免疫組化HE染色FISHISH

1、現階段開展的病理實驗 主要內容： 免疫組化 HE染色 幾種特殊的染色 原位雜交 熒光原位雜交 免疫組化 1、免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標 記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細 胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為 免疫組織化學。 2、我們現階段主要要做的組織免疫組化有石蠟切片、冰凍切片免疫組 化以及熒光免疫組化。細胞免疫組化有細胞爬片、細胞印片和細胞涂 片免疫組化和熒光免疫組化。 3、免疫組化過程中抗原修復有高壓修復法、酶修復、微波修復，其中 微波修復抗原對提高免疫組化陽性檢出率非常有效。 4、高壓修復和微波

2、修復法中常用的緩沖液有0.01M檸檬酸緩沖液、1mM 的EDTA（pH8.0）。 6、酶標抗體系統中的酶與顯色劑、復染液的合理選用： （1）辣根過氧化物酶系統（HRP）顯色劑一般用DAB、AEC,DAB顯色液一 般染色部位為棕黃色，AEC顯色液一般染色部位為紅色；而HRP系統常 用的復染液為蘇木素，將細胞核染成藍色。 （2）堿性磷酸酶系統（AP）顯色劑一般用BCIP/NBT、固紅、固藍。最常 用的是BCIP/NBT顯色液，染色部位為深藍色或者藍紫色；該系統常用 的復染液為核固紅，將細胞核染成紅色。 免疫組化切片組織前期處理 1、組織塊大小應限于2cm1.5cm0.2cm 。 2、應用于光鏡的免

3、疫組織化學染色的切片厚度一般要求5m左右，神經 組織的研究要求切片厚度在20-100m，有利于追蹤神經纖維的走行。 3、石蠟切片為常規(guī)制片技術，切片厚度27m，應用范圍廣，不影響 抗體的穿透性，染色均勻一致。 4、組織的固定：4%多聚甲醛固定一般1-2小時。固定后經充分的流水沖 洗后進行脫水包埋。 5、組織脫水：主要用不同梯度的酒精進行脫水。一般情況下，組織經過 70，80，90，95，以至無水酒精的脫水程序，即可達到脫 水的要求。但是為了能使大量的組織塊同時進行脫水，則要求保持液 體的濃度以保證脫水的作用，最好是以兩次95酒精，兩次100酒 精重復進行脫水，以保證組織的水分脫凈。 6、組織透

4、明：我們一般采用二甲苯透明，30-60min即可。 5、石蠟切片：浸蠟、包埋過程中，石蠟應保持在60以下，以熔點低的 軟蠟較好,浸蠟時間14小時 。 6、冰凍切片：組織采用液氮法包埋。將未固定的組織放入OCT包埋劑中 對組織進行液氮包埋，包埋后放在-80度冰箱中貯存或者對其進行切 片?；蛘邔⒔M織置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高滲吸收組織 中水分，減少組織含水量，再放入OCT包埋劑中進行包埋。 7、切片的固定：冰凍切片、細胞切片常用固定液為4 丙酮或者4%多 聚甲醛，固定10-30min。 石蠟切片免疫組化 1、石蠟切片脫蠟至水。 2、3% H2O2室溫孵育5-10min，以消除內源

5、性過氧化物酶的活性，水 洗，5min3次。 3、根據客戶抗體要求進行修復，PBS沖洗，2min3次。 4、5-10% 正常山羊血清封閉（5%BSA封閉20-30min），室溫孵育 20-30min。傾去血清，勿洗。 5、滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液（PBS配制），37孵育 1-2小時或4過夜。（室溫20-30min，再放于37孵育20-30min） 6、PBS沖洗，2min3次。 7、滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗，37孵育10-30min。 8、PBS沖洗，2min3次。 9、滴加即用型SABC，37孵育10-30minPBS沖洗，5min4次。 10、顯色劑顯色（DAB或AEC）。

