527RACE心得體會(20210320163619)

1、本文檔如對你有幫助，請幫忙下載支持! 如果您順的話，一個禮拜足矣！ 同意，5-RACE確實比較難，但也有順利的時候，我上周做5-RACE也一次就成功了， 我覺得關鍵還是 RNA的質量，如果 RNA模板質量不好，后面做得再認真也是白費！ 當時要克隆基因的5GC含量達到了 80%，般的反轉錄酶和 PCR都拿不到，后來加了 海藻糖60度反轉錄一個小時后，用 TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才擴出來，當時就 為了這個5端，很是費了力氣。 如果RCR產物不是很特異或沒有目的條帶的話，建議用nest PCR。在做5時，對RNA 要求比較高，最好用新鮮的組織提，隨即做逆轉錄，擴增。 做RACE

2、 PCR條帶單一的不多，盡可能的回收與目的片段大小相近的條帶。克隆的時 候，一般kit上建議挑8-10個克隆，多一個，多一份希望，因為RACE，尤其是5太難 了，我作了約6個月。 偶沒有買試劑盒，自己合成了 3條引物，買了反轉錄酶。然后一次就出來了。 RACE的盒子最常用的是 CLONTECH和INVITROGEN 的， 這個方法我也試過很多次了，方法很簡單，但是作出來效果非常的不理想。 PCR出來的東西都是雜七雜八的東西，更多的時候是彌散的條帶。 SmartRace既然稱之為Smart,因為它的引物能特異的識別 5端帽子位點，因此排除了 所有非完全的逆轉錄。再加上使用基因特異性引物，使其做出

3、來的可能性更大。 這個方法省錢，但是我不是很看好，祝好運。 另，建議你不要用oligodT進行逆轉錄，在基因 mRNA300bp處設計一條或幾條基因特 異性逆轉錄引物更好。 希望你能有好結果。 我剛做過5、3 RACE我個人的經(jīng)驗如下： 1、 首先，提的RNA必須完整，最好跑個 RNA電泳來驗證一下； 2、 設計引物時要注意：Tm最好大于70度，兩引物間要有100-200bp的重疊區(qū)； 3、用巢氏PCR相對容易出結果； 4、如果出現(xiàn)多個條帶，要分別驗證； 5、PCR過程中，我一般分兩次，第一次用touchdowm PCR，后產物稀釋50倍，作二次， 72度盡量長一點，我們一般用2-3min ；

4、 6、結果分析，最好是重疊區(qū)吻合，否則，應重新做。 這里有兩個原因： 1、Tm 大于 70 度，好做 touchdown PCR ； 2、相應加長引物，可以更有效地擴增，尤其是針對豐度低、比較難擴的產物。 RACE是采用PCR技術由已知的部分 cDNA順序來擴增出完整的 cDNA 3 和5 端的 方法，又被稱為單邊 PCR(one-sided PCR)和錨定 PCR(anchored PCR)。 3-RA CE的一般過程是：以oligo(dT)17和在許多文章中被稱為錨引物 (anchor primer) 或接頭(adaptor)的序列組成的引物 QT逆轉錄mRNA得到第一條cDNA鏈，然后用

5、含 部分錨引物序列的引物 Q0與基因特異性引物GSP1進行第一輪擴增得到雙鏈 cDNA , 第二輪擴增則采用內部引物(nested primer)Ql和GSP2，以防止產生非特異性擴增產物。 采用同樣的原理可以進行 5-RACE, 先用基因特異性引物 GSP-RT逆轉錄mRNA獲得cDNA第一條鏈I 然后用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)和dATP在cDNA 5 端加上poly(A)尾巴再使用 (1) QT引物合成cDNA第二條鏈； (2) Qo和一個在GSP-RT上游的引物 GSP1擴增cDNA,最后采用內部引物 Q1和GSP2 進行第二輪PCR擴增以提高特異性。 擴增后得到的雙鏈cDNA用限

6、制性內切酶酶切和 Southern雜交分析并克隆，得到 5特 異性和3特異性的cDNA文庫。從兩個有相互重疊順序的 5和3 RACE產物中可以獲 得全長cDNA，或者可以分析 5 和3 端順序，合成相應引物擴增出全長 cDNA。 目前，對于擴增基因的5端還沒有一種完美的技術，RACE也不例外，特別是5RACE對于 得到的克隆(經(jīng)檢測后為陽性克隆)，通用的做法是挑選10個以上的單克隆送去測序就我 個人經(jīng)驗，也是挑了 5個才測到我的目的基因的 建議你用clontech的smart race試劑盒,我以前用的也是TAKARA 的，結果做了 N次都 沒出來，換試劑盒后一次就做出來了 合成單鏈CDNA后

