體內(nèi)藥物分析方法

1、體內(nèi)藥物分析 biopharmaceutical analysis 第一章 體內(nèi)藥物分析概述 一、體內(nèi)藥物分析的定義 狹義：利用現(xiàn)代分析儀器和分離手段對(duì)人和動(dòng)物血 液、尿和組織等樣品進(jìn)行定性定量的分析 廣義：通過(guò)體內(nèi)藥物濃度的分析，了解藥物在體內(nèi) 的數(shù)量和質(zhì)量的變化，獲得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為藥品 的生產(chǎn)、臨床應(yīng)用作出評(píng)價(jià) 二、體內(nèi)藥物分析的意義 （一）在新藥評(píng)價(jià) 和開(kāi)發(fā)中的意義 1全面質(zhì)量控制 2新藥報(bào)批 3為設(shè)計(jì)新藥提供信息 從代謝產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)新藥 保泰松羥基保泰松（作用強(qiáng)、副作用?。?非那西丁撲熱息痛 前藥設(shè)計(jì) 新劑型的研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等 以上內(nèi)容必須通過(guò)測(cè)定體內(nèi)藥物濃度得以解決 （二）

2、臨床合理用藥中的意義 1血藥濃度與藥理作用 2. 影響血藥濃度的因素 （1）機(jī)體因素 a生理因素 年齡、性別、生理狀況 b病理因素 c遺傳因素 （2）藥物因素 a劑型因素（生物利用度問(wèn)題） b藥物合并使用（酶抑、酶促） c時(shí)間因素 （三）藥物中毒解救的意義 （四）興奮劑檢測(cè)的意義 三、體內(nèi)藥物分析的對(duì)象 3從樣品的來(lái)源分 1從分析物分 母體藥物 代謝物 內(nèi)源性物質(zhì) 2從生物樣品種類(lèi)分 均勻樣品 非均勻樣品 人體 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 四、體內(nèi)藥物分析的任務(wù) （一）方法學(xué)的研究 （二）治療藥物監(jiān)測(cè) tdm，therapeutical drug monitoring 1定義 2哪些藥物需進(jìn)行體內(nèi)血藥濃度監(jiān)測(cè)

3、有效血藥濃度范圍窄，稍高毒性大，稍低無(wú)療效 劑量小，毒性大的藥物 個(gè)體差異大，劑量難以控制 藥物毒性反應(yīng)與疾病癥狀相似 多種藥物合并應(yīng)用，有中毒危險(xiǎn) 胃腸道、肝臟、腎臟疾病 呈非線性動(dòng)力學(xué)的藥物 判斷患者用藥的依從性 （三）藥代動(dòng)力學(xué)的研究 （四）代謝分型的應(yīng)用 （五）內(nèi)源性物質(zhì)測(cè)定 五、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn) 1干擾雜質(zhì)多 2樣品濃度低 3取樣量少 4工作量大 5時(shí)間短 6有一定設(shè)備 六、體內(nèi)藥物分析的發(fā)展 1國(guó)外發(fā)展概況 60年代初發(fā)現(xiàn)藥效與血藥濃度關(guān)系 70年代體內(nèi)藥物分析方法建立 80年代至今發(fā)展迅猛，新儀器不斷涌現(xiàn) 書(shū)籍出版 drug level monitoring1980 thera

4、peutical drug monitoring1981 textbook of biopharmaceutic analysis1981 2國(guó)內(nèi)情況 80年代初，藥物分析工作者倡導(dǎo)，1980年版藥物 分析教材中納入部分內(nèi)容，第二、三版增加體內(nèi)藥物 分析一章。第四版、第五版取消，各學(xué)校開(kāi)設(shè)體內(nèi)藥物 分析課程。 80年代開(kāi)始在醫(yī)院進(jìn)行臨床藥學(xué)工作，主要測(cè)定藥 物濃度。 有關(guān)書(shū)籍 吳如金體內(nèi)藥物分析人衛(wèi)版1984 陸明廉血藥濃度測(cè)定與臨床應(yīng)用上海科技1986 陳剛治療藥物監(jiān)測(cè)理論與實(shí)踐人民軍醫(yī)1988 吳萊文治療藥物監(jiān)測(cè)人衛(wèi)版 1989 曾經(jīng)澤生物藥物分析 北京大學(xué)出版社 1998 姚彤煒體內(nèi)藥物

