2.2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)(高中生物選修一教案系列)

1、課題2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一、課題目標研究培養(yǎng)基對微生物的選擇作用，進行微生物數(shù)量的測定。二、課題重點與難點課題重點：對土樣的選取和選擇培養(yǎng)基的配制。課題難點：對分解尿素的細菌的計數(shù)。學生活動教師組織與引導教學意圖引導學生閱讀教材p21-22引導學生閱讀教材p22教師安排學生討論。引導學生閱讀教材p22（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目引導學生觀察教材p23圖2-7樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)流程示意圖引導學生閱讀教材p25操作提示通過上一節(jié)課的學習，我們知道，微生物和我們人類的關系非常緊密。目前，微生物在工業(yè)、農業(yè)、環(huán)境保護和醫(yī)療衛(wèi)生方面有廣泛的應用。我們也知道研究微生物最基本的方法是對微生物

2、進行培養(yǎng)、分離和計數(shù)。在上一個課題中，我們已經學習了微生物培養(yǎng)的原理和方法。在本節(jié)課中，我們將繼續(xù)學習微生物的分離和計數(shù)。但是，微生物種類有很多，我們選擇哪一種微生物來分離和計數(shù)呢？-引導學生閱讀p21請看：co(nh2)2這是大家都知道的一種物質：尿素。今天，我們就學習一下從土壤中分離尿素細菌，并且計算1g土壤中尿素細菌到底含有多少個？并以它為載體來學習微生物的分離和計數(shù)的原理和方法。這就是我們今天學習的課題2的學習目標(板書展示)一、 尿素細菌的分離；二、尿素細菌的計數(shù)。師：要完成尿素細菌的分離，我們需要配制一個培養(yǎng)基。在上一課中我們學習了一個培養(yǎng)基的配制，叫什么培養(yǎng)基？生答：牛肉膏蛋白胨

3、固體培養(yǎng)基。師：我們選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，能夠從土壤中分離出尿素細菌嗎？生答：不能。師：為什么呢？生答：略師總結：因為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上不僅有尿素細菌的生長，還有其他的微生物的生長，所以不可能分離出尿素細菌。（補充：含有多種微生物都能生長的培養(yǎng)基稱為普通培養(yǎng)基）。師：我們怎樣才能從土壤中分離出尿素細菌呢？生答:需要配制一種選擇性培養(yǎng)基:只有尿素細菌能夠在上面生長，而土壤中其他微生物是不能生長的。師：根據(jù)剛才的分析，你能給選擇性培養(yǎng)基下一個定義嗎？生答：選擇性培養(yǎng)基是指在微生物學中，允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。師展示(或引導學生閱讀教材p22(二)統(tǒng)計

4、菌落數(shù)目一面一小段并學生閱讀明確定義)：討論1：培養(yǎng)基配方一： 培養(yǎng)基配方二： 培養(yǎng)基配方三：kh2po3 3g kh2po3 3g na2hpo3 1.4g na2hpo3 1.4g mgso47h2o 3g mgso47h2o 0.2gnano3 2g nano3 2g 尿素 1.0gmgso47h2o 3g 葡萄糖 10.0g na2hpo3 2.1g葡萄糖 10.0g 尿素 3.0g 葡萄糖 10.0g瓊脂 15.0g 瓊脂 15.0g 瓊脂 15.0g分別加蒸餾水定容至于1000ml。 師：你認為，以上三個培養(yǎng)基配方中，哪個可以分離出尿離細菌？哪些不能分離出尿素細菌？原因是什么？生分

5、析配方一：任何細菌都能在上面生長。因為培養(yǎng)基配方中既提供了c源，又提供了n源，還有無機鹽和水。生分析配方二：不可以。因為尿素細菌利用的唯一n源是尿素，而該培養(yǎng)基配方中有nano3存在，也提供了n源。其他以no3-作n源的微生物也能生長。生分析配方三：不可以。因為尿素細菌可以把尿素分解成氨。而固n細菌又能利用空氣中的n，我認為固n細菌也能在上面生長。因此，也分離不出尿素細菌。師：我們說，每種微生物的生長，都有特定的條件，需要特定的一些營養(yǎng)物質。我們配制的培養(yǎng)基也可能有利于固n微生物的生長，也可能不能。但它只要有尿素提供n源，肯定能保證尿素細菌生長。這涉及選擇性培養(yǎng)基的有沒有選擇性的問題。（為了降

