基因芯片在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用教材

1、基因芯片在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用作者 指導(dǎo)老師摘要 ：基因芯片技術(shù)是 21 世紀(jì)生物技術(shù)的重要發(fā)展，是生命科學(xué)與物理學(xué)、化學(xué)、微電 子學(xué)以及計算機(jī)學(xué)等學(xué)科相互交叉的一門高新技術(shù)。該技術(shù)的突出特點(diǎn)在于其高度的并行 性、多樣化、微型化、自動化，基因芯片技術(shù)應(yīng)用于功能基因研究、雜交測序、藥物篩選 診斷、基因表達(dá)、基因多態(tài)性和突變檢測等，除了在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥學(xué)、司法和農(nóng)林 業(yè)等領(lǐng)域上都有極為廣闊的應(yīng)用外，在環(huán)境保護(hù)上，一方面可以快速檢測污染微生物或有 機(jī)化合物對環(huán)境、人體、動植物的污染和危害，同時也能夠通過大規(guī)模的篩選尋找保護(hù)基 因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品 。關(guān)鍵詞 ：基

2、因芯片；環(huán)境保護(hù)；環(huán)境污染；微生物檢測Gene Chip Technology and its Application in EnvironmentProtectionAuthor Wang Han YuInstructor Cai Tian MingAbstract： Gene chip technology is one of the important development of biotechnology in the 21st century, and it is a high technology which the life scientific and physics, ch

3、emistry, microelectronics and computer science and other disciplines intersect at. The salient features of this technology is its high degree of parallelism, diversification, miniaturization, automation, Gene chip technology has been used in functional genomics research, hybridization sequencing, dr

4、ug screening, diagnosis, gene expression, gene polymorphism and mutation detection, etc. Apart from the external application on the field of biology, medicine, pharmaceutics, judicial and agroforestry, In environmental protection, On the one hand it can quickly detect the pollution and harm comes fr

5、om microorganisms or organic compounds of environment, human, animal and plant. But also to seek protection through large-scale genetic screening, and prepare genetic engineering drugs to hazard Prevention or gene product which can control pollution.Key words: Gene Chip；environment protection； envir

6、onment pollution ；microbial detection 前言基因芯片, 又稱DNA 微探針陣列 (microarray), 是一種最重要的生物芯片的一條分支， 是伴隨人類基因組計劃而產(chǎn)生的，該技術(shù)的突出特點(diǎn)在于其高度的并行性、多樣化、微型 化、自動化，被認(rèn)為是生命科學(xué)研究中繼基因克隆技術(shù)、基因自動測序技術(shù)、PCR 技術(shù)后的又一次革命性的技術(shù)突破。是近年來不僅在分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的重要進(jìn)展。它 的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法是一致的 , 都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ) 的靶核苷酸序列雜交 , 通過隨后的信號檢測進(jìn)行定性與定量分析?；蛐酒谝晃⑿〉幕?片(硅片、

7、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子識別探針 , 能夠一次分析大量的基因 , 進(jìn) 行大信息量的篩選與檢測?；蛐酒梢钥焖儆行У貦z測污染源， 檢測由微生物、有機(jī)物 等引起的污染，對環(huán)境污染物進(jìn)行檢測與評價。同時能夠幫助研究人員通過大規(guī)模的篩選 制備能夠治理污染源的基因產(chǎn)品或?qū)ふ业奖Ｗo(hù)基因并制備防止危害的基因工程產(chǎn)品。1 基因芯片的原理和種類1.1 基因芯片的產(chǎn)生1985 年, 美國科學(xué)家率先提出人類基因組計劃，由此揭開人類生命科學(xué)史上的偉大工 程，隨著人類基因組計劃實(shí)施，大量的動植物、微生物基因組序列得以測定，基因序列數(shù) 據(jù)以前所未有的速度增加，怎樣去面對如此眾多的基因并探討其在生命活動中擔(dān)負(fù)

8、的功能 就成了生命科學(xué)者們共同的任務(wù)。有人就曾設(shè)想利用計算機(jī)半導(dǎo)體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片，以 對人類基因大量的遺傳信息進(jìn)行分析和檢查 ,直到 1994 年,由于光電化學(xué)的進(jìn)展、光刻技 術(shù)的誕生 ,Pease 等人創(chuàng)造的光導(dǎo)原位合成 （Light-direetedsymothesis）高密、微化的寡核昔酸陣列 （ODTA）技術(shù)得以問世，這才使設(shè)想逐步成為現(xiàn)實(shí)。基因芯片采用微加工和微電 子技術(shù)，可在大小 1cm的固相表面組裝固定若干、幾十、成千甚至上萬個不同 DNA探針， 以形成生物分子高密、二維陣列的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對基因分子信息個別 及大規(guī)模的分析和檢測。1.2 原理基因芯片的原理是基

