藥物對豚鼠離體腸平滑肌的作用及PA2PD2測定的實驗方案

1、中藥學院綜合設計性實驗方案學生學號、姓名： 蘇鶴桂 譚柏森 鐘潤桃 彭冠 王衍棟 年級、專業(yè)： 06藥學實驗課程名稱：藥物對豚鼠離體腸平滑肌的作用及PA2、PD2測定 實驗分組號： 填寫日期： 09.11.11. 實驗名稱藥物對豚鼠離體腸平滑肌的作用及PA2、PD2測定 項目背景（實驗的目的、意義，以及欲解決的問題和國內(nèi)外研究現(xiàn)狀）實驗的目的1. 建立豚鼠離體腸平滑肌實驗模型；2. 觀察阿托品對乙酰膽堿的競爭性拮抗作用3. 掌握pA2、pD2值的測定方法實驗意義1 建立方法研究藥物拮抗作用2掌握pA2、pD2值的測定方法國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析（一）阿托品對胃腸道的研究狀況阿托品可以抑制受體節(jié)后膽堿

2、能神經(jīng)支配的平滑肌與腺體活動，并根據(jù)本品劑量大小，有刺激或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用。解毒系在M-膽堿受體部位拮抗膽堿酯酶抑制劑的作用, 如增加氣管、腸道系粘液腺與唾液腺的分泌，腸道平滑肌攣縮，以及植物神經(jīng)節(jié)受刺激后的亢進。此外，阿托品能興奮或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有一定的劑量依賴性。對心臟、腸和腸道平滑肌作用比其他顛茄生物堿更強而持久。（二）乙酰膽堿的研究狀況ACh可明顯興奮胃腸道，使其收縮幅度、張力增加，胃、腸平滑肌蠕動增加，并可促進胃、腸分泌，導致惡心、噯氣、嘔吐、腹痛及排便等癥狀。Ach還可使淚腺、氣管和腸道腺體、唾液腺、消化道腺體和汗腺分泌增加，使腸道收縮，頸動脈和主動脈體化學受體興奮。當A

3、Ch局部滴眼時，可致瞳孔收縮，調(diào)節(jié)于近視。ACh尚可作用于自主神經(jīng)節(jié)和骨骼肌的神經(jīng)肌肉接頭的膽堿受體，引起交感、副交感神經(jīng)節(jié)興奮，肌肉收縮。由于ACh不易進入中樞，故盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)有膽堿受體存在，但外周給藥很少產(chǎn)生中樞作用。臨床常見藥物有卡巴膽堿，毛果蕓香堿，氯貝膽堿等。（三）M受體對胃腸道的研究狀況1）作用機制M受體廣泛分布在全身各平滑肌中，包括胃腸道，它在維持全身平滑肌收縮狀態(tài)時起主要作用。分布在肌纖維膜上的M受體亞型主要為M1和M2其中M2數(shù)量占75%-80%，但M3受體是主要的功能類型。許多實驗表明，當離體的胃腸平滑肌束接觸M興奮劑時，所引起的收縮對M受體競爭性拮抗劑敏感，這種現(xiàn)象與

4、M3激活機制一致。這種情況可用下述機制解釋：M3受體與GQ家族的G蛋白耦聯(lián)，導致磷脂酶C活化、磷酸肌醇水解，促使三磷酸肌醇和1,2-二?；视退皆龈?，從而引起鈣離子動員，即肌漿網(wǎng)內(nèi)儲存鈣離子釋放，胞漿內(nèi)鈣離子增多，觸發(fā)平滑肌收縮。DG水平的增高可激活蛋白激酶C，而使其發(fā)生重分布至胞膜，產(chǎn)生磷酸化功能。在大多數(shù)情況下，M1,M3,M5亞型的磷酸肌醇反應對PTX不敏感。而M2亞型與GI家族的G蛋白相互作用，介導PTX 敏感性的針對CAMP聚集的抑制反應。M2,M4受體也可通過直接耦聯(lián)GI,GO蛋白來介導內(nèi)向整流鉀通道的激活和神經(jīng)元鈣通道的抑制，這些離子反應也表現(xiàn)為PTX敏感性。2) M受體在小腸

