眼科學(xué)基礎(chǔ)：分子克隆技術(shù)

1、分子克隆技術(shù) Molecular Cloning 遺傳學(xué)發(fā)展史 重組DNA技術(shù)的發(fā)展史 19世紀(jì)中葉，達(dá)爾文創(chuàng)立了以自然選擇為核心的進(jìn)化論： 他認(rèn)為，生物之間存在著生存爭斗，適應(yīng)者生他認(rèn)為，生物之間存在著生存爭斗，適應(yīng)者生 存下來，不適者則被淘汰，這就是自然的選擇。生存下來，不適者則被淘汰，這就是自然的選擇。生 物正是通過遺傳、變異和自然選擇，從低級到高級，物正是通過遺傳、變異和自然選擇，從低級到高級， 從簡單到復(fù)雜，種類由少到多地進(jìn)化著、發(fā)展著。從簡單到復(fù)雜，種類由少到多地進(jìn)化著、發(fā)展著。 以上三點，就是我們常聽到的以上三點，就是我們常聽到的“物競天擇，適者物競天擇，適者 生存生存”，現(xiàn)在基

2、因?qū)W誕生之際，為此提供了重要的，現(xiàn)在基因?qū)W誕生之際，為此提供了重要的 證據(jù)，事實上，物競天擇，競的是證據(jù)，事實上，物競天擇，競的是“基因基因”。 遺傳學(xué)的奠基人 -現(xiàn)代遺傳學(xué)之父孟德爾現(xiàn)代遺傳學(xué)之父孟德爾 1865年，發(fā)現(xiàn)遺傳定律。年，發(fā)現(xiàn)遺傳定律。 1866年，年，植物雜交試驗植物雜交試驗正式發(fā)表。正式發(fā)表。 1881年，該論文列進(jìn)了德國學(xué)者編了一本植物學(xué)雜交論文的目錄。年，該論文列進(jìn)了德國學(xué)者編了一本植物學(xué)雜交論文的目錄。 1900年，被年，被3個國家個國家3位學(xué)者同時發(fā)現(xiàn)。位學(xué)者同時發(fā)現(xiàn)。 從此，應(yīng)驗了孟德爾去世之前曾經(jīng)之說從此，應(yīng)驗了孟德爾去世之前曾經(jīng)之說-“我的時代來臨我的時代來臨”

3、 荷蘭的德荷蘭的德.弗里斯弗里斯 澳大利亞的契馬克澳大利亞的契馬克 德國的柯倫斯德國的柯倫斯 1822-1884 遺傳信息的傳遞規(guī)律和物質(zhì)基礎(chǔ)遺傳信息的傳遞規(guī)律和物質(zhì)基礎(chǔ) 孟德爾的功績：孟德爾的功績： 采用32個品種 觀察了7對性 狀 經(jīng)8年研究，發(fā) 現(xiàn)了2個定律: 獨立分配和自 由組合定律， 創(chuàng)立了“ 遺傳 學(xué) ” 。 孟德爾定律（孟德爾定律（MendelMendels lawss laws） 對一對性狀的觀察得出的對一對性狀的觀察得出的 三條規(guī)律：三條規(guī)律： 1）F1代的性狀一致，通常 和一個親 本相同。得以表現(xiàn)的性 狀為顯性， 未能表現(xiàn)的性狀稱隱性。 2）在雜種F2代中，初始親 代的二種

4、 性狀（顯性和隱性）都 能得到表達(dá)； 3）這兩性狀的比例總為 3： 1。 1906年，英國遺傳學(xué)家貝特森貝特森創(chuàng)立的Genetics，這個詞的整個含 意就是研究“出生與祖先關(guān)系的科學(xué)” 。 貝特森把決定相對性狀的孟德爾式的遺傳因子簡化成現(xiàn)在通用的“等位基因 (allele)”， 創(chuàng)造了“純合子(homozygote)”、“雜合子(heterozygote)”以及“上位基因(epistatic gene)”等遺傳學(xué)術(shù)語。 The term genetics is used for the first time “遺傳學(xué)遺傳學(xué)”名稱的由來名稱的由來 1909年，年，丹麥生物學(xué)家丹麥生物學(xué)家約翰遜根

