Car-T細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程

1、car-t 細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程1 目的：保證 car-t 細(xì)胞制備和培養(yǎng)符合要求。2 范圍：適用于符合實(shí)驗(yàn)的要求患者外周血制備和培養(yǎng)3 責(zé)任人：實(shí)驗(yàn)員人、臨床相關(guān)人員。4 內(nèi)容4.1 耗材： 50ml 離心管， 10ml 移液管， 5ml 移液管， 75cm2 培養(yǎng)瓶， 150 cm2培養(yǎng)瓶，epw, 1.8ml凍存管4.2 試劑：x-vivo 15tm , pbs緩沖液，75%醫(yī)用酒精，人淋巴細(xì)胞分離液，cd3/cd28 免疫磁珠， il-2 ，注射用人血白蛋白。4.3 環(huán)境：4.3.1 外周血分離，培養(yǎng)應(yīng)在恒溫恒濕的萬(wàn)級(jí)層流室內(nèi)進(jìn)行，開放操作必須在百級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。4.3.2 實(shí)驗(yàn)人

2、員應(yīng)提前對(duì)凈化室和生物安全柜進(jìn)行殺菌消毒，紫外線照射時(shí)間不少于 30min ， 消毒消毒后， 凈化空調(diào)開啟時(shí)間不少于 30min ， 生物安全柜運(yùn)行穩(wěn)定后方可操作。4.4 操作：4.4.1 采集接收外周血4.4.1.1 患者符合治療方案，各項(xiàng)檢測(cè)符合要求，采集患者外周血60-80ml 。4.4.1.2 接收外周血并填寫外周血采集交接記錄，核對(duì)外周血患者相關(guān)信息，及相應(yīng)檢測(cè)報(bào)告， 報(bào)告由醫(yī)院提供， 至少包括： hbsag ， hcvab ， hivab ， anti-tp ，alt。4.4.2 操作前準(zhǔn)備4.4.2.1 凈化室，生物安全柜消毒完畢后，開啟凈化空調(diào)運(yùn)行30min ，生物安全柜運(yùn)行穩(wěn)

3、定。4.4.2.2 從試劑間冰箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)基，恢復(fù)室溫。4.4.2.3 生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒轉(zhuǎn)入安全柜內(nèi)。4.4.3 分離單個(gè)核細(xì)胞（ pbmc ）：4.4.3.1 使用滅菌消毒的剪刀剪斷血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋內(nèi)外周血轉(zhuǎn)入 50ml 離心管中。4.4.3.2 用pbs緩沖液按1:1稀釋外周血，混勻。4.4.3.3 將稀釋好的血樣緩慢加入室溫的 15ml 人淋巴細(xì)胞分離液的離心管中。方法如下：用 10ml 移液管吸取血樣，伸至分離液液面上方 0.5cm 處，血樣自然滑落鋪至分離液面上，然后輕輕加入血樣，注意不要沖破液面。4.4.3.4 配平離心

4、1200g (2100r/min )離心 20min ，慢升慢降。4.4.3.5 離心完成后， 離心管出現(xiàn)明顯分層由下至上： 紅細(xì)胞層， 粒細(xì)胞層， ficoll層，單個(gè)核細(xì)胞層和血漿層。吸取血漿層至距白膜層5mm 左右處棄之。小心吸取紅細(xì)胞層以上的所有液體至離心管中，pbs稀釋，與細(xì)胞懸液體積比應(yīng)大于1:3, 混勻。4.4.3.6 離心600g (1600r/min ) 5min , pbs重懸細(xì)胞混勻，取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。4.4.3.7 離心 300g (1200r/min ) 5min ，上清液送檢無(wú)菌檢測(cè)。4.4.4 細(xì)胞培養(yǎng)：4.4.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件：恒溫3co2濃度5%,相對(duì)飽和濕

5、度95%,細(xì)胞培養(yǎng)基 ph值7.2-7.4。4.4.4.2 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)密度2x106/ml 加入培養(yǎng)瓶中( t150 200x106/100ml,t75 100x106/50ml ,t25 50x106/25ml)?；靹蚍湃?co2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2小時(shí)。4.4.4.3 取出培養(yǎng)瓶， 輕搖， 使沉降于底部的懸浮細(xì)胞浮起， 培養(yǎng)瓶?jī)A斜 30度角，移液管吸取培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入離心管中， 少些培養(yǎng)基洗培養(yǎng)瓶將懸浮細(xì)胞全部收集， 混勻計(jì)數(shù)。4.4.4.4 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度1.2x106/ml 接種培養(yǎng)瓶中( 100-120ml in at150 ， 50-60ml in a t75 ， 15-29m

6、l in a t25 )，加 cd3/cd28 磁珠，按細(xì)胞與磁珠比例為 1:3 (加之前磁珠用培養(yǎng)基洗滌3次，去除保存液)，加入 il-2100u/ml，混勻放入co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.4.4.5 次日細(xì)胞培養(yǎng)1天， 調(diào)整細(xì)胞密度至0.6x106/ml ， 加入病毒 (moi 為1-5 )混勻放入co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.4.4.6 細(xì)胞培養(yǎng) 3天，細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)加培養(yǎng)基， il-2 100u/ml 細(xì)胞密度調(diào)整至0.6x106/ml 繼續(xù)培養(yǎng)。4.4.4.7 細(xì)胞培養(yǎng)5天去磁珠，細(xì)胞混勻轉(zhuǎn)離心管中，在磁力架上去除磁珠，細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)加培養(yǎng)基， il-2 100u/ml 細(xì)胞密度調(diào)整至0.6x106/ml

7、 繼續(xù)培養(yǎng)。4.4.4.8 定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況， 主要觀察其形態(tài)的變化， 數(shù)目及增值情況， 細(xì)胞碎片及雜質(zhì)情況，每2-3 天加液培養(yǎng)。4.4.4.9 根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和臨床治療需要，培養(yǎng)9天時(shí)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到要求，各項(xiàng)檢測(cè)合格。包括：無(wú)菌檢測(cè)，內(nèi)毒素檢測(cè)，細(xì)胞活力，細(xì)胞表型等。4.4.5 car-t 細(xì)胞收集：4.4.5.1 確認(rèn)細(xì)胞各項(xiàng)檢測(cè)己符合要求。4.4.5.2 根據(jù)治療方案（一般一個(gè)療程分多次回輸，間隔時(shí)間為 1天），取出相應(yīng)細(xì)胞懸液，剩余細(xì)胞補(bǔ)加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，供再次回輸。4.4.5.3 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中， 300g 離心 5min 。4.4.5.4 除去上清培養(yǎng)液，加pbsg沖液稀釋混勻，300g離心5min ,棄上清，pbs緩沖液 300g/min 離心 5min 。4.4.5.5 細(xì)胞裝袋 （一般靜脈回輸， 采用 100ml 雙閥鹽水袋） ， 離心完成后取上清，做無(wú)菌檢測(cè)，20ml生理鹽水重懸細(xì)胞，100仙mffl胞濾網(wǎng)過(guò)濾，取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞活率，革蘭氏檢測(cè)，內(nèi)毒素檢測(cè)。細(xì)胞過(guò)濾完成，轉(zhuǎn)入 100ml 鹽水袋中，加5% 注射用人血白蛋白，貼上標(biāo)簽，并填寫相關(guān)記錄。4.5 細(xì)胞運(yùn)輸與保存：4.5.1 核對(duì)細(xì)胞標(biāo)簽內(nèi)容，填寫回輸發(fā)放記錄。4.5.2 細(xì)胞鹽水袋放置于運(yùn)輸