9、于核酸分子堿基之間 （A 一 T/G 一 C）互補(bǔ)配對的原理，利用分子 生物學(xué)、基因組學(xué)、 信息技術(shù)、 微電子、精密機(jī)械和光電子等技術(shù)將一系表面構(gòu)成微點(diǎn)陣， 然后將標(biāo)一記的樣品分子與微點(diǎn)陣上的 DNA雜交, 以實(shí)現(xiàn)對多到數(shù)萬個分子之間的雜交反 應(yīng), 并根據(jù)雜交模式構(gòu)建目標(biāo) DNA的序列，從而達(dá)到高通量大規(guī)模地分析檢測樣品中多個 基因的表達(dá)狀況或者特定基因 （DNA）分子是否存在的目的。例如將由 A、T、C、G4 種核普 酸任意組合形成的八聚體寡核昔酸探針 （65536 個） 和 1 個長度為 12個寡核昔酸堿基組成為 AGCCTAGCTG的AADNA單鏈進(jìn)行雜交反應(yīng) , 結(jié)果有 5 種探針可以

10、和目標(biāo) DNA互補(bǔ)結(jié)合，它們 分別是 TCGGATC、GCGGATCG、AGGATCG、ACGATCGAC和T ATCGACT。T將這些具有重疊序列的 探針進(jìn)行重排就可以構(gòu)建目標(biāo) DNA的互補(bǔ)序列。1.3 種類基因芯片的類型較為繁多，其分類方法較多：根據(jù)載體基質(zhì)不同分為 : 無機(jī)片基基因 芯片，指其基質(zhì)基片是無機(jī)物，如 : 玻璃、硅片等，有機(jī)片基基因芯片，指其基質(zhì)基片是 有機(jī)物，如 :凝膠、尼龍膜等；依據(jù)探針合成的順序分為 : 原位合成基因芯片和預(yù)先合成后 上樣的基因芯片，前者通過聚乙二醇或硅烷類化學(xué)試劑在不同位點(diǎn)合成不同的探針，后者 比較簡單，先制備好 cDNA 或寡核營酸，然后在經(jīng)特殊處理

11、的玻片、硅片或膜上點(diǎn)樣；按 照基因芯片的用途可分為 : 基因表達(dá)芯片和 DNA測序芯片，前者可以將克隆到的成千上萬 個基因特異的探針或 cDNA片段固定在一塊 DNA芯片上，對來源不同的個體 （ 正常人或患 者） 、組織、細(xì)胞周期、發(fā)育階段、分化階段、不同的病變、不同刺激 （ 包括不同誘導(dǎo)和不 同治療手段 ） 下的細(xì)胞內(nèi) mRNA或反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的 cDNA進(jìn)行檢測，對這些基因表達(dá)的個體 特異性、病變特異性、刺激特異性進(jìn)行綜合分析和判斷，將某個或某幾個基因與疾病聯(lián)系 起來，極快地確定這些基因的功能，且可進(jìn)一步研究基因與基因間相互作用關(guān)系，后者則 是對大量的基因進(jìn)行序列分析。按基因芯片組裝的探針可

12、分為 : 寡核昔酸和 cDNA芯片，前 者可用于基因組學(xué)及表達(dá)譜研究，后者僅用于表達(dá)譜研究。2 基因芯片技術(shù)2.1 DNA 陣列的構(gòu)建和印制根據(jù)芯片種類的應(yīng)用目的的不同，芯片核酸陣列的構(gòu)建方式也不相同，首先是根據(jù)研 究目的選用合適的寡核苷酸、 cDNA 片段或特定的功能基因等，按統(tǒng)計方式事先構(gòu)建成點(diǎn) 陣列，然后，將所需用的核酸片段就位合成于芯片上，或以大致相當(dāng)?shù)臐舛?，變性后采?手工或機(jī)械的方法，按一定的排列方式點(diǎn)樣在特定的固相支持物上，前者稱為原位合成， 后者可有壓電打印和直接點(diǎn)樣兩種方法。2.2 靶樣品的準(zhǔn)備靶樣品就是DNA樣品，主要來源是從生物細(xì)胞中提取 mRNA后經(jīng)轉(zhuǎn)錄成 cDNA通常

13、采 用常規(guī)的基因分離、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增的標(biāo)記等，為了獲得雜交信號，在擴(kuò)增過中加同位素或 化學(xué)熒光進(jìn)行標(biāo)記。同位素常用 P33/S35，使用熒光標(biāo)記，沒有同位素的放射危險性，通過 激光共聚焦掃描儀器尋址測讀，具有很高的分辨能力、極高的靈敏度和定位功能，是目前 廣泛用于芯片雜交結(jié)果判讀的標(biāo)記方法，熒光標(biāo)記染料已開發(fā)出了數(shù) 10種。2.3 雜交和檢測雜交 ：芯片雜交過程與傳統(tǒng)的 Southern 印跡雜交等類似，屬于固液相正相雜交： 探針分子固定于芯片表面，與液相的靶分子進(jìn)行反應(yīng)。但這種方式不僅使得檢測過程平行 化，可以同時檢測成百上千的基因序列，而且由于集成的顯微化，使得雜交所需的探針及 待測樣品均大