7、，用TAQ酶來合成第二條鏈，也就是相當于雙鏈 DNA中的另一條鏈， 用的是上游引物，按照堿基互補的原理，在酶的作用下完成 我剛剛做過RACE，其實當時本來買試劑盒準備建cDNA文庫的，但是庫建的不好，雜 交了好幾次都沒雜出東西來，后來用它的接頭引物和基因特異性引物擴增，最初只設計 了特異性引物的巢式引物，最初擴不出東西來，后來把接頭引物也設計了內部引物，而 且pcr時把模板的量加大，因為可能模板少也很難擴出來，我們都用該方法擴的，都出 來了，當然有時有多條帶需驗證是否單引物擴增產物。這是我做實驗的體會，祝大家早 日出結果。 SMARTTM 5 -RACE的原理是先是利用 mRNA的3末端的po

8、ly(A)尾巴作為一個引物結 合位點，以Oligo(dT) 30MN作為鎖定引物在反轉錄酶 MMLV作用下，反轉錄合成標準 第一鏈cDNA。利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到第一鏈的5末端 時自動加上3一 5個(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG) 通用接頭引物配對后，轉換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭 (figure 2 )。 然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為上游引物，用 一個基因特異引物 2(GSP 2 gen especific primer,GSP)作為下游

9、引物，以 SMART第一鏈 cDNA為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因5末端的cDNA片段擴增出來。最終，從2 個有相互重疊序列的3 / 5 -RACE產物中獲得全長cDNA，或者通過分析 RACE產物的 3和5端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA。 我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，要做好RACE反應實驗不容易，實際操作中仍存在不少困難。因此， 對RACE反應條件進行反復摸索是實驗必須要做地。這是因為：第一，在5 -RACE包含 了有3個連續(xù)的酶反應步驟(反轉錄、同聚物加尾和 PC R擴增)，每一步都可能導致失 敗;第二，擴增。DNA末端的特異性完全依賴錨定引物及擴增DNA模板樣品不均一性， 因而特異性一

10、般很低，常呈現(xiàn)不清晰的成片條帶或截短的產物背景。因此，使用RACE 技術擴增得到的特異末端片段，所獲得的重組 克隆最好能夠全部測序，以排除RACE實 驗結果中擴增產物假陽性和假陰性，最終有可能獲得新基因的全序列。我們相信， 第一鏈，同時利用它的加尾特性在合成的 cDNA鏈3加上3-4個dCTP，而且當帽子結 構存在時該酶的加尾活性最高（對全長分子的富集機制），隨后這3-4個堿基與體系中 事先加入的引物（該引物的 3端有3-4個dGTP）配對，MMLV繼而以聚合酶活性將配 對引物補成雙鏈。目前基于該技術的試劑盒只有Clontech公司生產，全名為SMART RACE cDNA amplifica

11、tion kit （ Cat634914）流程見圖： 該方法的突出優(yōu)點就是操作簡便，成功率較高，全場分子的比例較高。cDNA第一鏈的 合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中對mRNA和cDNA鏈的反復操作，降低了 mRNA降解和合成產物丟失的風險，使本來就含量甚微的全長分子得到最大保存，所以 這種方法得到了廣泛認可，應用最多。如果加上RNA提取時間，這種技術可以在 3個 小時內得到加上接頭的 cDNA產物，最大限度地降低了 mRNA的降解風險。 2、Oligo capping method方法（又稱RLM-RACE ）是由日本 東京大學鈴木等人開發(fā)，可 以更精確的定位轉錄起始位點。我們知道真核

12、生物的mRNA具有一個3尾巴和一個5 帽子結構，該技術正是利用5端的帽子特性對全長分子進行富集和擴增。降解的 mRNA5端都有一個磷酸基，用 堿性磷酸酶去掉該磷酸基，隨后用煙草酸性焦磷酸酶去 掉帽子結構，則全長分子的5端會暴露出磷酸基，隨后的連接步驟中錨定引物將特意的 加在全長分子的5端而不會和降解的分子連接（全長分子的富集機制）。目前基于該方 法的試劑盒有 TaKaRa（5-Full RACE kit D315 ）和 Ambion （Firstchoice RLM-RACE kit AM1700 ）兩家都有生產，步驟如圖： 該方法的最大優(yōu)點就是全長分子的比率高，可以說只要是擴增產物就肯定是全