6、 11、自來水充分沖洗，復染（蘇木素），脫水透明，封片。 返回 B 石蠟切片免疫組化DAB顯色 血涂片，細胞，冰凍切片免疫組化 1、冰凍切片4-8m，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內， 或進行短暫預固定后儲存于-20冰箱。 2、室溫放置30min后，放入4丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。 PBS沖洗5min3次。 3、30%過氧化氫1份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30min，以滅活內源性 過氧化物酶。蒸餾水洗2次。 4、其余步驟和石蠟切片免疫組化4-11步相同。 注：如果冰凍切片直接染色結果不理想時，可以參照石蠟切片對切片進 行熱修復，方法和石蠟切片3-11步相同。 石蠟

7、切片熒光免疫組化 1、 石蠟切片脫蠟至水。 2、與石蠟切片免疫組化3-8的步驟相同。 3、加入SABC-FITC, 37孵育10-30min，PBS沖洗， 5min4次。 4、抗熒光萃滅封片液 封片，熒光顯微鏡觀察。 冰凍切片熒光免疫組化 1、冰凍切片4-8m，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰 箱內，或進行短暫預固定后儲存于-20冰箱。 2、室溫放置30min后，放入4丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。 PBS沖洗5min3次。 3、5-10% 正常山羊血清封閉，室溫孵育10-30min。傾去血清，勿洗。 4、滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37孵育1-2小時或4 過夜。

8、5、PBS沖洗，5min3次。 6、滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗，37孵育10-30min；或滴 加第二代生物素標記二抗工作液，37或室溫孵育10-20min。 7、PBS沖洗，5min3次。 8、滴加SABC-FITC,37孵育10-30min，PBS沖洗5min3次。 9、抗熒光萃滅封片液 封片，熒光顯微鏡觀察。 細胞爬片免疫組化 1、取出培養(yǎng)皿，用PBS漂洗2min2次. 2、4冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的細胞爬片，室溫10-30分鐘。PBS 漂洗2min3次。0.5%TritonX-100室溫處理20min。PBS洗2min3 次，3%過氧化氫室溫處理15min，PBS洗2min3

9、次。 3、血清封閉：室溫 10-30分鐘，傾去。 4、一抗：37 1小時或4度過夜 5、0.1M PBS 洗三次-每次三分鐘。 6、相應的生物素化二抗37 30-40分鐘。 7、0.1MPBS 洗三次-每次三分鐘。 8、鏈酶卵白素-堿磷酶復合物或過氧化物酶標記鏈酶卵白素37 40min。 9、NBT/BCIP或DAB顯色，核固紅或蘇木素復染。 10、切片經梯度酒精脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹膠封片； 注意事項：注意事項： 1、良好的細胞爬片是進行免疫組織細胞的基礎，要獲得良好細胞爬 片須注意以下： （1） 對于粘附分子較少的細胞爬片時間要達5天以上，這樣細胞爬 片才較牢固，沖洗時不易脫片；

10、 （2） 接種的細胞密度適中，以2*104/ml為宜，若細胞密度太高，5天 后細胞連接成片沖洗時易脫片； 2、冰丙酮固定后玻片可密閉保存于4度冰箱，冰丙酮固定時會使細胞 收縮，可用80%冰丙酮或4%多聚甲醛固定。 3、沖洗時只須輕輕振蕩培養(yǎng)皿，（不可用吸管太用力吹，易脫片） 4、加一抗、二抗后沖洗時第一次須將玻片傾斜 5、Triton X-100（曲拉通）表面活性劑，脫去細胞膜中最主要的成分 脂質，對于抗原表達在胞漿或胞核者方使用，對于抗原表達在胞漿者 時間要控制好，使其破壞細胞膜而核膜破壞較少。 免疫組化中常用的固定液 1. 冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。 將純的丙酮預先放入冰箱-20后

11、便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會為固體的）細 胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20（丙酮有很強的揮發(fā)性，注意將 含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發(fā)）固定10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放 入-20保存。 2. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決 定簇(CD)、主要組織相容性抗原等 室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20保存 3. 95乙醇，可用于免疫組化。 優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存較好。 缺點：醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質保存效果較差，使蛋白變

12、性的作用 輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度 室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20保存 4. 甲醛(福爾馬林)應用最廣 優(yōu)點：形態(tài)結構保存好，且穿透性強， 缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間交聯形成的網 格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染 色結果。 返回 HE染色 蘇木精 伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining ，HE)是石蠟 切片技術里常用的染色法之一 。HE染色法是組織學、胚胎學、病理 學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術方法。 HE染色的原理