6、低難度，固n菌問題可不作分析，整個實驗過程中固n菌都無法排除）引入-引言：剛才，有的同學懷疑它沒有選擇性，不能選擇出尿素細菌，還有其他的微生物。那你怎樣設計一個簡單的對照實驗來證明呢？討論2：怎樣設計一個簡單的對照實驗證明配制的選擇性培養(yǎng)基具有選擇性？生答：將第三個培養(yǎng)基配方中的尿素去掉，其他的營養(yǎng)成分都保持不變，看一看，沒有尿素的培養(yǎng)基有沒有雜菌生長。如果有的話，證明第三個培養(yǎng)基中也會有雜菌生長。師分析：根據(jù)同學的回答，對選擇性培養(yǎng)基設置對照：一個涂布土壤溶液，一個不涂布土壤溶液說明培養(yǎng)基是否被污染。僅僅設計這樣一組對照，能體現(xiàn)出選擇性培養(yǎng)基上生長的就是尿素細菌嗎？我懷疑涂布土壤溶液的培養(yǎng)基

7、上長出的菌是土壤中所有的微生物。你說，是嗎？生：應該做一個普通培養(yǎng)基作對照，能夠滿足多數(shù)微生物的生長(如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)。師總結：如果對照組是一個普通培養(yǎng)基，相對于選擇性培養(yǎng)基，微生物的數(shù)量呢？(答：多)種類呢？(答：多)師：這樣，數(shù)量多，種類多，而選擇性培養(yǎng)基可能只有尿素細菌的生長。引言：通過這樣一組實驗，可以簡單地證明分離出的就是尿素細菌。但今天我們的課題不僅僅從土壤中分離出尿素細菌，還要統(tǒng)計1g土壤中到底含有多少尿素細菌？師：在營養(yǎng)物質充足、環(huán)境適宜的條件下，一個細菌經過生長繁殖形成一個菌落。換句話說，一個菌落對應著一個活菌，菌落數(shù)反應了活菌的數(shù)量。所以我們可通過統(tǒng)計菌落的數(shù)目獲取平

8、板上尿素細菌的數(shù)量。在前面課題中，我們學習了稀釋涂布平板法。對土壤樣品進行稀釋的目的是什么呢？生答：平板上菌落密度太大、很難計數(shù)。師總結：就是說：獲得在平板上的菌落數(shù)在30300之間，便于統(tǒng)計。如果低于30個，存在的誤差較大，因為平板上只要有一個菌落的誤差，那么考慮土壤樣品稀釋倍數(shù)，實際的微生物種群數(shù)量的誤差將會非常大）；如果高于300個，統(tǒng)計起來比較困難，存在的誤差也較大。師：如果要分離土壤中的微生物，為了便于統(tǒng)計，又減少誤差，一些研究者對土壤的稀釋倍數(shù)做了研究，結果如表格所示（微生物統(tǒng)計時土壤稀釋倍數(shù)）：微生物的種類土壤稀釋倍數(shù)目的分離土壤中所有細菌104105106平板上的菌落數(shù)應為30

9、-300個，便于準確計數(shù)。（學生完成）分離土壤中的放線菌103104105分離土壤中的真菌102103104分離土壤中的尿細菌104105106107師：為什么，針對不同的微生物稀釋的倍數(shù)不一樣呢？針對同一微生物做微生物計數(shù)時，土壤的稀釋倍數(shù)也不一樣呢？生答：在土壤中微生物的種群密度不一樣；不同的地方，環(huán)境不同，同一微生物的數(shù)量也存在差異。（師：研究表明：1g表層干土壤中的細菌的數(shù)量是2000多萬，放線菌的數(shù)量是500萬左右；霉菌的數(shù)量約是20萬左右。）師：尿素細菌的數(shù)量肯定比所有細菌的數(shù)量要少，稀釋倍數(shù)是104-107師：對土壤進行稀釋，我們應該怎么做呢？（觀察圖2-7，試用自己的話說出稀釋

10、的流程）生答：首先，取1g土樣，將土樣倒入試管中，加9ml無菌水，振蕩，就可得到稀釋101倍的稀釋液。然后從1號試管中移取1ml土壤稀釋液，倒入2號試管，依次類推。我們可以得到101、102、103、104、105、106的稀釋液師：經過稀釋，我們得到了不同濃度的土壤稀釋溶液，就可涂布接種了。是不是某一濃度的土壤稀釋液只要涂布一個平板，培養(yǎng)后統(tǒng)計的菌落數(shù)就可作為計算1g土壤樣品中尿素細菌的依據(jù)呢？為什么？（生答：我認為，每一個稀釋倍數(shù)應涂布2-3個。如果只涂布一個培養(yǎng)基，容易產生誤差。）師：每一個稀釋倍數(shù)下的土壤溶液應涂布3-5個，例如我們選擇了稀釋了104倍的土壤溶液進行涂布接種時涂布3-5