14、為減少，雜交時間明顯縮短。檢測：對于熒光標(biāo)記芯片應(yīng)用熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描儀等采集各雜交點(diǎn)熒光信 號如位置和強(qiáng)度；同位素標(biāo)記多采用放射自顯影檢測雜交信號；最近發(fā)展的納米金標(biāo)記， 通過銀放大后可直接在裸眼或普通光學(xué)顯微鏡下觀察。最終再用相關(guān)軟件進(jìn)行信號的分析 處理，得出待測樣品的核酸信息。2.4 數(shù)據(jù)收集和分析 將經(jīng)熒光或激光共聚焦掃描得到的圖像輸入計算機(jī)，按不同的研究目的，用專門軟件 對雜交產(chǎn)生的印跡進(jìn)行數(shù)據(jù)的自動化處理和定量分析。其基本步驟為樣品斑點(diǎn)的確定、圖 像背景的識別和扣除，所得的數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)化后，進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到基因的表達(dá)圖譜。3 基因芯片在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用3.1 微生物群落研究

15、中的應(yīng)用31.1 探究群落中微生物的意義 微生物在生態(tài)系統(tǒng)的功能和持續(xù)中起著極其重要的作用，了解微生物群落的結(jié)構(gòu)和組 成以及它們對環(huán)境干擾的反應(yīng)和適應(yīng)性，對于維持和恢復(fù)生態(tài)系統(tǒng)理想的生態(tài)功能是很重 要的環(huán)境微生物群落研究包括環(huán)境樣品的微生物分布、種類、功能、動力學(xué)變化及氣候、 環(huán)境污染等環(huán)境因素改變對其微生物生態(tài)的影響等。3.1.2 基因芯片技術(shù)用于環(huán)境微生物研究具有更多優(yōu)勢與傳統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)相比， 基因芯片技術(shù)用于環(huán)境微生物研究具有更多優(yōu)勢： 首先，DNA或寡核苷酸為基礎(chǔ)的基因芯片技術(shù)是研究功能基因組學(xué)的有力工具，它允許研究者全 面地研究不同條件下活細(xì)胞的生理學(xué)。第二，基因芯片技術(shù)不需要知

16、道保守序列，不同種 群的同一功能組的所有多態(tài)性基因序列可以構(gòu)建在芯片上，并且以此作為探針來檢測它們 在環(huán)境樣品中的的相應(yīng)分布。第三，不需要枯燥費(fèi)時的配對雜交。第四，基因芯片需要的 樣品量少，適宜于環(huán)境微生物檢測。第五，基因芯片具有定量特性?；蛐酒诃h(huán)境微生 物研究中的應(yīng)用處于起步階段，但是，芯片技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用將加速復(fù)雜環(huán) 境微生物系統(tǒng)的生態(tài)、生理、結(jié)構(gòu)和功能的了解。3.1.3 常用基因芯片的種類(1) 系統(tǒng)寡核苷酸芯片系統(tǒng)寡核苷酸芯片建立在系統(tǒng)標(biāo)記基因如 rRNA 基礎(chǔ)之上。 rRNA 是研究細(xì)菌進(jìn)化和親 源關(guān)系的重要指標(biāo)， 是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)最有用和常用的分子鐘。 16S rR

17、NA 是最常用的作 為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。它由多個高度保守的區(qū)段和可變區(qū)段組成，保 守性序列基本保守， 反映生物物種的親緣關(guān)系， 因此可以利用恒定區(qū)序列設(shè)計引物將 16S rRNA 片段擴(kuò)增出來； 高變性則揭示生物物種的特征核酸序列， 其序列因不同細(xì)菌而異， 因此可利用可變區(qū)序列的差異來設(shè)計不同菌屬、菌種的探針。系統(tǒng)寡核苷酸芯片是目前應(yīng) 用最廣的一種基因芯片， 利用該技術(shù)已經(jīng)成功對堆肥、土壤、活性污泥、鈾污染含水土 層等環(huán)境樣品進(jìn)行了微生物檢測、菌群動力學(xué)、多樣性和結(jié)構(gòu)分析。(2) 功能基因芯片功能基因芯片通常建立在催化生化反應(yīng)的關(guān)鍵功能基因之上， 這些基因包括了那些 與研究對

