HMGB1酸性尾端抗菌相關(guān)功能位點解析及以該分子為靶點的抗炎措施研究

1、HMGB酸性尾端抗菌相關(guān)功能位點解析及以該分子為靶點的抗炎措施研究第一部分HMGB酸性尾端抗菌相關(guān)功能位點解析研究目的：高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1,HMGB1)屬高遷移率族蛋白超家族成員，由A box、B box 及酸性尾端三個結(jié)構(gòu)域組成 , 其廣泛存在于真核細胞核內(nèi) , 也可存在于胞漿 及細胞外等多個部位 , 在機體正常生理活動維持和某些疾病狀態(tài)下發(fā)揮多種重要 功能。相對于其他功能而言，抗菌活性是HMGB的一項新功能。我們前期在對HMGB功能機制進行研究時發(fā)現(xiàn)：重組人HMGB具有抗菌活性,然而缺失由30個氨基酸殘基組成的酸性尾端的突變體蛋白則喪失抗

2、菌能力 ; 另外, 我們還證實了 單獨的 A box 和 B box 不具有抗菌活性。因此,HMGB酸性尾端對其抗菌活性的發(fā)揮至關(guān)重要。 但是,針對我們獲得的 這一新發(fā)現(xiàn) , 至少還有兩個問題需進一步探討 ： 酸性尾端區(qū)域中參與抗菌作用的 詳細功能位點尚待解析 ; 單獨的酸性尾端是否即有抗菌能力還有待鑒定。本部分 實驗旨在尋找HMGB酸性尾端中抗菌相關(guān)功能位點，并觀察單獨酸性尾端的抗菌 活性。方法及結(jié)果:1.人HMGB酸性尾端不同位點缺失突變體的制備(1)用已克隆 于PUC19載體中測序正確的、編碼人HMGB的cDNA為模板,經(jīng)常規(guī)PCF或一步反 向PCR致突變策略分別擴增得到11種人HMGB

3、酸性尾端不同位點缺失突變體蛋 白的編碼序列,并成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒:PUC19/mHMGB1 -211-215PUC19/mHMGB1 -206-21、5PUC19/mHMGB1 -201-21、5PUC19/mHMGB1 -196-21、5PUC19/mHMGB1 -191-21、5PUC19/mHMGB1 -186-20、0PUC19/mHMGB1 -196-21、0PUC19/mHMGB1 -196-20、5PUC19/mHMGB1 -198-20、7PUC19/mHMGB1 -201-21、0PUC19/mHMGB-2101-205 。 (2) 將上述測序正確的各突變體編碼序列分別亞克

4、隆到 適于表達毒性蛋白的原核表達載體 PQE-80L中,成功地構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒 pQE-80L/mHMGB1 -211-21、5 pQE-80L/mHMGB1 -206-21、5 pQE-80L/mHMGB1 -201-215、PQE-80L/mHMGB1 -196-21、5 PQE-80L/mHMGB1 -191-21、5PQE-80L/mHMGB-186-200 、PQE-80L/mHMGB1-196-21、0PQE-80L/mHMGB-196-205 、PQE-80L/mHMGB1 -198-20、7 PQE-80L/mHMGB1 -201-21、0 PQE-80L/mHMGB1-

5、201-205 。 (3)將上述重組原核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5x ,在終濃度 0.5mmol/L 的 IPTG、37C誘導(dǎo)表達 3h。SDS-PAG分析可見,目的蛋白相對分子質(zhì)量均在 30kDa- 25kDa之間,均主要以分泌形式表達。經(jīng)Ni2+-NTA系統(tǒng)有效純化后,我們成功的制備了 11種人HMGB1酸性尾端不同位點缺失的突變體蛋白 :mHMGB1 -211-215、 mHMGB1 -206-21、5 mHMGB-2101-215、 mHMGB-196-215、 mHMGB-191-215 、mHMGB-186-200、mHMGB1-196-210 、 mHMGB1 -196-2

6、0、5 mHMGB1 -198-20、7 mHMGB1 -201-21、0 mHMGB1 -201-205。2.人HMGB酸性尾端不同位點缺失突變體抗菌功能的檢測與比較體外抗菌實驗(試管稀釋法、瓊脂擴散法)結(jié)果證實:11種人HMGB酸性尾端不同位點 缺失突變體中 mHMGB-1211-215、 mHMGB-1206-215、 mHMGB-186-200 對金黃色 葡萄球菌、大腸桿菌JM109 ATCC25922 DH5x具有不同程度的抗菌活性,其中對DH5X抗菌活性最弱；而對綠膿桿菌則無此抗菌活性。其余突變體抗菌活性均消失。上述實驗結(jié)果表明：人HMGB酸性尾端中201-205氨基酸殘基對其抗菌

7、功能的發(fā)揮至關(guān)重要。3.人工合成的人HMGB酸性尾端抗菌活性研究(1)人工合成30個氨基酸殘基組成的人HMGB酸性尾端肽段。(2) 體外抗菌實驗 (試管稀釋法、瓊脂擴散法 )結(jié)果顯示： 該肽段對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109 ATCC25922 DH5x具有不同程度的抗菌活性,其中對DH5 a抗菌活性最弱；而對綠膿桿菌則無此抗菌活性。因此，單獨的人HMGB酸性尾端肽段即具有抗菌活性。結(jié)論：1.人HMGB酸性尾端中201-205氨基酸殘基在抗菌 活性的發(fā)揮中起至關(guān)重要的作用。2.人工合成30個氨基酸殘基組成的人HMGB酸性尾端肽段對部分細菌具有明確的抗菌活性，從另一側(cè)面證實HMGB的酸性尾端