5、據(jù)希臘文根據(jù)希臘文 “給予生命給予生命”之義，創(chuàng)造了基因（之義，創(chuàng)造了基因（gene） 一詞，提出了基因型（一詞，提出了基因型（genotype）和表現(xiàn)和表現(xiàn) 型型 （phenotype）的概念。的概念。 1910年 摩爾根（摩爾根（Morgan ）及其）及其3個學(xué)生個學(xué)生 斯特蒂文特（斯特蒂文特（Sturtevant）、布里）、布里 吉斯（吉斯（Bridges）、）、 繆勒（繆勒（Muller） 創(chuàng)立了創(chuàng)立了連鎖定律（遺傳學(xué)第三大定律）遺傳學(xué)第三大定律） 1915年 共同出版的遺傳學(xué)經(jīng)典名著共同出版的遺傳學(xué)經(jīng)典名著孟德爾遺傳學(xué)原理孟德爾遺傳學(xué)原理，確定了，確定了基因基因是染色體是染色體 上的

6、分散單位。上的分散單位。 1933年年 摩爾根被授予諾貝爾獎摩爾根被授予諾貝爾獎 ，1934年領(lǐng)獎，獎金分給了自己、斯特蒂文特年領(lǐng)獎，獎金分給了自己、斯特蒂文特 和布里吉斯三家的孩子和布里吉斯三家的孩子 摩爾根與其果蠅實驗室摩爾根與其果蠅實驗室 繆勒（Muller） 1927年證明X光可以誘導(dǎo)基 因突變，其作用與X射線的劑 量相關(guān)。 1946年獲得了諾貝爾獎。 基因基因是一個抽象的遺傳因子，既是功能單位，又是重組單位和突變單位。是一個抽象的遺傳因子，既是功能單位，又是重組單位和突變單位。 Avery 艾佛瑞 McLeod 麥克賴歐德 McCarty 麥克卡提 1944年，Avery等提出DNA

7、是最基本的遺傳物 質(zhì) 1952年，Herskey用T2噬菌體證明了噬 菌體的遺傳物質(zhì)是DNA， 1969 赫爾希由此獲得諾貝爾獎。 伴隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)孕育而生 （1900-1952，孕育階段） Hershey 赫爾希 1953年，年， Watson和和 Crick建立建立DNA雙螺旋模型，雙螺旋模型， 1962年年，獲得了諾貝爾獎。，獲得了諾貝爾獎。 開啟了分子生物學(xué)時代，使遺傳的研究深入到分子層次，開啟了分子生物學(xué)時代，使遺傳的研究深入到分子層次，“生命之謎生命之謎”被打開，人們被打開，人們 清楚地了解遺傳信息的構(gòu)成和傳遞的途徑。清楚地了解遺傳信息的構(gòu)成和傳遞的途徑。 Watso

8、n Crick 生命的奧秘蘊藏于生命的奧秘蘊藏于 “四字天書四字天書”之之 中中 Secrets in the Secrets in the “4 Letter Book4 Letter Book” of Life of Life GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT Life is se

9、quence -coded! 1958年，Crick中心法則 分子生物學(xué)時代 DNARNA Protein Transcriptio n Translation Reverse Transcriptio n Replication Figure 4-6 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) 1958年，Meselson 和Stahl DNA半保留復(fù)制。 1961年，Jacob 和Monod操縱子學(xué)說 1961年，Nirenberg破譯第一個遺傳密碼 1962年1968 Arber， 1978年 Smith 發(fā)現(xiàn)限制 性酶 1

10、966年遺傳密碼破譯：61種編碼用于決定20 種氨基酸，另外3種則用來作為蛋白質(zhì)合成 的終止信號。 1972年， Berg建立重組技術(shù)（1980獲得諾獎） 1975年，Temin發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶 分子生物學(xué)時代 Paul Berg 1977年，Sanger & Gilbert 建立測序方法 1977年，Sharp 和 Roberts 發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子 1981年，Cech和Altman 發(fā)現(xiàn)核酶 1985年，Mullis建立了PCRPCR體外擴增技術(shù)體外擴增技術(shù) 此期基因的概念是：此期基因的概念是： 一段可以轉(zhuǎn)錄為功能性RNA的DNA，它可以重迭、斷裂的形式存在，并可轉(zhuǎn) 座。 分子生物學(xué)時代 PCR技術(shù)