18、象有確定關(guān)系的基因， 或至少是與研究對象的關(guān)系有待考證的基因。 作為 FGA 候 選基因應(yīng)該具有的特點(diǎn)： (1) 該基因是參與生化過程的關(guān)鍵酶或蛋白質(zhì)編碼基因； (2) 進(jìn) 化保守但在不同微生物之間具有足夠的變異， 從而可以對不同菌株設(shè)計探針； (3) 不同 的基因在數(shù)據(jù)庫的序列信息量是不同的， 應(yīng)該選擇在公共數(shù)據(jù)庫中具有翔實(shí)序列信息的 有關(guān)基因。根據(jù) FGA 的目的及其雜交靶標(biāo)的種類， FGA 分為功能分類基因芯片和基因 表達(dá)芯片。 前者的目的主要是研究菌群是否具有這些特定反應(yīng)過程及其功能的分布、變 化、多樣性， 其雜交靶標(biāo)是菌群 DNA的 PCR 產(chǎn)物。而后者用于研究這些特定功能基因的 生

19、理活性及其基因表達(dá)情況， 需提取環(huán)境樣品的 mRN，A 其雜交靶標(biāo)是菌群 cDNA的 PCR產(chǎn) 物。(3) 群落基因組芯片 (CGA)群落基因組芯片 (CGA) 是一種將可培養(yǎng)微生物的全基因組 DNA 作為探針的技術(shù)， 它 的特異性高， 可以鑒定到種甚至菌株水平； 敏感性強(qiáng)， 只需 0.2 ng 的待分析基因組 DNA 就可檢測。 CGA在 微生物檢測、鑒定、量化、不同環(huán)境樣品的微生物菌群相關(guān)性或不同微 生物基因組的相關(guān)性分析等方面將有著廣泛的前景。(4) 宏基因組芯片 (MGA)未培養(yǎng)微生物組成了地球上生物多樣性的主體，據(jù)估計， 自然環(huán)境中超過 99%的微 生物不能用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行純培養(yǎng)，

20、因此， 人們開始通過免培養(yǎng)的技術(shù)即宏基因組或直 接從環(huán)境樣品中抽提克隆微生物的混合 DNA 來研究環(huán)境樣品中微生物基因組的功能和序 列分析。目前， 利用該技術(shù)已進(jìn)行了酸礦外排液和 Sargasso Sea 的微生物群落、活性污 泥和土壤細(xì)菌 PHB 代謝遺傳學(xué)等的研究。該技術(shù)可以分析環(huán)境樣品微生物結(jié)構(gòu)和功能； 可以通過不同環(huán)境樣品宏基因組芯片的比較分析獲得某環(huán)境樣品菌群的代表 DNA 探針。3.1.4 研究方法(1) 基因指紋圖譜法：指紋圖譜法是指用各種技術(shù)來評估 PCR產(chǎn)物在凝膠上的譜帶類型，有下述的許多方法 可以用于區(qū)分群落間的差異，但當(dāng)它們用于像多樣性指數(shù)等更精度的分析時，必須首先確 定

21、每一譜帶類型只代表一個種。酶解技術(shù)，如擴(kuò)增 rDNA 限制性片段分析、限制性酶切片 段長度多態(tài)性分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析等方法，每一個種都有多個譜帶類型，使它們難 以單獨(dú)用于群落多樣性分析，而更適合于在基因測序之前對克隆文庫及分離物進(jìn)行篩選。 其缺點(diǎn)是，由于僅有末端片段長度被分析，獲得的信息較少，不足以分析非常復(fù)雜的微生 物群落，如土壤微生物群落，因?yàn)槎喾N微生物的酶切末端片段長度可能相同，造成對物種 豐度的估計過低。(2) 分子雜交法直接將 PCR產(chǎn)物或樣品 DNA/RNA與已有的探針雜交來檢測微生物群落的多樣性能夠用于識別種間或種內(nèi)差異性，其特點(diǎn)是不需要對目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此可以避免

22、 PCR過程中產(chǎn)生的誤差；但是同樣因?yàn)槲磳δ繕?biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，目標(biāo)基因濃度較低，容易給檢 測帶來困難；且有時目標(biāo)類群的目標(biāo)基因序列并非完全同一，而是有亞類群之間的差異， 結(jié)果所設(shè)計的探針 DNA序列與某些亞類群的目標(biāo)基因互補(bǔ)性較差，從而導(dǎo)致對該類群的估 計過低；此外，它只能用來檢測事先估計到其存在、己知其目標(biāo)基因序列、并為之設(shè)計好 引物的類群。(3) 定量 PCR分析法通過定量 PCR可以直接測定目標(biāo)基因在微生物群落中的拷貝數(shù)或相對量，目前有稀釋 PCR(Limiting Dilution PeR) 、動力學(xué) PCR(Kinetic PCR)! 競爭性 PCR(Competitive PCR)

23、和適時熒光定量 PCR。稀釋法定量 PCR盡管簡單，但它卻不能提供準(zhǔn)確的定量測定數(shù)據(jù)， 因?yàn)樵?PCR的指數(shù)擴(kuò)增階段，微小的變異將顯著改變 PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。是迄今為止定量最 準(zhǔn)確、重現(xiàn)性最好的定量方法，己廣泛用于基因表達(dá) ! 轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效檢測、病原 體檢測等諸多領(lǐng)域。(4) 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析法該方法是應(yīng)用 DNA測序技術(shù)直接將目標(biāo)基因進(jìn)行序列測定，并與基因文庫中己有的序 列進(jìn)行比較分析來確定微生物群落多樣性及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。該方法能提供各個克隆分類 地位的可靠信息，但需要很長的試驗(yàn)周期、大量的試驗(yàn)材料，實(shí)際工作中對所有的克隆進(jìn) 行測序難以實(shí)現(xiàn)，通常需要與 RFLP法或 T-RFL