11、個。將這三個平板上的尿素細菌的菌落數(shù)進行統(tǒng)計并計算其平均值，就是計算樣品中所含尿素細菌數(shù)目的依據(jù)。這一設計遵循了實驗設計的什么原則呢？生答：平行重復實驗。師：四位同學針對不同的土壤稀釋度進行涂布接種。以下數(shù)據(jù)為各平板上菌落數(shù)，分析涂布情況，計算其平均值。平板1平板2平板3平板值平板1平板2平板3平板值24225031020286198統(tǒng)計一統(tǒng)計二平板1平板2平板3平板值平板1平板2平板3平板值2132251029 8120統(tǒng)計三統(tǒng)計四平板一分析：生答：應舍去平板3，平板1和2相加除以2即可。因為第3組超過了統(tǒng)計允許的最大值。師：獲得在平板上的菌落數(shù)在30300之間，便于統(tǒng)計。平板2分析：生答：

12、應舍去平板2。因為平板2和其他兩個相差太大。師：肯定。平板3分析：生甲答：三組相加除以3即可，因為它們都相差不大。生乙答：不可以，因為統(tǒng)計數(shù)應在30-300之間，而平板1和3超過了這一范圍，誤差較大。師：只有平板2介于30-300之間，是否說明菌落的平均數(shù)就是32呢？這一數(shù)值說明了什么？生答：不能。造成這一結果的原因是稀釋度太大，誤差很大。師：怎樣才能得到準確的菌落呢？生答；降低稀釋倍數(shù)。師:觀察時記錄(出示記錄表格，課下完成記錄) 培養(yǎng)基類型日期平板細菌數(shù)(土壤稀釋度： )選擇性培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布接種未涂布接種第一天第二天計算公式p22旁欄知識拓展：師：試計算：在稀釋106倍的條件

13、下，三個平板培養(yǎng)基上的菌落數(shù)平均是2.54個。（生答:2.54109個）師：請大家預測一下，第一天和第二天的菌落比較有何區(qū)別？生答：第一天的菌落比較?。坏诙斓木浔容^大。師：有同學在做實驗時發(fā)現(xiàn)：普通培養(yǎng)基上菌落幾乎長滿了；選擇培養(yǎng)基上菌落較少；空白對照培養(yǎng)基未出現(xiàn)菌落，這一結果說明了什么？生答：實驗是成功的，菌落應該是尿素細菌生長繁殖的結果。師：有同學在做實驗時發(fā)現(xiàn)：在普通培養(yǎng)基上，菌落數(shù)少于選擇性培養(yǎng)基。試分析其中原因。生答：略。師總結：普通培養(yǎng)基在涂布時，涂布器溫度太高，殺死了大量的菌種。師：普通培養(yǎng)基上菌落比選擇性培養(yǎng)基上的大的多。為什么？生答：略師總結：涂布時沒有將微生物分開，涂布

14、不均勻。師：我在觀察選擇培養(yǎng)基上的尿素細菌的菌落時，發(fā)現(xiàn)有大有小，統(tǒng)計時，是否只統(tǒng)計大的，還是只統(tǒng)計小的，或大小都統(tǒng)計呢？生答：略師總結：大小都統(tǒng)計，因為分解尿素的細菌可能不只一種。師：在操作的時候，應該注意哪些問題呢？-引導學生閱讀教材p25操作提示師總結：1、稀釋土樣時，應注意將裝有稀釋液的試管及時編號，用棉塞塞好試管口，同時注意不同讓土壤稀釋液沾上棉塞2、涂布時應在火焰旁邊進行，還要完全打開培養(yǎng)皿蓋，用滴管滴兩滴土壤稀釋液(0.1ml)在培養(yǎng)基上，再進行涂布，要特別注意涂布均勻。3、涂布完成后，用記號筆在培養(yǎng)皿蓋上寫上培養(yǎng)基的類型、土壤稀釋倍數(shù)，涂布接種的時間和涂布接種人等。并將所有的平

15、板放在32的恒溫箱中培養(yǎng)。師：接種時為何要在火焰旁邊進行呢？生答：防止雜菌污染。師：涂布不均勻會出現(xiàn)什么情況？生答：出現(xiàn)菌落不均勻，難于統(tǒng)計。由于條件所限，我們不能到實驗室親自體驗生物技術實踐這門課操作的規(guī)范性、技術的含量及注意事項等。這個實驗操作時同學易出現(xiàn)的問題總結起來有以下幾點：涂布時，一些同學將培養(yǎng)皿蓋打的太開，造成空氣中的微生物進入培養(yǎng)皿，污染培養(yǎng)基；在涂布過程中，用力太大，將培養(yǎng)基弄破；有些同學涂布不均勻，微生物長到一起，不便于統(tǒng)計。分組實驗結果展示：甲組乙組平板1平板2平板3平均值平板1平板2平板3平均值138613251570493454542師：在稀釋度相同的情況下甲、乙兩同