11、的不段發(fā)展 顯微注射術(shù)開始轉(zhuǎn)基因動物的研究 轉(zhuǎn)基因植物的誕生 基因治療技術(shù) 人類基因組計劃 克隆羊的誕生 胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 基因敲除或敲入小鼠的建立 、 分子生物學(xué)的發(fā)展ing Dolly 分子克隆 分子克隆技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中 最重要的成就之一，即是基因工程(Gene Engineering)的核心技術(shù)。 分子克?。╩olecular cloning） 又稱為基因克隆、基因工程、DNA克隆、重組DNA技術(shù) 克?。–lone）： 指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。 克隆化（cloning）： 獲取同一拷貝的過程，即無性繁殖。 分子克隆（DNA克?。?細(xì)胞克隆 個體

12、克?。▌游锘蛑参铮?分子克?。ㄖ亟MDNA技術(shù)） 指按照人的意愿，在體外將某種生物的DNA片斷插 入到載體（質(zhì)粒、病毒等）中，形成遺傳物質(zhì)的新組合 -重組DNA分子（重組子），然后將重組子轉(zhuǎn)移到宿主 細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)，即對DNA分子進(jìn)行克隆，以獲 得該DNA分子的大量拷貝。 可跨越物種屏障、把來自不同生物的基因進(jìn)行新的組合， 使得神話夢想成真！ 分子克隆（重組DNA技術(shù)） DNA RNA Protein The Central Dogma of Molecular Biology Replication Transcription Translation DNA Reverse Transc

13、ription Southern Blot Northern Blot Western Blot RT-PCR 分獲取目的基因和載體 切切目的基因與載體的酶切目的基因與載體的酶切 篩篩重組重組DNADNA的篩選與鑒定的篩選與鑒定 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)重組重組DNADNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞 接接目的基因與載體的連接目的基因與載體的連接 DNADNA克隆的基本過程克隆的基本過程 分：分： 基因載體基因載體 目的基因目的基因 質(zhì)粒質(zhì)粒 噬菌體噬菌體 病毒病毒 直接分離直接分離 cDNA 人工合成人工合成 基因文庫基因文庫 切：切： 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 有缺口的載體有缺口的載體 目的基因目的基因 接：接：

14、 連接酶連接酶 粘端連接粘端連接 平端連接平端連接 尾接法尾接法 重組體重組體 轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)： 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 體外包裝體外包裝 帶重組體的宿主帶重組體的宿主 篩：篩： 表型篩選表型篩選 電泳法電泳法 核酸雜交核酸雜交 載體載體DNADNA （vectorvector） 目的目的DNADNA （target fragmenttarget fragment） 重組重組DNADNA （recombinant DNA recombinant DNA ） 宿主（宿主（hosthost） 篩選、擴增篩選、擴增 克?。寺。╟loneclone） 分子克隆的路線 DNA DNA 重組重組 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 載體的特

15、性載體的特性 1 分子較小，可攜帶比較大的分子較小，可攜帶比較大的DNADNA片段片段 載體的特性載體的特性 能獨立于染色體而進(jìn)行自主能獨立于染色體而進(jìn)行自主 復(fù)制并且是高效的復(fù)制復(fù)制并且是高效的復(fù)制 2 有時還要求載體要能啟動外源有時還要求載體要能啟動外源 基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡 可能是高效的表達(dá)可能是高效的表達(dá) 4 3 要有盡可能多種限制酶的切要有盡可能多種限制酶的切 割位點，但每一種限制酶又割位點，但每一種限制酶又 要最少的切割位點要最少的切割位點 5 從安全角度考慮，要求載體不從安全角度考慮，要求載體不 能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實

16、 驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制 有適合的標(biāo)記，易于選擇有適合的標(biāo)記，易于選擇6 1 1 2 2 3 3 4 4 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 噬菌體載體噬菌體載體 酵母菌質(zhì)粒載體酵母菌質(zhì)粒載體 動植物病毒載體動植物病毒載體 克隆載體克隆載體 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 質(zhì)粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，一 般大小約為數(shù)千堿基對，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的 質(zhì)粒還帶有可做 為選擇性標(biāo)記的抗 藥性基因，所以質(zhì) 粒經(jīng)過適當(dāng)改選后 便可成為良好的載 體 載體特征：載體特征： 1.能自主復(fù)制的復(fù)制子 2.可供篩選的遺傳標(biāo)記 3.適當(dāng)大小的分子量 4.合適的限制性內(nèi)切酶位點，方 便外源基因的插入 5.