5、分析浙大2001 張君仁體內(nèi)藥物分析 化學(xué)工業(yè)出版社2002 3學(xué)科前沿 v 游離藥物濃度測(cè)定 v 直接進(jìn)樣方法研究 v代謝物測(cè)定 v 對(duì)映體分析 第二章 體內(nèi)藥物存在的狀態(tài)與 體內(nèi)藥物分析的關(guān)系 一、藥物的體內(nèi)變化 吸收分布代謝排泄 adme過(guò)程 發(fā)生兩種變化 物理變化 可逆變化 化學(xué)變化 結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生變化 二、藥物與血漿蛋白的結(jié)合 1游離型藥物與結(jié)合型藥物（非特異性的結(jié)合） 在血漿、組織中均存在游離型和結(jié)合型的藥物 尿液中含微量p，血漿中含大量p，唾液中p為血漿1/10 與藥物 結(jié)合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂 蛋白 弱酸性藥物主要與白蛋白結(jié)合 弱堿性藥物與白蛋白、a1-酸性

6、糖蛋白結(jié)合 藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合通過(guò)共價(jià)鍵（氫鍵，離子間靜電 力等） 2血漿蛋白結(jié)合率 df+p db k= 解離常數(shù) 血漿蛋白結(jié)合率： = = pdf db db db+df 1 1+k/np+df/np 結(jié)合力強(qiáng)的藥物可以置換結(jié)合力弱的藥物，通過(guò)競(jìng) 爭(zhēng)蛋白是藥物相互作用類(lèi)型之一。 由此可見(jiàn)，k、np是影響的重要因素 np k 藥物在足夠高濃度時(shí)使結(jié)合部位飽和，濃度再增高， 多余的藥物均呈游離狀態(tài)，結(jié)合部分比率降低，藥物血 漿蛋白結(jié)合率是藥代動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一。 3血漿蛋白結(jié)合的測(cè)定 平衡透析法、超濾法、凝膠過(guò)濾法、光譜法等。 （1）平衡透析法 原理 計(jì)算 = 100% =ct-cf/ct1

7、00% 袋內(nèi)-袋外 袋內(nèi)藥物 注意事項(xiàng) a. 蛋白質(zhì)溶液 新鮮血漿 ph7.4，至少三個(gè)濃度測(cè)定 b. 緩沖液 0.13mol/l磷酸鹽緩沖液，因?yàn)閚a3po4 抑制酸性藥物 與蛋白質(zhì)結(jié)合 c. 溫度與平衡時(shí)間 37 1648h 注意防腐劑加入，藥物的分解 d. 透析袋 滲漏檢測(cè) 3%三氯醋酸 e. 攪拌 保持動(dòng)態(tài)平衡 影響因素 a. 藥物膜上吸附 b. donnan效應(yīng) 由于電荷的影響，可造成平衡時(shí)半透膜兩側(cè)游離藥濃 不同，donnan效應(yīng)，加入中性鹽可消除。 c. 空白值增加 d. 緩沖液體積變化，水分進(jìn)入血漿 游離藥濃 此法用于測(cè)定藥物時(shí)，耗費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)，一般少采用 （2）超濾法 v原理

8、v計(jì)算 v注意事項(xiàng) a裝置 50l5ml，選擇不同型號(hào)超濾膜，保濕。 b速度與時(shí)間 300010000r/min 515min c溫度 37，25，4 v影響因素 a膜吸附 b超濾液的體積 超濾液/總體積0.30.6 c超濾膜溫度 三、藥物與血漿蛋白結(jié)合對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響 1血漿不同對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響 2平衡狀態(tài)不同對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響 3平衡狀態(tài)受破壞對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響 4游離與結(jié)合同時(shí)出現(xiàn)時(shí)對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響 四、藥物代謝 1研究藥物代謝的意義 了解藥物在體內(nèi)的命運(yùn)及相互作用，保證臨床用藥安全 有效 研究藥物代謝途徑、藥物結(jié)構(gòu)與藥理作用關(guān)系，尋找新 藥 研究藥物相互作用機(jī)制 有利于

9、建立體內(nèi)藥物分析新方法，避免代謝物干擾 2藥物代謝的途徑 第一相反應(yīng)：在酶作用下發(fā)生的氧化、還原、水解， 使極性增加，水溶性增強(qiáng) 第二相反應(yīng)：藥物或經(jīng)一相反應(yīng)后的代謝物與葡萄 糖醛酸、硫酸鹽結(jié)合等，使分子極性進(jìn)一步加大，有利 于從尿中排出，結(jié)合過(guò)程通常使藥物滅活。 v 氧化反應(yīng) v 還原反應(yīng) v 水解反應(yīng) v 結(jié)合反應(yīng) a葡萄糖醛酸結(jié)合 b硫酸酯化 c谷胱甘肽綴合 d乙?；Y(jié)合 e氨基酸結(jié)合 五、藥物代謝與體內(nèi)藥物分析的關(guān)系 1樣品的保存 樣品可能會(huì)分解，如血漿酯酶可使酯類(lèi)藥物水解， 酶類(lèi)可使藥物繼續(xù)代謝，加入酶抑制劑和冷藏保存。 2分析方法選擇 光譜法 色譜法 免疫法 3樣品的提取、分離法