13、長分子。 但是該方法的最大缺點是操作復雜，而且都是針對mRNA分子進行操作，使 mRNA分 子降解的風險極大提高，所以成功率不是很高。對于新手和實驗室條件較差者不推薦使 用該試劑盒。 3、Self-ligation技術?；蛱禺愋裕ɑ蛘?OligodT ）反轉錄合成 cDNA第一鏈，RNase H 降解雜合鏈中的RNA，連接酶連接純化后的cDNA鏈，在已知片段上設計反向 PCR引 物進行未知片段的擴增。該試劑盒寶生物以前有售，現(xiàn)在已停產，原理如圖： 該試劑盒想法十分好，但是由于沒有全長分子的富集機制，得到全長分子的幾率比較低。 而且在實際使用中它的擴增片段都比較短，不能滿足實驗要求。 4、An

14、chored PCR方法。利用一條基因特異性反轉錄引物，在反轉錄酶的作用下合成 cDNA第一鏈，將RNA-DNA雜合鏈中的RNA降解純化后，利用末端轉移酶在 cDNA 鏈的3端加入PolyC尾巴（尾巴長度不能確定），然 后利用abridged anchored primer和 一條基因特異性引物擴增（可能需要巢式PCR才能得到結果）。該試劑盒有 Clo ntech （Marathon cDNA amplification. Cat: 634913 ）和 Invitrogen （5 RACEsystem for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 183

15、74-058 ）公司在售，操作簡圖如下： 該法最大的缺點是全長分子的比率較低，而且操作復雜，整個實驗流程需要耗費超過一 天的時間。這種方法沒有像 SMART和Oligo capping method中那樣采取對完整分子的 富集機制，所以它依賴于高質量的反轉錄酶（具有通讀復雜二級結構的能力、具有較高 的反應溫度）和高質量的 RNA，否則得到全長分子的幾率會很低。 你這個就是利用的invitrogen的5 RACE式劑盒的原理啊。自己只需要買TdT和 dCTP就行了，既方便又省錢，我們實驗室就是這樣做的。RT產物的純化只需要用普通 的膠回收試劑盒就行了，我們實驗室用的是Omega的。至于第二點的話

16、當然可行啊， 你有什么顧慮呢？ 呵呵，300bp應該不難。 建議你，做每一步時都有個證明每個步驟是否出錯得對照。 模版的質量應該要高。 我做了一次，每次溫度都有條帶，也包括我要的大小的這不回收了，準備節(jié)后測序呢。 有人告訴我，第一輪的溫度只要是軟件建議的溫度就可以了，第二輪則比你一輪高3-5 度，然后多5-10個循環(huán)就可以了。 我覺得做race關鍵就是提rna，只要這部沒有問題， 其他的都好說了。 恭喜sosO, 5做完了，3就容易多了。 我們實驗室根據(jù)Invitrogen的5 RACE原理，自己買試劑，也能做出5 RACE也就是 做個錨定PCR。 模板RNA的質量非常重要。略有不好，5 -R

17、ACE就很難出結果；3容易一些 RACE在我們實驗室也做了一些，目前擴了 8個FL,還算有點經(jīng)驗和教訓. TAKARA和INVTROGEN的都試過，感覺INVITRO的好些，但是都做出來了 首先,我認為mRNA質量很關鍵，但是最重要的你的目標基因的豐度 ，如果豐度夠高，還是 比較容易做的，所以一般來說我們在做 RACE之前都會做個TISSUE DISTRIBUSION. 其次,5-RACE的關鍵是出帶，帶出來了，一般情況都是特異性的，不需要過多的驗 證3-RACE不一樣，需要一對存在于已知片斷里面的保守引物做驗證和篩選,這可以節(jié)省 很多的時間和金錢千萬不要試圖用 AUAP這種通用引物做驗證和篩

18、選，成功率很低 最后說說試劑的選擇吧,TAKARA用的是試劑盒，感覺比較便宜，但是成功幾率較小（做3 次才成功）不過它配的RT-PCR酶比較好,是AMV.而INVITRO的感覺沒必要買他的試 劑盒，因為價格貴，而且里面大多數(shù)東西都用不到.INVITRO的我是單獨買的 tdt,SUPERSCRIPT III,以及AAP,其余的用其他公司的代替，引物直接合成（如AUAP）.這樣 成本會大大下降不過記住，在做5-RACE的時候，產物純化試劑盒一定用進口的，國產的 效率太低，而且DTT似乎去不干凈這兩個試劑盒的PROTOCOL條件似乎都不怎么好（不 知道是不是在我們實驗室水土不服 ）,需要自己摸索條件