17、在受體細(xì)胞中高效復(fù)制 Different plasmids compete each other for growing 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的兩個質(zhì)粒會在復(fù)制和復(fù)制后向子細(xì)胞分配利用同一復(fù)制系統(tǒng)的兩個質(zhì)粒會在復(fù)制和復(fù)制后向子細(xì)胞分配 過程中彼此競爭。這樣的質(zhì)粒在過程中彼此競爭。這樣的質(zhì)粒在細(xì)菌培養(yǎng)物細(xì)菌培養(yǎng)物中不能和平相處。中不能和平相處。 不能確保兩個不同質(zhì)粒在同一個菌落中的拷貝數(shù)一致不能確保兩個不同質(zhì)粒在同一個菌落中的拷貝數(shù)一致 1.較大的質(zhì)粒需要更多的復(fù)制時間，所以拷貝數(shù)就會與小的質(zhì)粒較大的質(zhì)粒需要更多的復(fù)制時間，所以拷貝數(shù)就會與小的質(zhì)粒 比較起來處于弱勢。比較起來處于弱勢。 2.即使大小

18、一樣，但效力不一樣即使大小一樣，但效力不一樣。 隨著時間的延長，弱勢質(zhì)粒就會消失，很少有兩種質(zhì)粒共存隨著時間的延長，弱勢質(zhì)粒就會消失，很少有兩種質(zhì)粒共存 與同一細(xì)胞中與同一細(xì)胞中 所以要比較不同質(zhì)粒是否屬于不同復(fù)制子，如相同則不能所以要比較不同質(zhì)粒是否屬于不同復(fù)制子，如相同則不能 共生在同一細(xì)胞中。共生在同一細(xì)胞中。 質(zhì)粒的不相容性 質(zhì)粒發(fā)展概況質(zhì)粒發(fā)展概況 1. 第一階段（第一階段（1977年前）：年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 2. 第二階段：第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立

19、多克隆位點增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點 區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因，如區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因，如pUC系列載體。系列載體。 3.3.第三階段：第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同 要求，如要求，如M13mp系列載體，含系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表啟動子載體，表 達(dá)型載體及各種探針型載體。達(dá)型載體及各種探針型載體。 如如pSC101質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 長長9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因，帶有四環(huán)素抗性基因 （tet r）及 ）及EcoRI、HindIII、 BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及以及 S

20、maI等等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單種限制性核酸內(nèi)切酶的單 酶切位點，在酶切位點，在HindIII、BamHI和和 SalI等等3個位點插入外源基因，會導(dǎo)個位點插入外源基因，會導(dǎo) 致致tetr失活。失活。 1、克隆載體 2、表達(dá)載體 TYPES OF VECTORS TA克隆的idea最初來自1994年。幾位學(xué)者發(fā)現(xiàn)TaqDNA聚合酶 在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個脫氧腺苷（A），而且這種特性 與模板無關(guān)。之后，invitrogen公司發(fā)明了TA克隆技術(shù)，并擁 有全球TA cloning商標(biāo)的專利權(quán)。線性化的T載體在3末端擁有 一個脫氧胸苷（T），與PCR產(chǎn)物的A尾巴互補。 Why Plasmid

21、s are Good Vectors small size (easy to manipulate and isolate) circular (more stable) replication independent of host cell several copies may be present (facilitates replication) frequently have antibody resistance (detection easy) Disadvantages using plasmids Cannot accept large fragments Sizes ran

22、ge from 0- 10 kb Standard methods of transformation are inefficient 噬菌體載體噬菌體載體 一種典型的頭一種典型的頭- -尾結(jié)構(gòu)，雙鏈線狀尾結(jié)構(gòu)，雙鏈線狀DNADNA分子，全長分子，全長50kb50kb，含，含6666個基個基 因，在其分子兩端各含有因，在其分子兩端各含有1212個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末 端，被稱為端，被稱為COSCOS位點位點 噬菌體噬菌體 一種典型的纖維狀結(jié)構(gòu)，其一種典型的纖維狀結(jié)構(gòu)，其DNADNA分子相比分子相比噬菌體要小的多，長度噬菌體要小的多，長度 僅僅64076