16、學得到了相差很大的兩組實驗結果.就這一實驗結果來看，他們甲、乙兩組同學共同出現(xiàn)的問題是什么？ 學生分析：稀釋濃度太低，造成單位面積上尿素細菌數(shù)量太高。師：這告訴我們，下一次再做實驗的時候，應把稀釋倍數(shù)再提高一些。師：這兩組稀釋倍數(shù)是一樣的，為什么會出現(xiàn)這么大的誤差。生答：涂布器可能溫度太高，殺死了一部分微生物；吸取提取液時，振蕩不均勻。師總結：取的土樣不一樣，微生物的數(shù)目不一樣；稀釋土樣時，稀釋的程度不均勻也會出現(xiàn)偏差；涂布器可能溫度太高，殺死了一部分微生物；計數(shù)也是很關鍵的環(huán)節(jié)。師：甲組(稀釋104生答：2.5108)、乙組 (稀釋105生答：1.54109)烷丙組：(稀釋106倍生答：2.

17、23109)師：稀釋倍數(shù)不同，平板上尿素細菌的數(shù)目不同，隨著稀釋倍數(shù)的加大，平板上尿素細菌的數(shù)目多了一些，是什么原因造成這一結果呢？生答：統(tǒng)計時有誤差。師總結：稀釋倍數(shù)低的培養(yǎng)基上菌落有些菌落大很多，稀釋倍數(shù)低的培養(yǎng)基上菌落小一些，統(tǒng)計時菌落大的作為一個來統(tǒng)計，菌落小的也作為一個來統(tǒng)計，而菌落大的很可能是多個細菌生長繁殖的結果，于是稀釋倍數(shù)小的就出現(xiàn)了較大的誤差。師總結：統(tǒng)計可見，1g土壤尿素細菌的數(shù)量還是很多的。1g土壤中不僅僅只有尿素細菌，還有其他的微生物。所以說，土壤中的微生物是非常豐富的?，F(xiàn)在，我們一定確信這個平板上長出的細菌就是尿素細菌嗎？我們還需要通過后緒的工作來鑒定它？例如：我們

18、可以觀察這個菌落的形態(tài)，這個菌落的顏色。是否與尿素細菌的顏色、形態(tài)是一樣的；也可以通過化學的方法來鑒定它：尿素細菌的代謝產物是氨。而氨溶解在水中呈堿性。于是，我們可以將酚紅滴在菌落上，過一會兒，觀察它的顏色。如果培養(yǎng)基出現(xiàn)顏色是紅色的，我們可以氨的產生確認細菌是尿素細菌。如果沒有紅色，說明不是尿素細菌。思考：我們將課題完成了，在課題目標中，我們以尿素細菌為載體，學習微生物的分離和計數(shù)的原理和方法。這個課題的工作流程包括哪些具體的環(huán)節(jié)呢（或實驗設計的流程是什么）？答：根據(jù)微生物的特性配制選擇性培養(yǎng)基，取土樣，稀釋土樣，涂布接種，觀察計數(shù)，計算鑒定。師：應用這個原理和方法，我們能不能從土壤中分離出

19、其他的微生物？生答：分離出硝化細菌。生答：分離的是具有特殊性質的，在某一培養(yǎng)基只有它能生長，而其他微生物受抑制的微生物。師總結：除了細菌，還可以分離出其他的微生物嗎？如真菌，放線菌。總之，土壤中有什么微生物，我們都可以根據(jù)它的特殊的性質，配制選擇性培養(yǎng)基就可以把它分離出來。通過今天的學習：我們不僅僅滿足于分離出尿素細菌，而是學習了一種方法。這種方法可以使我們從土壤中分離出很多很多我們需要的微生物。僅僅從土壤中分離出微生物是不夠的。我們生活中有很多地方都會用到這種方法。隨堂練習：大家最愛吃的冰激凌，某個商店的冰激凌，大家懷疑它大腸桿菌的數(shù)量超標了。運用今天你學習的這種原理和方法，你怎樣拿到證據(jù)說明它確實超標了呢？(說出工作流程即可)生答：買一盒冰激凌，取出少量，稱出質量，溶化，濃度稀釋，在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后用伊紅-美藍染色，觀