10、代謝物極性大、水溶性強(qiáng)，ph緩沖系統(tǒng)分開(kāi) 尿液中藥物多以結(jié)合型存在，要進(jìn)行水解（酸水解、 酶水解，溶劑解） 第三章 生物樣品的預(yù)處理 一、生物樣品的采集與貯藏 體內(nèi)藥物分析常用的分析品種有血液、尿液、 唾液，也可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。 （一）樣品的采集 1血樣 血樣濃度與作用點(diǎn)的濃度密切相關(guān)，可以反 映靶器官的濃度。 血細(xì)胞 血漿（plasma） 血小板 血清 （serum） 血細(xì)胞 測(cè)定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃 抗凝 自然 全血 血液 2尿樣 目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利 用度 特點(diǎn)：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)水解分 離 3唾液 唾液中藥濃與血濃

11、相關(guān)性 收集方法 離心 收集 （二）樣品的貯藏 1血樣（血漿、血清）及時(shí)分離冷藏， -70加入穩(wěn) 定 劑naf 2尿樣 尿中水、無(wú)機(jī)鹽、尿素等細(xì)菌的生長(zhǎng)， 4保存 加入防腐劑 a1%甲苯 b飽和氯仿 cph改變 3唾液：同血樣 二、生物樣品的預(yù)處理 （一）預(yù)處理的目的 存在形式的多樣性 游離 結(jié)合 代謝物 濃度低，雜質(zhì)多（分離濃縮） 出現(xiàn)渾濁和沉淀 與試劑起反應(yīng) 影響色譜柱壽命 （二）處理方法選擇的一般原則 1藥物理化性質(zhì) pka 親脂性 揮發(fā)性 溶解度 光譜特征 穩(wěn)定性 2濃度范圍 靈敏的方法 3測(cè)定的目的 定性 定量 母體 代謝 4生物樣品的種類(lèi) 5樣品處理與分析方法的選擇 專(zhuān)一性 靈敏性

12、 （三）生物樣品去蛋白處理 1加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （nh4）2so4 nacl 2加入酸性沉淀劑 三氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白質(zhì)分子的陽(yáng)離子 形成不溶性鹽而，ph低于等電點(diǎn) 3組織酶消化法 加入酶使蛋白質(zhì)水解 優(yōu)點(diǎn)：平衡條件下進(jìn)行，可避免反應(yīng)和降解 可改善對(duì)蛋白結(jié)合率強(qiáng)的藥物的回收率 不產(chǎn)生乳化 4其他 加熱 超濾 （四）生物樣品綴合物水解 1酸水解 2酶水解 -葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 ph4.5-7.0 37 3溶劑解 某些藥物的硫酸酯，往往加入率取溶劑時(shí)發(fā)生分解， 同時(shí)提取有機(jī)溶劑中 （五）生物樣品的萃取 1液-液萃

13、取 （1）優(yōu)點(diǎn)：與雜質(zhì)分離 簡(jiǎn)便 濃集 提取率高 （2）提取率：在有機(jī)相與水相中的溶解度的比 值分配系數(shù)，一般少量多次，對(duì)生物樣品一般一 次萃取， 70%重現(xiàn)性 （3）影響提取率的因素 ph 堿性藥物在堿性ph 酸性 酸性ph 提取溶劑 相似相溶原理 沸點(diǎn)低，不影響 檢測(cè),性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學(xué)反應(yīng) 離子強(qiáng)度 加入中性鹽 增加離子強(qiáng)度，與 水結(jié)合強(qiáng)，便于有機(jī)溶劑提取 （4）離子對(duì)提取 對(duì)于離子性特強(qiáng)，水溶性極大的藥物，可采用離子對(duì)提 取 原理 應(yīng)用 陰離子：cooh+ so3h- 反離子 四丁基銨 陽(yáng)離子：nh2+ 反離子烷基或芳基磺酸鹽 （5）提取技術(shù) 一般在試管中進(jìn)行 有機(jī)相與水相比1:1或2

14、:1 （6）乳化問(wèn)題 措施 輕緩振搖 含有分散度大或不溶物應(yīng)過(guò)濾掉 避免在高ph條件下，從水中提取藥物 避免使用易發(fā)生乳化的溶劑 萃取劑水中加入少量nacl 破孔方法 機(jī)械法 加入少量高級(jí)脂肪醇 改變表面張力 改善混合溶劑比例，增加分散相分?jǐn)?shù) （7）藥物的吸附 玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯 硅烷 血漿 2液固萃取 固相萃取solid phase extraction spe 針管式 抽空減壓 加壓 過(guò)濾 （1）固相萃取步驟 固相選擇 樣品1ml 1ml規(guī)格固相 125ml 3ml規(guī)格固相 固相處理 反相c18 固定相的610倍體積甲醇洗柱，使溶劑化 610倍水緩沖服液沖洗達(dá)分