24、P法結(jié)合，或者只隨機(jī)挑選部分克隆進(jìn)行測 序；而且根據(jù)克隆的拷貝數(shù)估計種群豐度將導(dǎo)入隨機(jī)誤差。3.1.5 基因芯片在環(huán)境微生物研究中的挑戰(zhàn)理論上，基因芯片技術(shù)提供了為復(fù)雜的微生物群落進(jìn)行全面的和定量研究所必須的優(yōu) 點(diǎn)，然而，與純培養(yǎng)的研究比較，基因芯片在對環(huán)境核酸樣品的分析面臨幾個重要的技術(shù) 挑戰(zhàn)。首先，基因芯片雜交的內(nèi)在變化是一個關(guān)鍵問題，目前，很難用同一種方法在不同 的實(shí)驗(yàn)室和甚至同一個實(shí)驗(yàn)室的不同實(shí)驗(yàn)間進(jìn)行數(shù)據(jù)比較；第二，當(dāng)有些環(huán)境樣品提取的 DNA或 RNA量不夠時，基因芯片雜交的靈敏度仍然不夠，不清楚是否基因芯片雜交的靈敏 度足夠檢測環(huán)境樣品中所有類型的微生物；第三，基因芯片研究環(huán)境樣

25、品產(chǎn)生的數(shù)據(jù)數(shù)量 可能很大，但是快速的處理和發(fā)掘分析雜交數(shù)據(jù)仍然處于初級階段；第四，整個群落的基 因數(shù)量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出目前基因芯片的容量；第五，盡管確定微生物群落性狀的基因芯片一 旦構(gòu)建成功，該芯片可以提供一種快速方法，但是制備適合于基因芯片分析的高質(zhì)量的樣 品成為了研究的瓶頸；最后，基因芯片僅僅是研究的工具，它們應(yīng)該結(jié)合到解決生態(tài)或環(huán) 境的問題和假說中去，只有這樣，分析微生物群落基因芯片的力量才能夠得到肯定。3.2 環(huán)境毒理學(xué)研究中的應(yīng)用3.2.1 病毒檢測基因芯片的應(yīng)用目前病毒感染的診斷以經(jīng)典血清學(xué)方法、現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)方法為主，但 在對那些遺傳變異頻繁的病毒感染進(jìn)行診斷時，這些方

26、法的程序復(fù)雜、工作周期長，不利 于快速診斷。 PCR技術(shù)應(yīng)用以來，為病毒感染的診斷提供了高靈敏度的檢測工具，但同時 非特異產(chǎn)物的增多也容易導(dǎo)致臨床診斷錯誤。在 PCR基礎(chǔ)上，利用核酸雜交特異性高的特 點(diǎn)，基因芯片能通過平行分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物快速、準(zhǔn)確地鑒別多種病原體，用于高通量、 大規(guī)模的病毒檢測和分型。3.2.2 細(xì)菌檢測基因芯片的應(yīng)用應(yīng)用基因芯片診斷病原菌的原理，在于細(xì)菌的 16S rRNA 基因的高度保守性。 rRNA基 因包括 313kb長的 23S、116kb長的 16S和僅 0112kb長的 5S三個基因。其中 16S rRNA基 因的長度最合適，是目前最常被選用作為細(xì)菌鑒定和分

27、類的基因。目前，幾乎所有已知細(xì) 菌 16S rRNA基因的堿基序列均被測定并存入基因庫，由于 RNA易于降解，多采用檢測 16S rRNA對應(yīng)染色體上的 16S rDNA序列。細(xì)菌檢測基因芯片中 16S rDNA 靶基因的選用國內(nèi) 外多有利用 16S rRNA靶基因制備的細(xì)菌檢測基因芯片的報道，如美國學(xué)者 Warsen在 2004 年根據(jù)細(xì)菌 16S rDNA設(shè)計寡核苷酸探針構(gòu)建基因芯片，對 18 種細(xì)菌進(jìn)行檢測，其中包括 嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、葡萄球菌、鏈球菌等 15 種魚類常見病原菌，結(jié)果能 100%特 異性地檢測出這些病原菌。細(xì)菌檢測基因芯片技術(shù)作為一種高新技術(shù)，例如：已經(jīng)在水產(chǎn)中微