5、的分布和介導作用1986 年CHOO等采用放射配體法發(fā)現(xiàn)M2受體在回腸分布的高度優(yōu)勢傾向。此后，許多實驗表明在小腸全層組織中均存在M2,M3受體，其中M2受體比例占多數(shù)，M3受體數(shù)量大約僅占M2受體1/4。比如，MICHEL等用3H-聯(lián)苯乙酰氧基甲基六氫吡啶 (M3配體）選擇性標記豚鼠回腸縱肌層內(nèi)的M3受體，發(fā)現(xiàn)M3受體密度較低。在豚鼠、大鼠、狗和人的在體、離體及單個平滑肌細胞眾多實驗中均發(fā)現(xiàn)，M3受體是調(diào)節(jié)小腸平滑肌收縮的主要受體。有實驗表明， M3受體特異性拮抗劑等對兔和豚鼠回腸的親和力與M3受體的活化一致。另外，選擇性M 受體烷基化和脫敏實驗也表明，M3受體在標準條件下介導回腸收縮，包括

6、縱肌層和環(huán)肌層。也有實驗證實，M3受體是調(diào)節(jié)狗小腸移行性運動復合波的主要受體。這些實驗的對象大多是全層平滑肌，而有人提出環(huán)肌和縱肌的收縮機制可能不一樣。SHI等在分別分析狗小腸環(huán)肌和縱肌實驗后發(fā)現(xiàn)，雖然M3受體是調(diào)節(jié)環(huán)肌收縮的主要受體，但M2,M3均參與縱肌的收縮，因為M2受體拮抗劑在離體或在體實驗中用較低濃度即可顯著抑制縱肌收縮，而對環(huán)肌無明顯影響。二、實施方案（包括實驗的原理或技術(shù)路線、實驗器材與藥品、具體操作過程、每個成員的具體分工、實驗的進程安排等）實驗原理 1、 激動藥與拮抗藥 （1）.激動藥(agonist)：與受體有親和力又有內(nèi)在活性藥物。完全激動藥(full agonist):

7、 = 1 部分激動藥(partial agonist, mixed agonist): 與受體有親和力，但內(nèi)在活性較弱 （1）的藥物。 （2）.拮抗藥(antagonist)：與受體有親和力，而無內(nèi)在活性的藥物（= 0）。 競爭性拮抗藥(competitive antagonist)與激動藥競爭同一受體的拮抗藥。激動藥的量效反應曲線可以被競爭性拮抗藥平行右移。非競爭性拮抗藥（noncompetitive antagonist）與激動劑作用于同一受體，結(jié)合牢固，分解慢或是不可逆的，或作用于相互關(guān)聯(lián)的不同受體。 2、PA2、PD2值 PA2是一種用以表示競爭性拮抗劑作用強度的指標，其意義是能使激動

8、劑提高到原來的2倍時，可產(chǎn)生與原來濃度相同效應所需的拮抗劑克分子濃度的負對數(shù)(-log(B)。PA2的值越大說明拮抗劑的作用越強。pA2是拮抗參數(shù)(antagonism parameter)：當有一定濃度的拮抗藥存在時，激動劑增加2倍時才能達到原來效應，此時拮抗藥的負對數(shù)即拮抗參數(shù)， pA2 = -logI = -logKI PD2：是激動劑與受體親和力的定量表示。按照Ariens的定義，PD2是產(chǎn)生50最大效應(E=12Emax)的摩爾濃度的負對數(shù)(-logD)。PD2值越大，說明藥物和受體的親和力越大，藥效越強。計算方法與PA2相似實驗材料 乙酰膽堿（mol/L）：10-6、10-5、10

9、-4、10-3、10-2 阿托品（mol/L）：310-7臺氏液配制 1000ml臺氏液含：NaCl 8.0g、10% KCl 2.0ml(0.2g)、10% MgSO4.7H2O 2.6ml(0.26g)、5% NaH2PO4 .2 H2O 1.3ml(0.065g)、NaHCO3 1.0g、1M CaCL2 1.8ml（0.2g）、葡萄糖 1.0g。離體器官浴池及恒溫裝置、PowerLab系統(tǒng)、混合氣體（95O25CO2）、負荷500 mg、加液器、培養(yǎng)皿、縫針、線、眼科鑷子、剪刀?！緦嶒灢襟E】1離體腸肌的制備猛擊豚鼠頭部至昏，立即剖開腹腔，自幽門下5cm剪取空腸和回腸上段，迅速置于臺氏液