23、407個核苷酸，通常為環(huán)狀雙鏈個核苷酸，通常為環(huán)狀雙鏈DNADNA M13噬菌體噬菌體 噬菌體結(jié)構(gòu) 它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有 一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬 菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi) M13噬菌體的侵染過程噬菌體的侵染過程 M13以纖毛吸附大腸桿菌，并向其注入自身DNA 單鏈DNA注入宿主細(xì)胞后，合成第二條鏈(雙鏈復(fù) 制模式 RF) RF DNA拷貝數(shù)達(dá)到100200個后 ,通過滾環(huán)復(fù)制 機制產(chǎn)生線狀單鏈DNA 包裝成為成熟的噬菌體顆粒并從細(xì)菌體內(nèi)溢出。 目的基因的獲取目的基因的獲取 聚合酶鏈反應(yīng) 制備基因組DNA制備cDNA 人工合成基因 . . 目的基因目的

24、基因 來源來源 Specific DNA sequence can be amplified by PCR (polymerase chain reaction) Kary Mullis Kary B. Mullis (1944 -)， 在在Cetus公司工作期間，公司工作期間， 發(fā)明了發(fā)明了PCR。 他原本是要他原本是要 合成合成DNA引物來進(jìn)行測序引物來進(jìn)行測序 工作，工作， 卻常為沒有足夠多卻常為沒有足夠多 的模板的模板DNA而煩惱。而煩惱。 1983年春夏之交的一個年春夏之交的一個 晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅 的路上萌發(fā)了用的路上萌發(fā)了用兩個兩個引物引物 （而不是一個

25、引物）（而不是一個引物）去擴去擴 增模板增模板DNA 的想法的想法. 很少有在公司工作的科研人員得很少有在公司工作的科研人員得 諾貝爾獎，諾貝爾獎， Mullis是其中之一是其中之一 Mullis開車的時候開車的時候, 瞬間感覺兩排路燈就是瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開的兩條鏈，自己的車和對面開 來的車象是來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著聚合酶，面對面地合成著DNA， Mullis的第一個的第一個PCR實驗實驗 1983年年9月中旬。月中旬。 Mullis在反應(yīng)體系中加在反應(yīng)體系中加 入入DNA聚合酶后在聚合酶后在37 一直保溫。結(jié)果第二一直保溫。結(jié)果第二 天在瓊脂

26、糖電泳上沒有天在瓊脂糖電泳上沒有 看到任何條帶。于是他看到任何條帶。于是他 認(rèn)識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后認(rèn)識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后 再加入再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。 1983年年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記月，他終于看到了被同位素標(biāo)記 的的PCR條帶。條帶。93年獲得了諾貝爾獎年獲得了諾貝爾獎 PCRPCR( (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) ) 變性變性 9595C C 延伸延伸 70-7570-75C C 退火退火 Tm-5Tm-5C C 反應(yīng)所需物質(zhì)：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、 緩沖液 每個循環(huán)包括：變性、退火

27、、延伸 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù) 核酸的凝膠電泳 自從瓊脂糖（自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引）凝膠被引 入核酸研究以來，按分子量大小分離入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成 為一種分析鑒定重組為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段。分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段。 電泳的遷移率與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正電泳的遷移率與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正 比，與片段大小成反比。比，與片段大小成反比。 瓊脂糖及聚丙烯

28、酰胺凝膠分辨DNA片段的能力 凝膠類型及濃度凝膠類型及濃度 分離分離DNA的大小范圍（的大小范圍（bp） 0.3%瓊脂糖瓊脂糖 50 0001 000 0.7%瓊脂糖瓊脂糖 20 0001 000 1.4%瓊脂糖瓊脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501 溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及 其對其對DNADNA分子的插入作用。分子的插入作用。 由于插入了溴化乙錠分子，由于插入了溴化乙錠分子， 在紫外光照射下，瓊脂糖凝在紫外光照射下，瓊脂糖凝 膠電泳中膠電泳中DNADN

29、A的條帶便呈現(xiàn)的條帶便呈現(xiàn) 出橘黃色熒光，易于鑒定。出橘黃色熒光，易于鑒定。 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖 PCR 瓊脂糖凝膠電泳 最終產(chǎn)物紫外光觀察 3-4 小時 從定性到定量的革命 SYBR green法 TaqMan體系 logDNA Cycles 不同樣品有不同的生成曲線 普通普通PCR和定量和定量PCR的區(qū)別的區(qū)別 適用定性分析，適用定性分析， 不適合定量分析；不適合定量分析； PCR 產(chǎn)物的長產(chǎn)物的長 度從度從100bp 數(shù)數(shù)kb 實時檢測實時檢測:每個循環(huán)每個循環(huán) 都產(chǎn)出熒光信號都產(chǎn)出熒光信號 絕對定量，靈敏度更絕對定量，靈敏度更 高高 PCR產(chǎn)物的長度一般產(chǎn)物的長度一般 在在 60-