28、生物的鑒定、水產(chǎn) 動物疾病的快速診斷等方面有廣闊的應(yīng)用前景。概括起來它的優(yōu)越性主要有： （1）以各類 致病基因的特異片段為檢測樣品，可同時檢測多種疾病，提高檢測效率； （ 2）整個過程無 需機(jī)體免疫反應(yīng)，少量檢測樣品就可做出早期診斷； （3）能夠測定病原體的耐藥性問題， 有利于對癥下藥；（4）該技術(shù)由 DNA雜 交技術(shù)和 PCR 擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，有極高的靈敏度、 特異性和可靠性；（5）自動化程度較高，有利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。3.2.3 基因芯片技術(shù)在食品致病菌檢測中的應(yīng)用 基因芯片技術(shù)作為一種新的技術(shù)平臺，已廣泛地應(yīng)用于食品研究領(lǐng)域。隨著該技術(shù)的 不斷完善，其將在食品研究和食品安全中發(fā)揮越來越重

29、要的作用。就基因芯片技術(shù)檢測食 品中常見致病菌的基本原理、檢測過程、存在的問題、研究進(jìn)展作一介紹?；蛐酒幕?本原理是將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng) PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確 定檢測樣品是否存在某些特定微生物。常規(guī)檢測方法主要有傳統(tǒng)生化培養(yǎng)檢測法、探針雜交、 PCR法。傳統(tǒng)方法是采用細(xì)菌 培養(yǎng)、生化鑒定與血清分型，由于操作簡單、經(jīng)濟(jì)而被廣泛采用，但檢測時限長 （ 一般要 1-2 周） ，效率低、靈敏度不高。常規(guī)檢測方法檢測食品中的致病菌已經(jīng)不能滿足快速檢測 的要求，難以適應(yīng)飛速發(fā)展的現(xiàn)代食品生產(chǎn)

30、和流通領(lǐng)域，因此為了確保食品的安全性，開 發(fā)快速檢測致病菌的方法，準(zhǔn)確地檢測食品中的致病菌具有十分重要的意義。該技術(shù)具有 傳統(tǒng)的檢測方法不可比擬的優(yōu)越性： 1 基因芯片可以對食品中的致病菌實(shí)行高通量和并行 檢測，一次實(shí)驗(yàn)即可得出全部檢測結(jié)果； 2 操作簡便快速，整個檢測在幾小時內(nèi)即可得出 檢測結(jié)果； 3 特異性強(qiáng)，敏感性高。隨著基因芯片檢測食品中致病菌技術(shù)的不斷發(fā)展和完 善，將廣泛應(yīng)用于出入境、食品安全指標(biāo)、突發(fā)事件等致病菌的檢測，食品安全必將得到 進(jìn)一步保障，并且將對整個食品領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。3.2.4 水產(chǎn)動物病原檢測基因芯片的應(yīng)用 隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，水生動物病害迅速蔓延。水產(chǎn)上的

31、細(xì)菌病害一直是現(xiàn)代水 產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)飛速發(fā)展的障礙， 而將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)病害中， 構(gòu)建細(xì)菌檢測基因芯片， 是發(fā)展的趨勢也是應(yīng)用的實(shí)際。與此同時，不同靶基因的選用也使得細(xì)菌檢測基因芯片技 術(shù)不斷完善。目前，分子生物學(xué)的核酸探針、斑點(diǎn)雜交和 PCR技術(shù)已普遍在海水養(yǎng)殖動物疾病檢測 中開發(fā)，并通過不同的組合應(yīng)用，得到了更高的靈敏度或準(zhǔn)確率，如Dot-ELISA 、免疫酶標(biāo)記檢測核酸雜交、 PCR-核酸探針雜交和實(shí)時定量 PCR技術(shù)使人們能在極廣范圍內(nèi)對病原 核酸進(jìn)行精確定量；此外，對水產(chǎn)動物病原的感染機(jī)理及病毒生態(tài)學(xué)研究都有極大的推動 作用。近年來，海水養(yǎng)殖動物的診斷技術(shù)已向著同時檢測多種病原方向

32、發(fā)展，例如同時檢 測 WSSV和 IHHNV的 PCR技術(shù)、同時檢測 TSV、WSS、V IHHNV的 （RT）PCR技術(shù)等，這些技術(shù) 的發(fā)展使人們看到了提高檢測通量所帶來的誘人效率。基因芯片技術(shù)以其無可比擬的高通 量和快速準(zhǔn)確的檢測能力必將會在水生動物病害診斷中呈現(xiàn)迅速發(fā)展的趨勢。3.4.5 環(huán)境毒理學(xué)研究中的應(yīng)用前景 伴隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，世界各地的快速工業(yè)化和城市化使得人類賴以生存的水環(huán)境體系面臨著前所未有的挑戰(zhàn)，特別是改革開放 30 多年來，我國工農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展， 大量工業(yè)和城市生活污水排放進(jìn)入江、河、湖、海，對水環(huán)境保護(hù)的呼聲不斷增高，客觀 上需要大量更具有科學(xué)性的、信息內(nèi)容更加