13、：脫氧核糖核酸（DNA）兩條鏈上的磷酸基向外，帶 負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結合 而被染色。伊紅是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷 的陰離子，與蛋白質的氨基正電荷的陽離子結合使胞漿染成紅色或粉 紅色，與藍色的細胞核形成鮮明對比。 石蠟切片HE染色步驟： 1、脫蠟水合。 2、蒸餾水洗5min3次。 3、蘇木素染液染色，鏡下控制染色時間。 4、水洗玻片上多余染液，0.5-1%鹽酸酒精分色數秒。 5、流水沖洗15-30s，細胞核呈藍色。 6、0.5%伊紅染液染色1-5min。蒸餾水浸泡5min。 7、風干，封片。 細胞爬片HE染色 1、取出細胞爬片，用PBS

14、洗滌3次。 2、樣品固定：95乙醇固定20min，PBS洗滌2次，每次2min。 3、其余步驟和石蠟切片3-7步相同。 冰凍切片HE染色 1、固定：固定1-2min。(配制方法：40%福爾馬林15 mL，95%乙醇80 mL，冰乙酸5 mL ) 2、其余步驟和石蠟切片2-7步相同。 染色結果：染色結果：細胞核呈藍色，胞漿呈紅色，紅細胞呈桔紅色， 其他部位呈深淺不同的紅色。 返 回 常用特殊染色 一、彈力纖維染色 1、彈性纖維主要由彈性蛋白（一種黃色硬蛋白，它是黃色彈性纖維組織 的主要成分，干燥時易脆，而濕潤時呈彎曲并富彈性）構成。新鮮時 它呈黃色，固又稱為黃色纖維。彈性纖維較細，直徑0.2-1

15、.0um，有 分支，不成束。但可交織成網。它富有彈性，容易拉長，但不能拉到 超過它的極限，外力除去后又恢復原狀。 2、彈性纖維染色的臨床應用 1）用于區(qū)別正常的動脈和靜脈以及觀察動脈有病變時血管壁各層的情況， 如動脈粥樣硬化時的各類變化。 2）用于區(qū)別觀察各種疾病對彈性纖維的影響及變化，如原發(fā)性或繼發(fā)性 高血壓可見主動脈彈力纖維增生，老年彈力纖維增多癥。心內膜彈力 纖維增生癥常都可見到彈力纖維斷裂，梅毒性主動脈炎和皮膚的環(huán)狀 肉芽腫，動脈粥樣硬化均可見到裂解，崩解的彈力纖維。 3）用于彈力纖維性假黃瘤的診斷。該病鏡下見真皮中下部結締組織變性， 呈團塊狀或條索狀，弱嗜堿性用彈力纖維染色法可以鑒別

16、。 3、彈性纖維的染色方法 ：維格特氏雷鎖辛品紅法 、Gomoris醛品紅法 、 地衣紅技術、費爾霍夫氏酒精蘇木素技術。 二、Masson染色 Masson染色,用于顯示組織中纖維的染色方法之一。一般的Masson 染色用的是三色法，苯胺藍染液使膠原纖維、粘液、軟骨呈藍色(如 光綠液染色為綠色)，Masson 麗春紅酸性復紅液使胞漿、肌肉、纖維 素、神經膠質呈紅色，Regaud 氏蘇木精染液使細胞胞核黑藍色。 三、網狀纖維染色 1、網狀纖維在組織化學上的反應、網狀纖維在組織化學上的反應 網狀纖維的主要成分是網硬蛋白，在組織化學上，網狀纖維和膠原纖 維是容易區(qū)別的。網狀纖維是分支纖細的纖維。Va

17、n Gieson 氏染色 不顯色或微紅色。PAS反應呈現紅紫色，銀浸染為黑色。膠原纖維用 Van Gieson氏染色為紅色，PAS反應呈微粉紅色。銀浸染為黃色或棕 黃色。 2、臨床應用臨床應用 1）可用于區(qū)別癌和肉瘤的診斷。例如：網織細胞肉瘤和轉移于淋巴結內的未分 化癌，這兩者在HE的染色切片都較難區(qū)別，前者可產生網狀纖維，后者不產 生網狀纖維。鼻咽部活柱，應將網染作為常規(guī)，給予使用，可增加診斷的準 確性。 2）可用于區(qū)別血管內皮瘤（肉瘤）和血管外皮瘤（肉瘤），它的瘤細胞在網狀 纖維膜內，而血管外皮瘤則在網狀纖維膜外，血管內皮肉瘤的瘤細胞呈泡巢 狀，周圍多被網狀纖維包繞；而血管外皮肉瘤的瘤細胞