19、，特別是在MG濃度和TM上面， 我們一般都是用 GRADIENT.PCR的酶一般的就可以，我們都是用國產的 我也做RACE呢,也是沒有出來，我覺得引物最重要，侃侃你的引物合適么？還有cDNA, 作個內參；dNTP不能反復凍溶；最好分裝,等液體完全融化后在加樣品! 簡要整理了一些基本的東西，希望有用。 RACE （ cDNA 末端快速擴增， Rapid Ampliphication of cDNA Ends ）是一種獲得轉錄本 5或3未知序列的方法。不象普通 RT-PCR那樣使用兩個序列特異性的引物，RACE使 用一個序列特異性的引物和或者mRNA的poly（A）尾（3 RACE ）或者加到cD

20、NA末端 的多聚同聚體（5RACE ）。RACE的產物可以用來克隆，直接測序，制備探針或連接 在一起得到全長cDNA。其中一個連接5和3 RACE產物的方法是使用由5及3 RACE 得到的序列信息設計新的引物，以擴增全長的cDNA。使用RNaseH-的逆轉錄酶和高保 真的熱穩(wěn)定聚合酶可以對較長的序列進行高保真的擴增，從而得到全長cDNA克隆。 RACE已經(jīng)被用于擴增和克隆稀有 mRNA。 5 RACE步驟概要： 第一鏈引物，GSP1，同mRNA退火 使用 Superscripts將 mRNA 轉錄成 cDNA 使用RNase混合物降解RNA 純化cDNA (可以使用試劑盒) 使用dCTP和Td

21、T對純化的cDNA加尾 使用簡并的錨定引物和巢式 GSP2 PCR擴增帶有dC尾的cDNA 使用巢式GSP重新擴增初步PCR產物。 5 RACE的產物可能是單一產物、多個產物，甚至是不能分辨的連續(xù)條帶。結果的質量 取決于用來合成第一鏈和擴增的 GSP的特異性、擴增所使用錨定引物的特異性、目的 mRNA的復雜度和豐度及產物的長度。使用巢式引物擴增(最多可以三輪巢式擴增)， 并在連續(xù)幾輪擴增中使用長度選擇性的擴增產物作為模板可以增加5 RACE的特異性。 增加逆轉錄保溫溫度和 PCR退火溫度，并降低擴增反應中的鎂離子濃度可以促進特異 性。 5 RACE的靈敏度受所使用的逆轉錄酶和cDNA 3末端抑

22、制cDNA加尾的二級結構影 響。cDNA的不完全合成降低了全長產物的產量，并導致某些模板產生連續(xù)條帶。因為 Superscripts產生更多的全長cDNA，所以可以提高5末端序列檢測的水平， 尤其是對 于小于1kb的轉錄本。雙鏈3末端和發(fā)卡結構會通過減少用于加尾的3羥基而破壞 cDNA的加尾。cDNA的起始保溫溫度在94 C并隨后在冰上冷卻有助于破壞二級結構。 一些困難模板可能需要加入 DMSO輔助加尾。加尾酶末端脫氧核苷轉移酶可以耐受最 多 20%的 DMSO。 各位GGJJ: 我初次做RACE,我老板資金有限我沒有用試劑盒用的自己的方法 第一次P用的降落PCR,出來的條帶呈彌散狀我用這個產

23、物做巢式 PCR,結果沒有條帶. 怎么辦呢？是不是引物不行？望各位大蝦賜教啊！ 我用的方法是(1)用oligo dT得到cDNA，用的寶生物的試劑盒； (2) 純化cDNA，用的申能博采的 PCR純化試劑盒； (3) 用TdT (末端脫氧核糖核酸轉移酶)將 cDNA的3末端加上dCTP; (4) 以3末端加上dCTP的cDNA為模板進行第一輪 PCR,上游引物使用從 5至 3依次為含有酶切位點的通用引物序列+ 10個dG,比如 5- GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGG GGG GGG -3下游弓I物使用基因特異的弓I物； (5) 為提高特異性，第一輪PCR使用含有多

24、個dG的通用引物和比較靠近基因 3末 端的特異引物，第二輪PCR以第一次PCR產物為模板，引物則使用含有多個 dG的 通用引物和比較靠近基因 5末端的特異引物； (6) PCR產物電泳，回收，連接相應載體 1首先考慮你RACE基因的大小，1.5kb左右的片段按照這個方法作出來的可能性比較 大，超過1.5kb就不太容易了。 2 cDNA的純化建議使用寶生物的核酸共沉劑，用PCR純化試劑盒回收cDNA效率應該 不會太好。 3 PCR酶的選用和引物設計也很重要， 你選用的5- GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGG GGG GGG -3在5端存在二級結構，開鍵的自由 能較大，