10、液中。小心剪去腸系膜，用吸管吸取臺氏液液緩慢沖洗腸內(nèi)容物；將空腸段分割成2 cm的小段備用，然后用縫針在腸段兩端各穿一根線，作為固定腸肌之用。2實驗裝置將制成的標本一端固定于通氣鉤上，另一端連接于肌力換能器并接入PowerLab系統(tǒng)的橋式放大器上，浴池內(nèi)放20ml 臺氏液液，加500mg負荷，恒溫371C，浴池內(nèi)持續(xù)通入95O2與5CO2的混合氣體。3累積劑量效應曲線的制作實驗裝置完畢以后，打開PowerLab系統(tǒng)，按“操作指南”設置參數(shù)：（1）選擇channel 1（2）記錄速度10 /s（3）Bridge Amplifer中“rang”選擇20 mv，“Low Pass”選擇50 Hz （

11、4）調(diào)零“zero” 描記腸肌收縮曲線，待收縮基線平穩(wěn)后，按下列（表6-2）次序在浴池中加入預先配好的不同分子濃度的乙酰膽堿。表6-2 累積劑量法加藥順序累加次序藥液濃度（mol/L）藥液的毫升數(shù)（ml）每L中累積劑量（mmol）110-60.20.01210-60.40.03310-50.140.1410-50.40.3510-40.141610-40.43710-30.1410810-30.430910-20.141001010-20.4300隨藥液的依次加入，浴池內(nèi)藥物濃度不斷提高。每加入一個劑量后，約經(jīng)數(shù)秒鐘腸肌的收縮達高峰。應在高峰未下降前，迅速加入下一個劑量。當反應到一定高峰，再遞

12、增劑量，效應不再增加，此時的效應為最大效應。4阿托品拮抗乙酰膽堿的劑量效應曲線的制作放去浴池中的液體，用臺氏液液沖洗三次，以后每隔10min沖洗一次，共沖洗三次，再加入臺氏液液至20ml。待收縮基線平穩(wěn)后，加入阿托品3X107 mol/L 0.2ml，培育15min，再按“方法3”依次加入不同濃度的乙酰膽堿，便可得到有拮抗劑時乙酰膽堿的累積劑量效應曲線，此時拮抗劑（阿托品）摩爾濃度的負對數(shù)即pAx。 【統(tǒng)計與處理】1繪制累積劑量效應曲線取方格紙，以腸肌收縮幅度（mv）作為縱坐標即效應（E），以藥物對數(shù)濃度（lg C）為橫坐標，繪制量效曲線。KD值即達到50最大效應時，在橫坐標上所對應的藥物濃度

13、。 藥物的最大效應（Emax）即曲線的高度。當比較同類藥物的Emax時，即比較曲線的高度（腸肌收縮最大幅度）。2直線回歸（LR）計算參數(shù)為了正確求得各參數(shù)，必須將曲線直線化。可按D/R式（改良LineweaverBurk式）使劑量效應曲線直線化。 (y) (a) (b) (x)式中：D為藥物劑量（濃度），E為某一劑量的效應，KD為藥物的解離常數(shù)，Emax為藥物的最大效應。以D/E為縱坐標，D為橫坐標進行直線回歸。按直線公式y(tǒng) = a + bx，則Log KD 即pD2根據(jù)公式pA2 = pAx + log (x-1)，式中pAx為拮抗劑摩爾濃度的負對數(shù)，x為用拮抗劑后與用拮抗劑前KD之比。實驗安排 2009/11/2-2009/11/20 制定實驗方案，并對方案進行陳述 2009/11/302009/12/1 根據(jù)實驗方案準備實驗材料2009/12/22009/12/3 進行實驗 2009/12/4 統(tǒng)計結(jié)果及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 2009/12/5-2009/12/8 實驗總結(jié)及撰寫報告 四、參考文獻1 葛建國.不合理用藥實例分析.中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥雜志J