15、離狀態(tài) 上樣 分離 用適當(dāng)?shù)娜跞軇┫礈?洗去雜質(zhì)，通n2干燥固相 洗脫待測(cè)物 改變ph或極性 （2）影響固相萃取的因素 （1）流速 流速快，按觸不充分，樣品流失 回收率低 柱處理 510mlmin-1 洗脫 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg） （2）裝樣 過(guò)載 突破性試驗(yàn) 已知濃度樣品液 小體積上柱洗脫回收百分率 加大體積洗脫回收百分率 繪圖 當(dāng)回收率下降時(shí)為過(guò)載 （六）生物樣品的組分濃集 （七） 衍生化處理 gc衍生化 hplc衍生化 第四章 體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià) 一、分析方法 靈敏度專(zhuān)屬性 光譜法+剛開(kāi)始應(yīng)用較多雙波長(zhǎng)，導(dǎo)數(shù) 色譜法+hplc gc

16、 免疫法+疫交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性 根據(jù)藥物理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征，藥物濃度，干擾成分大 小，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 方法的建立 原始方法改進(jìn)創(chuàng)新 創(chuàng)立方法 1做好文獻(xiàn)總結(jié) 2充分了解藥物特征及體內(nèi)狀況 ph、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、 體內(nèi)代謝情況 3明確測(cè)定目的、要求 目的 4結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件 設(shè)備條件 預(yù)處理方法 藥濃監(jiān)測(cè) 藥代動(dòng)力學(xué)研究 母體藥物和代謝物 三、分析方法的建立 1純品進(jìn)行測(cè)定 確定線性范圍、靈敏度、反應(yīng)條件（ph、t、t） 2空白樣品測(cè)定 確定空白樣品是否有干擾 3以水代替空白樣品，加標(biāo)準(zhǔn)液后測(cè)定 了解提取率、檢測(cè)濃度 確定萃取條件、ph、揮發(fā)濃縮等 4空

17、白樣品加入標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 回歸方程 回收率 5實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定 四、分析方法的評(píng)價(jià) 可行性和可靠性 1準(zhǔn)確度 accuracy 測(cè)定結(jié)果與真實(shí)性的差異 用回收率表示 接近100% 相對(duì)恒定 絕對(duì)回收率 也稱(chēng)萃取回收率、提取回收率 測(cè)定血漿樣品中藥物濃度/相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液=絕對(duì)回收率 考慮3個(gè)濃度（高、中、低） 分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線成上、中、下 一般要求絕對(duì)回收率在70% 一般方法hplc內(nèi)標(biāo) 內(nèi)標(biāo)法時(shí)注意：藥物與內(nèi)標(biāo)用各自外標(biāo)法測(cè)定回收率應(yīng)相近， 差值10% 相對(duì)回收率 方法回收率 藥物系列濃度+血樣標(biāo)準(zhǔn)曲線 取高、中、低三濃度加入到空白血漿中，處理后 測(cè)定，與加入標(biāo)準(zhǔn)量相比，得方法回收率，測(cè)

18、 定值15%，定量限20% 注意問(wèn)題： a加入藥量與實(shí)際測(cè)定值相近 b加入物與實(shí)際存在狀態(tài)相近 c空白試驗(yàn) 與已確定方法進(jìn)行比較 2精密度precision 標(biāo)準(zhǔn)差sd 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)性偏差 rsd不大于15%，定量限不大于20% 日間精密度日內(nèi)精密度 3靈敏度（sensitivity） 檢測(cè)的最小量 （1）檢測(cè)限（lod） 從背景中檢測(cè)到的最小藥物濃度：s/n3的絕對(duì)量 lod=3n/s （n噪間 s被測(cè)物信號(hào)/單位重量） n=1mm 取2gml樣品，20l進(jìn)樣 峰度30mm lod=4ng （2）定量限(loq) 在一定精密度和準(zhǔn)確度前提下求得最低檢 測(cè)量，通常以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)作為一定量限， 也可s/n=10作為定量限，實(shí)際測(cè)定時(shí)，滿(mǎn)足 35個(gè)半衰期濃度，或cmax1/101/20 （3）最低檢測(cè)濃度 可以進(jìn)行定量測(cè)定的某一藥物的最低濃度，它與 樣品