25、建議該為 5-CGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG -3 4 RT-PCR的模版含量可能過高，建議稀釋十倍后使用。有很多時候采用濃度低的 CDNA 反而刻意達到較為滿意的試驗結果。 1、想知道你的已知片斷是多大的，要是很大，設計反轉錄引物的時候應該考慮從已知 cDNA序列片斷中靠近5端設計特異性引物，控制已知部分反轉錄產物500bp-600bp。 當然，如果你的未知片斷很大，還要適當縮小已知片斷。 特異性反轉錄可以去掉好多干擾。 2、不買試劑盒，也可以按照試劑盒的方法去做，考慮環(huán)化，比加尾效率要高。 3、模板量要稀釋。 5RACE最重要的是RNA沒有問題。然后再做后來的工作，不知

26、道你用的是什么樣的試 劑盒，我覺得逆轉錄酶很重要，我嘗試了用各種方法，包括你的末端加尾的方法都沒有 成功，可能這種方法真的得不償失。后來用了 cion etech的逆轉錄酶和它的寡核苷酸鏈， 很快就做出來了，其他的引物自己設計就可以了。 經(jīng)驗：1?？俁NA質量要高，先電泳看28s18s, 28s亮度應該是18s的2倍。 2。 總RNA的量可遠大與其要求的上限5ug，但要相應延長酶反應時間。 3。 pcr條件要自己摸，gsp的量可參考其要求的量，但其要求的dNTP量似乎偏大，自 己要摸一下的dNTP量。 4。一定要用高保真酶taq酶。 附上我的race pcr電泳圖。 第一你的這段序列是來在實際

27、測序還是從預測序列得到的？ 如果是從網(wǎng)上下載的，那你就要注意這里面就有不可信了。我作5race，根據(jù)預測序列 設計的引物就有問題 如果是你實際測的序列， 那么你就要考慮引物設計的因素了。不知道你用的是那個公司 的試劑盒。我是參照 bd公司的smart race kit manual做的。我作race的時間也不長，只 能把我的感受到的有限的經(jīng)驗教訓告訴你，不對之處請大家指正。 1引物設計要遵循一般引物設計的原則。盡量避免發(fā)夾結構（實在避免不料了要選取發(fā) 夾形成堿基不超過5個的）。瞅了一下你的引物，我認為引物的5盡量以g/c開頭，但 是按照分子克隆上說，5最前端不要連著出現(xiàn)gc，這樣結合特異性會降

28、低。 2,我采用的是bd公司的策略，他要求設計的引 物Tm最好大于65度。后來在實驗中 證明這一點還是有道理也比較關鍵的。因為按照試劑盒說明書，它作5race時3gsp是和 上游的通用引物配對的，通用引物中有一種長引物，tm很高，也很長，這就要求特異 引物tm高一點。 3 5race確實存在難度，加之race技術本來有說不清的東西。你沒有作出來未必是因為 引物的問題。如果你普通的pcr沒有結果，可以試試touchdown pcr但是實際上我倒 覺得touchdown不好作，我拿普通的 per作出來了，touchdown條件一直掌握不好，易 出現(xiàn)彌散 4, 建議你設計引物不要設計一條，最好設計幾

29、條，尤其是針對5race你可以設計幾條有 一定間隔、但是距離不很遠的引物。好處在于，a）萬一拿一條作不出來可以試試其他 的，節(jié)省時間；b）可以拿最下游的引物與 5通用引物配對先擴，如果擴出來得效果不 好，可以拿這一輪pcr產物作模板，以該3gsp稍微上游一點的引物再和通用引物配對擴 增更多的情況是，race很容易出現(xiàn)非特異性帶，拿這種類似與巢式pcr的策略可以 減少非特異帶，或者判斷條代 5最后建議你5race時，3 gs接近5端為好，但是我?guī)熜纸ㄗh我擴增條代短一點擴增的 效率和幾率要大一些。 好的引物所具有的令人滿意的特點： *典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并

30、降低序列存在 于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。 較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降 低了產量。 *選擇GC含量為40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。 *設計5端和中間區(qū)為 G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交 的穩(wěn)定性。 *避免引物對3末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。 *避免3末端富含GC。設計引物時保證在最后 5個核苷中含有3個A或T。 *避免3末端的錯誤配對。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 *避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。 5 Rac是很難做呀。你這種情況我覺得是特異引物不特異。我的建議是先按照一般pcr 的優(yōu)化方式