18、可見較多的網狀纖維。 3）可用于神經系統方面腫瘤的區(qū)別。如：交感神經母細胞，腦的髓母細胞瘤， 這些腫瘤的形態(tài)有時象肉瘤，但銀染時，神經系統的網染為陰性，不過腦的 原發(fā)性肉瘤有較多的網狀纖維。 4）可用于觀察癌組織的發(fā)生發(fā)展過程。如：原位癌，可見有完整的基底膜，而 浸潤性癌則可見到被破壞的基底膜。 5）可用于區(qū)別淋巴系統方面的腫瘤。如：淋巴肉瘤和網織細胞肉瘤，前者瘤細 胞間的網狀纖維比正常稍減少，后者則比正常時增多。 6）可用于急性骨髓纖維化的鑒別診斷，該病的網狀纖維增多，纖維可以是致密 和融合性的。膠原纖維染色通常呈陰性，盡管偶爾有的病例可能顯示膠原纖 維化。 四、Van Gieson染色 1

19、、結果：膠原纖維染成鮮紅色；肌纖維染成黃色；紅細胞 染成黃色；細胞核染成藍黑或灰色。 2、臨床應用：膠原纖維發(fā)生病變如壞死或透明變性時，它與淀粉樣物在 HE染色時被染為粉紅色，不好區(qū)別。應用V.G染色法，能將膠原纖維 染為粉紅色，而淀粉樣物將被染為黃色。 返回 敏感性加強型原位雜交（AP） 原位雜交(ISH)是一種可在細胞涂片、組織切片以及分 裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA的技術，此方法原理是 由DNA或RNA的序列與互補的標記單鏈DNA/RNA探針結 合形成標記的雙鏈雜交分子，本技術可對組織細胞原位的 待測核酸分子進行定性，定量及定位分析。在細胞分化調 節(jié)、基因定位、腫瘤遺傳學、分子病理

20、學、病毒學等領域 得到廣泛應用。敏感性加強型原位雜交（AP）僅適應于 地高辛高效標記的寡核苷酸探針。 一、培養(yǎng)細胞和冰凍切片 1、培養(yǎng)好的細胞用0.1MPBS洗2min 3次。 2、培養(yǎng)細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：4%多聚甲醛， 室溫固定20-30min。蒸餾水洗，干燥后-20 保存。 3、暴露mRNA核酸片段。 胃蛋白酶37 消化5-120s， 0.5M TBS洗滌5min 3次，蒸餾水洗滌1次。 4、預雜交 5、雜交 6、雜交后洗滌 7、滴加封閉液。37 30min 8、滴加生物素化鼠抗地高辛。 37 60min 9、0.5M TBS洗滌5min 4次。 10、滴加SABC-AP 3

21、7 20min。 0.5M TBS洗滌5min 4次。 11、BCIP/NBT顯色，核固紅復染。 13、風干，水溶性封片劑封片。 二、石蠟切片 1、常規(guī)脫蠟至水。 2、3%過氧化氫室溫處理10min，蒸餾水洗5min 2次. 3、暴露暴露mRNA核酸片段。 胃蛋白酶37 消化10-30min， 0.5M TBS洗滌5min 3次，蒸餾水洗滌1次。 4、其余步驟和冰凍切片4-13步相同。 三、結果觀察 陽性細胞的胞漿著色呈深藍色或藍紫色，細胞核著色呈紅色（圖片） 四、注意事項 1、石蠟切片水合時所用的不同濃度酒精用0.1%DEPC水配制。 2、緩沖液配制時要用滅菌水來配。 3、實驗過程中所用的3%檸檬酸需現配現用。 4、在冰凍切片原位雜交實驗中最重要的組織及細胞的及時固定，并 在固定液中加入0.1%的DEPC水處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解 作用。 5、石蠟切片脫蠟時要