33、精確豐富的生態(tài)毒理學(xué)知識來指導(dǎo)和規(guī)范人類 的活動. 基因組學(xué)等革新生物技術(shù)的開展帶來了巨大的基因組學(xué)信息量，不斷有新物種的 全基因組信息被揭示出來，這為基因組學(xué)研究方法和技術(shù)引入到生態(tài)毒理學(xué)方面風(fēng)險因素 的評估創(chuàng)造了最佳的時機(jī) . 基于此開展以 DNA芯片研究生態(tài)毒理學(xué)的方法，對比傳統(tǒng)的毒 理學(xué)評價方法，不僅可以減少大量的實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量和實(shí)驗(yàn)時間，可以獲得更多關(guān)于毒物作 用機(jī)制的分子生物學(xué)信息，可以減少不確定的動物實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)結(jié)論，由一些眾所周知的生物 擴(kuò)展到整個生態(tài)中。3.3 環(huán)境生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用3.3.1 在生物多樣性研究中的潛在應(yīng)用生物多樣性及其保護(hù)是生態(tài)學(xué)的一個關(guān)節(jié)問題， 也是一個有關(guān)國計

34、民生的問題。 盡管， 傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)為確立生物多樣性提供了有效的工具，然而，一般來說，這些方法 都比較費(fèi)時費(fèi)工。含有對不同微生物具有特異性的標(biāo)識基因的基因芯片將為微生物的鑒定 和生物多樣性的研究提供有力、快速、及時的方法。3.3.2 生態(tài)環(huán)境中檢測的應(yīng)用 利用基因芯片眾所周知的微型化、集成化、自動化特點(diǎn)，將這種基因芯片技術(shù)引入到 對海洋青鳉魚的生態(tài)毒理學(xué)專用型 cDNA芯片的構(gòu)建上來，從而將海洋環(huán)境壓力危害性和 基因表達(dá)特征聯(lián)系起來，通過基因表達(dá)分析確定毒理因素的危害性，此研究結(jié)果不僅有助 于對海洋環(huán)境毒理因素相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了解，也為開發(fā)出創(chuàng)新型的海洋生態(tài)環(huán) 境監(jiān)測技術(shù)奠定了良

35、好的基礎(chǔ)。楊樹潰瘍病病原種類多樣，寄主廣泛。無性型多樣，種間形態(tài)特征有重疊；有性型不 常發(fā)現(xiàn)，且病原的檢測常受到地理、寄主、分類知識的限制，由此需要發(fā)展非依賴分離培 養(yǎng)方法的病原鑒定和林間診斷技術(shù)。通過對多種核酸模板和具遺傳標(biāo)記功能的多個靶標(biāo)核 酸序列（基因）的擴(kuò)增、測序和比對，多重 PCR 擴(kuò)增技術(shù)及基因芯片檢測技術(shù)可以直接 用于環(huán)境樣本的分析。多重 PCR 同時平行通量擴(kuò)增多個模板或位點(diǎn)，芯片具有同時平行 通量檢測多種病原菌的潛力，二者的聯(lián)合可完成快速高通量并行的檢測多個物種。將多重 PCR-基因芯片技術(shù)應(yīng)用到樹木潰瘍病病原的鑒定中，以期將檢測性芯片推廣應(yīng)用到樹木潰 瘍病生態(tài)監(jiān)測中。3.4

36、 用于環(huán)境污染檢測和防治3.4.1 污染源的檢測 基因芯片可以快速大規(guī)模的檢測污染源，同時幫助尋找保護(hù)基因及能夠治理污染源的 基因產(chǎn)品。如美國國立環(huán)境衛(wèi)生研究院的 Barrett 等構(gòu)建的名為 ToxChip 的 DNA 芯片， 它可以同時檢測有害化學(xué)物質(zhì)對幾千個不同基因表達(dá)的影響，被認(rèn)為是毒理研究有力的工 具。 Stin 等設(shè)計構(gòu)建了一種基于 16s DNA 區(qū)間的針對致病性弧菌的檢測芯片，通過對 Chesapeake 港灣的水中各類弧菌的檢測、鑒定，甚至定量，從而非常方便地實(shí)現(xiàn)對水質(zhì)的 變化進(jìn)行監(jiān)測及季節(jié)變化規(guī)律預(yù)測。因此有環(huán)境學(xué)專家指出基因芯片技術(shù)以及基于芯片技 術(shù)構(gòu)建的集樣本采集、加工

