長(zhǎng)的延滯期和衰亡期添 加 sds 時(shí)質(zhì)粒消除率比較低, 在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期添加 sds 時(shí)的質(zhì)粒消除率比較高, 最高為 16 h 左右,為 47.3%, 即在細(xì)菌培養(yǎng)到 16 h、od600 值 1.01.2時(shí)的質(zhì)粒消除率較高。圖 5生長(zhǎng)溫度對(duì)質(zhì)粒消除的影響fig. 5 growth temperature effects on plasmid elimination圖 5 表明溫度對(duì) t1828 質(zhì)粒消除的影響較大,最適生長(zhǎng)溫度 30 c 和 33 c 時(shí)消除率均低于 35%,36 c 時(shí)質(zhì)粒消除率最高, 達(dá)

28、到 47.9%, 溫度再提高 則消除率下降, 到 42 c 時(shí)則完全抑制了出發(fā)菌株t1828 的生長(zhǎng), 消除率為 0。2.7.3sds 處理時(shí)間對(duì)質(zhì)粒消除的影響: 在 lb基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 50 l 的 10% sds, 使 sds 處理濃度為 0.1%, 接種 50 l 的 t1828 種子液, 30 c、180 r/min 分別培養(yǎng) 14、16、18、20 和 22 h 后 , 取50 l 培養(yǎng)液加入到不含 sds 的 lb 培養(yǎng)基中, 36 c圖 7sds 添加時(shí)間對(duì)質(zhì)粒消除的影響fig. 7 sds added time effects on plasmid elimination學(xué)報(bào)

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