大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法(Jin-Lab)

1、精品文檔大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法（Jin Qua n-Wen Lab at XMU）一、大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備：第一天：1. 用槍頭或接種環(huán)挑取單克隆菌落，接種入盛有5ml LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中， 可以準(zhǔn)備兩管。37 C, 220rpm,培養(yǎng)過(guò)夜（14-16個(gè)小時(shí)）。2. 高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）和幾個(gè)50ml離心管，以備第二天離心收 集細(xì)菌用。3. 準(zhǔn)備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)菌 細(xì)胞用。第二天：1. 取2-5ml過(guò)夜培養(yǎng)液，接入500ml LB （或2XTY）液體培養(yǎng)基中,控制起始0臥 =0,03-0,05。37

2、 C, 220rpm,振搖2-4小時(shí)，每半小時(shí)測(cè)一次 OD當(dāng)OD 值達(dá)到0.4時(shí)，停止培養(yǎng)。2. 將菌液在冰上預(yù)冷30分鐘。同時(shí)，開(kāi)啟離心機(jī)，預(yù)冷至 4 C。3. 隨后將菌液分裝到250ml或500ml預(yù)冷的離心瓶中，4 C, 4000rpm離心15 分鐘。4. 棄上清液，先用少量（如20-50ml ）滅菌的冰水重懸沉淀的細(xì)胞團(tuán)，然后加 水稀釋至離心瓶的2/3體積，充分懸起細(xì)胞（可以用手握住瓶體上部震蕩！）。4 C, 4000rpm離心 15 分鐘。5. 棄上清液，加少量滅菌水，重懸菌體，再加水至所有細(xì)胞懸浮約500ml冰水 中。4 C, 4000rpm,離心15分鐘。6. 棄上清，往離心管中

3、加入少量10%甘油（滅菌，預(yù)冷），重懸菌體，再加10% 甘油至終體積約為 20ml。4 C, 4000rpm,離心10min。7 .小心棄去上清（沉淀可能會(huì)很松散?。?，加入2ml 10%甘油（滅菌，預(yù)冷）重懸 浮細(xì)胞。8. 將懸浮菌液以200ul/管分裝于1.5ml的Ep離心管中，在液氮中快速冷凍后， 于-70 C冰箱中保存。9. 檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率：取100 l新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入 0.01 ng已知濃度的 plasmid DNA電轉(zhuǎn)化后，將重懸在1ml SOC培養(yǎng)液并復(fù)蘇的細(xì)胞分別取10 l （1%）和100 l （10%）涂板，估測(cè)轉(zhuǎn)化效率。8* Optimal efficie ncy

4、is ca. 1X10cfu/ (ig DNA for gen eral clo ning.* For library tran sformatio n, efficie ncy with ca. 1X10cfu/ (ig DNA isrequired.感受態(tài)細(xì)胞制備簡(jiǎn)要流程：收集細(xì)胞 冰水沖洗細(xì)胞2次10%甘油沖洗細(xì)胞1次 重懸細(xì)胞在10%甘油 分裝 二、電轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物、純化質(zhì)?；蛸|(zhì)粒文庫(kù):1. 從-80 C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。2 將無(wú)菌的電擊杯置于冰上預(yù)冷。3. 將解凍的感受態(tài)細(xì)胞按照40100ul/管轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml的離心管中，小 心混勻，冰上放置。4. 取1-2

5、d純化的質(zhì)?；蚩寺∵B接產(chǎn)物于 1.5ml的離心管中，冰上放置10min 加入的DNA體積過(guò)大時(shí)，其中的鹽會(huì)造成電擊時(shí)產(chǎn)生電火花！5. 打開(kāi)電轉(zhuǎn)儀Bio-Rad Gene Pulser System，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)參數(shù)設(shè)置為 25折,200 OHMs,電壓為2.0 kV 這些參數(shù)設(shè)置可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)略作調(diào)整。6. 將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電擊杯中，輕輕敲擊電擊杯使混合物均勻進(jìn)入電 極杯的底部。用吸水紙吸干電擊杯外壁的冰水。7. 將電擊杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下 pulse鍵，聽(tīng)到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速 加入2X 500 l的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到 1.5ml的離心管中。8. 37

6、 C, 220-250rpm復(fù)蘇 1 小時(shí)。9. 離心，涂板，置于37 C,過(guò)夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。二、電擊杯的清洗和保存：1. 用清水將用過(guò)的電擊杯稍微沖一下，向電擊杯中加入 75%酒精沖洗。2. 棄去酒精，再用蒸餾水沖洗23遍，然后用1ml的槍吸取超純水反復(fù)吹打電 擊杯10次以上。3. 加入無(wú)水乙醇1-2ml于電擊杯中，浸泡5分鐘。4. 棄去無(wú)水乙醇，將電擊杯倒置于吸水紙上讓乙醇充分揮發(fā)。5. 將清洗并干燥好的電擊杯加上蓋子，存放備用。幾種可以選用的細(xì)菌培養(yǎng)基:200ml500ml1000mlLB1 g yeast extract2 g trypto ne (or pept one)2

7、 g NaCl2.5 g yeast extract5 g trypt one (or pept one)5 g NaCl5 g yeast extract10 g trypt one (or pept one)10 g NaCl2TY3.2 g Trypt one2 g Yeast Extract1 g NaCl用 5 NNaOH調(diào) pH值至 7.08 g Trypto ne5 g Yeast Extract2.5 g NaCl用 5 N NaOH調(diào) pH值至 7.016 g Trypt one10 g Yeast Extract5 g NaCl用 5 N NaOH調(diào) pH值至 7.0SOC

8、4 g Trypto ne1 g Yeast Extract0.1 g NaCl2 ml KCl (250 mmol/L)1 ml MgCl 2 (2 mol/L)4 ml Glucose (1 mol/L)10 g Trypt one2.5 g Yeast Extract0.25 g NaCl5 ml KCl (250 mmol/L)2.5 ml MgCl 2 (2 mol/L)10 ml Glucose (1 mol/L)20 g Trypt one5 g Yeast Extract0.5 g NaCl10 ml KCl (250 mmol/L)5 ml MgCl2 (2 mol/L)20 ml Glucose (1 mol/L)Note: 1.溶液使用前，加入滅菌的MgCk2. SOC培養(yǎng)基除含有 20 mmol/L葡萄糖外，其他成分與 SOB培養(yǎng)基相同。SOB培養(yǎng) 基經(jīng)咼壓火菌后冷至 60 C或以下，加20 ml除菌的1 mol/L葡萄糖溶液（1