各種表達(dá)載體

1、參考醫(yī)學(xué)表達(dá)載體一、原核細(xì)胞表達(dá)載體1. pBAD載體: 特點; 該表達(dá)質(zhì)粒含有araBAD(arabinose)操縱子的PBAD啟動子和編碼該啟動子的正負(fù)調(diào)控子基因araC，具有緊密調(diào)控功能和高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的原核細(xì)胞表達(dá)載體。請注意: 1. 當(dāng)要扦入其他信號肽片段，改建此載體時，請不要利用該載體上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位點，以免造成重組困難，因為前述內(nèi)切酶在此載體上均有二個位點，最好使用只有一個酶切位點的Sac1和Hind111位點。同時記住，如在不含任何信號肽的PBAD表達(dá)質(zhì)粒扦入信號肽，其非編碼N-末端要包含核糖體結(jié)合位點(RBS)核苷酸序列。2

2、在使用含Omp A分泌信號肽的PBAD表達(dá)質(zhì)粒時，請應(yīng)用Omp A分泌信號肽上的Sac1以及載體Hind111酶切位點，這些在載體序列上都是單個酶切位點。本公司目前有含Omp A分泌信號肽和不含任何信號肽的二種PBAD表達(dá)質(zhì)粒， 其多克隆位點區(qū)域圖譜如下: (a)、含Omp A分泌信號肽的PBAD表達(dá)質(zhì)粒多克隆區(qū)域 SDPBAD.TACCCGTTTTTTTCC.GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT A M A E L TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CT

3、C GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 Pst1 Hind111(b)、不含分泌信號肽的PBAD表達(dá)質(zhì)粒多克隆區(qū)域 EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1PBAD.TACCCGTTTTTTTGG.GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nde1 Sac1 Smal 1 Hind111下圖顯示本公司應(yīng)用pBAD表達(dá)載體完成的實驗結(jié)果: pBAD載體驅(qū)動大分子蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞Origami(DE3)內(nèi)高

4、效表達(dá)2. pCAl-n & pCAl-pelB載體 特點: 該原核細(xì)胞表達(dá)載體是來源于以T7 RNA聚合酶為基礎(chǔ)的pET載體，含有T7/LacO啟動子、編碼鈣調(diào)素結(jié)合多肽標(biāo)鑒和凝血酶切點的核苷酸序列。因此，該表達(dá)載體在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)、且這種表達(dá)的外源蛋白質(zhì)因帶有鈣調(diào)素結(jié)合多肽和凝血酶切點，故該蛋白產(chǎn)物易于純化和產(chǎn)業(yè)化。此外，本公司利用分泌信號肽PelB，構(gòu)建成新型的的原核細(xì)胞表達(dá)載體Pcal-PelB。此載體表達(dá)的蛋白產(chǎn)物能在分泌肽PelB的指引下進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)。(a). Pcal-n M K R R W K K N

5、 F I A V S A A N R F K K I S S S G A L L V PCATATG AAG GGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCATCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCC Nde1 R G S P G I L D S M G R L E L K L R S AGCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCCBamH1 Sma1 EcoR1 Nco1 Sal1 Xho1 Sac1 Hnd111(b). Pcal-P

6、elB:Nde1 actggagact catATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG GGC M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P Nco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1GCC ATG GCC aaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccc cgacgcgctggg A M A * * * * * *3. pPOW3.0 表達(dá)載體特點: 該原核表達(dá)質(zhì)粒含有噬菌體的重疊PR

7、PL熱誘導(dǎo)啟動子和編碼熱敏感抑制子的C1857基因，可使宿主細(xì)胞在合成蛋白前獲得高密度的宿主細(xì)菌，進(jìn)行高水平目的蛋白表達(dá)，并對蛋白合成提供緊密控制。PelB分泌信號肽能指引合成的外源蛋白通過胞漿膜進(jìn)入胞質(zhì)。特別提示: 在進(jìn)行重組質(zhì)粒時，最好在N-未端用Nco1或Msc1位點，C-末端則可用BamH1、EcoR1位點進(jìn)行拼接。圖示為啟動子、PelB分泌信號肽和多克隆位點區(qū)域 Xho1PRPL 啟動子ggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcctcgagtaatttaccaacactactacgttttaactgaaacaa RBS Nde1 actggagact catAT