37、處理、純化、檢測為一體的微縮實(shí)驗(yàn)室必將成為今后水源及相關(guān)環(huán)境檢測的主要工具著著沿海經(jīng)濟(jì)建設(shè)速度的逐步加快和海洋開發(fā)活動的日益頻繁，海洋環(huán)境污染問題日 漸凸顯，近岸海域常常出現(xiàn)水質(zhì)清潔度不達(dá)標(biāo)，水體嚴(yán)重富營養(yǎng)化，營養(yǎng)鹽失衡等海洋生 態(tài)的不健康狀態(tài)，因而進(jìn)行海洋生態(tài)毒理學(xué)的深入研究，探索出快速、準(zhǔn)確的污染檢測方 法，將為海洋環(huán)境保護(hù)提供高水平的基礎(chǔ)支持，成為“持續(xù)發(fā)展”戰(zhàn)略的一種重要技術(shù)支 撐。3.4.2 基因芯片污染防治上的應(yīng)用 隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展和污水排放、采礦冶煉、農(nóng)藥和化肥的大量施用等原因， 以及土壤對污染物的累積富集作用，土壤污染日趨復(fù)雜化。土壤 Cd 污染狀況不容樂觀。 而且其進(jìn)

38、入食物鏈后對人類的健康將產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。隨著我國農(nóng)業(yè)栽培耕作方式趨于規(guī) ?；图s化發(fā)展，除草劑的使用量日漸增大。我國是世界上水稻的生產(chǎn)大國，因此作為 磺酰脲類除草劑中對水稻特異性較強(qiáng)的芐嘧磺隆在我國的使用量十分巨大。利用基因芯片 技術(shù)，在 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平上研究 Cd、芐嘧磺隆( BSM)及其復(fù)合污染對水稻的基因應(yīng)答機(jī) 制，能增加水稻對重金屬和有機(jī)污染物的耐受性。4存在問題及展望 一種技術(shù)總是從模糊走向精湛，進(jìn)而變得更為先進(jìn)，基因芯片技術(shù)就是如此。它在較 短的時間里發(fā)展的速度， 是其他技術(shù)都不可比擬的。 基因芯片發(fā)展方向包括以下幾個方面 : 第一， 現(xiàn)在cDNA 芯片需要大量的 RNA (

39、 l0ug 總RNA 或5OOng 的mRNA)， 因此必需改進(jìn) RNA 的擴(kuò)增方法以分析更小量的 RNA， 最終進(jìn)行單細(xì)胞表達(dá)分析； 第二，需發(fā)明新的更 敏感的信號檢測系統(tǒng)； 第三， 芯片制備、樣品處理、雜交、檢測以及數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化， 提高基因芯片的準(zhǔn)確性和可靠性。盡管基因芯片技術(shù)還存在很多問題， 但由于其具有并 行化和高通量的特點(diǎn)， 它的應(yīng)用前景仍十分廣闊。 我國基因芯片研究也緊跟國際前沿， 力爭在此高新技術(shù)領(lǐng)域里有一席之地，它將對我國生命科學(xué)研究，醫(yī)學(xué)診斷，新藥篩選具 有革命性的推動作用，也將對我國人口素質(zhì)、農(nóng)業(yè)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)等作出具大的貢獻(xiàn)，同 時帶動我國科學(xué)整體進(jìn)步，為各相關(guān)高科技

40、產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造機(jī)會?；蛐酒瑢⒊蔀?1世紀(jì)最令人注 目的高新技術(shù)領(lǐng)域之一，將使人類早日進(jìn)入生物信息時代。結(jié)論：基因芯片技術(shù)是 2O世紀(jì) 90年代發(fā)展起來的一項(xiàng)由分子生物學(xué)、物理學(xué)、微電子學(xué)、計 算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科交叉而形成的高新技術(shù)?；蛐酒且环N最重要的生物芯片，它的工作 原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法是一致的， 都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶 核苷酸序列雜交， 通過隨后的信號檢測進(jìn)行定性與定量分析，經(jīng)過幾十年來的錘煉，技 術(shù)不斷精湛起來，不僅在其他領(lǐng)域如生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥學(xué)、司法，農(nóng)林業(yè)等領(lǐng)域上有廣 泛的應(yīng)用，而且在環(huán)境保護(hù)學(xué)也是有極為廣闊的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)：1 李 晨， 黃 倢. 細(xì)菌檢 測

41、基因芯片 的簡述 及其在 水產(chǎn) 上的應(yīng) 用. 中 國農(nóng)學(xué) 通報 J 2010,26(4):41-44.2 路 超，姜慧敏， 張建峰等 . 鎘和芐嘧磺隆復(fù)合污染脅迫對水稻的基因應(yīng)答機(jī)理的基因芯片分析 J. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報 ,2013,32(3):426-431.3 張于光 , 李迪強(qiáng) , 肖啟明等 . 基因芯片及其在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用 J. 微生物學(xué)報， 2004 年 6 月，44卷 3期.4 鐘 毅 , 張 旭, 梁玉婷等 . 基于基因芯片技術(shù)的石油污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu) J. 清華大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版 ),2010 年, 第 50卷 , 第 9期.5 張于光, 李迪強(qiáng), 肖啟明等. 基因芯片及其在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用J. 微生物學(xué) 報 ,2004,44(3):406 一 410.6 李明, 曾任森 ,駱世明 .基因芯片技