30、150 bps DNA工具酶工具酶 A A 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶B B T4DNA連接酶連接酶 C C TaqDNA聚合酶聚合酶D D 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識別和是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識別和 切割雙鏈切割雙鏈DNADNA中的特定堿基序列的中的特定堿基序列的 核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶或切割酶。核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶或切割酶。 根據(jù)限制酶作用特性，一般分為根據(jù)限制酶作用特性，一般分為、 和和型，其中常用的是型，其中常用的是型限制型限制 酶酶 催化雙鏈催化雙鏈DNADNA中一條鏈的中一條鏈的33OHOH與與 另一條鏈的另一條鏈的55POPO3 3H H2 2形成磷酸二形成磷

31、酸二 酯鍵，從而構(gòu)成完整的酯鍵，從而構(gòu)成完整的DNADNA長鏈長鏈 逆轉(zhuǎn)錄酶是一個多功能性酶，至少逆轉(zhuǎn)錄酶是一個多功能性酶，至少 具有以下具有以下3 3種酶活性：種酶活性： 以單鏈以單鏈 RNARNA為模板，催化合成為模板，催化合成cDNAcDNA單鏈單鏈 具有具有RNaseHRNaseH活性，能水解活性，能水解RNA:DNARNA:DNA 雜交鏈中的雜交鏈中的RNA RNA 以以DNADNA為模板，為模板， 催化合成催化合成cDNAcDNA雙鏈雙鏈 TaqDNATaqDNA聚合酶是一種依賴聚合酶是一種依賴DNADNA的單的單 亞基耐熱亞基耐熱DNADNA聚合酶，聚合酶， 主要用于聚主要用于聚

32、 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，能以合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，能以DNADNA為模板，為模板， 從結(jié)合在模板上的引物出發(fā)，以從結(jié)合在模板上的引物出發(fā)，以 dNTPdNTP為原料，按堿基配對方式，從為原料，按堿基配對方式，從 5-35-3方向合成新的方向合成新的DNADNA鏈。鏈。 TaqDNATaqDNA聚合酶在聚合酶在70707575時具有最時具有最 佳的生物活性佳的生物活性 上個世紀(jì)中下葉以來，現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展源 自工具酶的發(fā)現(xiàn)。 （一）限制性核酸內(nèi)切酶 能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA 分子。 第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的， 它能特異性識別GAATT

33、C序列，將雙鏈DNA分子在這個 位點切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。 幾種主要DNA內(nèi)切酶所識別的序列 DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化：以以質(zhì)粒質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體作載體構(gòu)建的重組體 導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染：以以病毒病毒作載體構(gòu)建的重組體作載體構(gòu)建的重組體 導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程 轉(zhuǎn)導(dǎo)：轉(zhuǎn)導(dǎo)：以以噬菌體噬菌體作載體構(gòu)建的重組作載體構(gòu)建的重組 體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程 類 型 感受態(tài)細(xì)胞 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如CaCl2、 RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的 通透性發(fā)生變化，

34、成為能容許多有外源DNA 的載體分子通過的細(xì)胞 細(xì)菌轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選 重組DNA的篩選與鑒定 平板篩選（插入失活、藍(lán)白篩選） 限制酶切圖譜篩選 PCR篩選重組體 DNADNA測序技術(shù)測序技術(shù)4 4 1 1 2 2 3 3 重組重組DNADNA的篩選與鑒定方法的篩選與鑒定方法 2021-5-15 平板篩選 是指利用載體的遺傳性標(biāo)記在平板上直接 篩選的方法。具有抗藥性標(biāo)記的載體轉(zhuǎn)化 宿主細(xì)胞后，能在含抗生素（Amp或Tet） 的培養(yǎng)平板上生長；未轉(zhuǎn)化的則不能生長 平板篩選的種類 當(dāng)外源當(dāng)外源DNADNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化 細(xì)胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上細(xì)胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上 插入失活 利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑，篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑，篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌 藍(lán)白篩選 載體載體 宿主宿主 編碼編碼-半乳半乳 糖苷酶糖苷酶N N端序端序 列列 （IPTGIPTG存在）存在） 編碼編碼-半乳半乳 糖苷酶糖苷酶C C端序端序 列列 - -互補互補 細(xì)菌表達(dá)： -半乳糖苷酶活性 5-溴-4-氯