8、G AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG M K Y L L P T A A A G L L L L A Nco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1GCC CAG GGC GCC ATG GCC aaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccc A Q P A M A * * * * * *說明: RBS 為核糖體結(jié)合位點; * 為終止密碼子 二、真核細(xì)胞表達(dá)載體1. pCMVp-NEO-BAN載體特點: 該真核細(xì)胞表達(dá)載體分子量為66

9、00堿基對，主要由CMVp啟動子、兔-球蛋白基因內(nèi)含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架構(gòu)成， 在大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)都能高水平穩(wěn)定地表達(dá)外源目的基因。更重要的是，由于該真核細(xì)胞表達(dá)載體中抗neo基因存在，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用G418篩選，可建立穩(wěn)定的、高表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。扦入外源基因的克隆位點包括Sal1、BamH1和EcoR1位點。注意在此載體中有二個EcoR1位點存在。2. pEGFP, 增強(qiáng)型絳色熒光蛋白表達(dá)載體(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特點: pEGFP表達(dá)載體中含有綠色熒光蛋白，在PCMV啟動子驅(qū)動下，在真核細(xì)胞中

10、高水平表達(dá)。載體骨架中的SV40 origin使該載體在任何表達(dá)SV40 T 抗原的真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外， 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制， 而位于此表達(dá)盒上游的細(xì)菌啟動子能驅(qū)動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達(dá)。用途: 該表達(dá)載體EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位點，將外源基因扦入這些位點，將合成外源基因和EGFP的融合基因。 借此可確定外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和/

11、或組織中的定位。亦可用于檢測克隆的啟動子活性(取代CMV啟動子,Acet1-Nhe1)。Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507圖示為啟動子分泌信號肽和多克隆位點區(qū)域： Ase1.pCMVccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFPBamH1SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白/人肌動蛋白表達(dá)載體特點: pEGFP-Actin表達(dá)載體中含有綠色熒光蛋白和人胞漿-肌動蛋白基因，在PCMV啟動子驅(qū)動下，在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)。載體骨架中的SV

12、40 origin使該載體在任何表達(dá)SV40 T 抗原的真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外， 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制， 而位于此表達(dá)盒上游的細(xì)菌啟動子能驅(qū)動kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達(dá)。用途: pEGFP-Actin載體在真核細(xì)胞表達(dá)EGFP-Actin融合蛋白，該蛋白能整合到胞內(nèi)正在生的肌動蛋白，因而在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中觀察到細(xì)胞內(nèi)含肌動蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Excitation maxi

13、mum = 488 nm; Emission maximum = 507圖示為啟動子和多克隆位點區(qū)域：pCMV.Nhe1.Age1.EGFPBgl11ActinBamH1SV40 poly A+4. pSV2表達(dá)載體特點：該表達(dá)質(zhì)粒是以病責(zé)SV40啟動子驅(qū)動在真核細(xì)胞目的基因進(jìn)行表達(dá)的，克隆位點為Hind111。SV40啟動子具有組織/細(xì)胞的選擇特異性。此載體不含neo基因，故不能用來篩選、建立穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞株。圖示為啟動子和多克隆位點區(qū)域：Pvu11pSV40.Hind111.SV40 IVS.SV40 polyA+5 CMV4 表達(dá)載體特點:該真核細(xì)胞表達(dá)載體由CMV啟動子驅(qū)動，多克隆區(qū)域

14、酶切位點選擇性較多。含有氨芐青霉素抗性基因和生長基因片段以及SV40復(fù)制原點和fl單鏈復(fù)制原點。但值得注意的是，該表達(dá)載體不含有neo基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不能用G418篩選穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞株。圖示為啟動子和多克隆位點區(qū)域：CMVpBgl11Kpn1Mlu1Cla1Hind111Xbal1Sma1GH.SV40 ori其他常用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 產(chǎn)品說明: pBluescript II kS、pUC18 & Puc19載體適合于DNA片段的克隆、DNA測序和對外源基因進(jìn)行表達(dá)等。這些載體由于在lacZ基因中含有多克隆位點，當(dāng)外源DNA片段扦入，轉(zhuǎn)化lacZ基因缺乏細(xì)胞，并在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，含有外源DNA載體的細(xì)胞將為白色菌落，而無外源