8、對其抗菌功能的發(fā)揮至關(guān)重 要。第二部分HMGB為靶點的抗炎措施研究研究目的:HMGB1是一種具有寬治療 窗口期的關(guān)鍵炎癥因子 , 在多種急、慢性炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著極為 重要的作用 , 目前以該分子為靶標的抗炎措施越來越受到人們的關(guān)注?，F(xiàn)有研究 證實,其發(fā)揮致炎作用的主要功能域為 B box。然而,體外表達的單獨A box能抑制HMGB致炎活性，有明確的抗炎功能。同時,酸性尾端具有調(diào)節(jié)A box、B box結(jié)構(gòu)和功能的作用。如果能將 HMGB具有抗炎功能的A box與具有抗菌功能的酸性尾端融合就有可能得到兼具抗炎、抗菌雙 功能的衍生分子。又有研究顯示，被分泌至細胞外的HMGB除是一種

9、重要的炎癥細胞因子外， 還參與激活機體自身免疫系統(tǒng) , 與多種自身免疫性疾病密切相關(guān)。中藥提純單體 青藤堿 （sinomenine,SIN） 具有抗炎、免疫抑制等藥理作用 , 廣泛應(yīng)用于臨床治療 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、干燥綜合征（SS）等慢性炎性自身 免疫性疾病,并取得較好療效。然而,SIN是否可影響HMGB表達目前尚未見報道。本部分實驗以HMGB為靶點,制備由HMGB1 A box及酸性尾端組成的兼具抗炎、抗菌雙功能的衍生分子；同時研究SIN對HMGB表達的影響,并初步探討其可 能機制。方法及結(jié)果：1.HMGB1 A box和酸性尾端融合分子的制備（1）以克隆于

10、pUC19載體中測序正確的、編碼人HMGB的cDNA為模板,經(jīng)一步反向PCR在缺失B box編碼序列的同時,將A box與酸性尾端的編碼序列直接相連(此連接為剛性連接)，命名為PUC19/rHMGBA+l；(2)再用上述克隆于pUC19載體上測序正確的、 處于剛性連接的A box與酸性尾端編碼序列為模板,經(jīng)多次一步反向PCF在A box與酸性尾端編碼序列之間引入一個柔性連接子 (Gly4Ser)3 的編碼序列 (此連接為柔性連接 ), 命名為 pUC19/rHMGB1 A+Linker+T。(3) 將測序正確的 A box 與酸性尾端剛性、柔性連接融合分子編碼序列分別 亞克隆于原核表達載體PQ

11、E-80L，分別命名為PQE-80L/rHMGB1 A+TPQE-80L/rHMGB1A+Linke葉T,并在大腸桿菌 DH5x中進行誘導(dǎo)表達上述融合蛋白。SDS-PAG分析可見，兩融合蛋白的相對分子質(zhì)量分別約為 16kDa和18kDa。經(jīng)Ni2+-NTA純化系統(tǒng),兩融合蛋白得到有效純化，純化后的目的蛋白在SDS-PAG上均呈現(xiàn)單一條帶。2.HMGB1 A box和酸性尾端融合分子抗炎功能的鑒定與比較(1)體外抗炎實驗證實,兩融合蛋白與單獨A box類似均能抑制重組HMGB誘導(dǎo)的人單核細胞THP-1分泌炎癥因子腫瘤壞死因子 a(TNF-a)和白細胞介素6(IL-6),兩融合蛋白抑制炎癥因子作用

12、均比單獨的 A box強,且柔性連接的融合蛋白抗炎能力是三者中最強的。(2)在LPS誘導(dǎo)的小鼠內(nèi)毒素血癥模型(模擬內(nèi)毒素引起的系統(tǒng)性炎癥) 中兩融合蛋白均能降低血清炎癥因子 TNF-a、 IL-6 的濃度并能提高小鼠的存活率 ;同體外實驗結(jié)果類似柔性連接的融合蛋白降低血清中炎癥因子濃度及提高小鼠 存活率作用更強。3.HMGB1 A box和酸性尾端融合分子抗菌功能的檢測與比較體外抗菌實驗(試管稀釋法、瓊脂擴散法)結(jié)果顯示,A box與酸性尾端剛性連接和柔性連接兩融合蛋白均能不同程度抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(JM109、ATCC25922 DH5x)生長，但二者的抑制細菌生長能力并無統(tǒng)計學(xué)差

13、異；均對綠膿桿菌無抗菌活性。4.鹽酸青藤堿抑制基礎(chǔ)水平和LPS誘導(dǎo)的HMGB表達在人內(nèi)皮細胞EA.hy926中鹽酸青藤堿可抑制基礎(chǔ)水平的 HMGB1 mRNAg白質(zhì)表達,且呈劑量依賴性。 在人內(nèi)皮細胞EA.hy926中鹽酸青藤堿可抑制LPS誘導(dǎo)水平的HMGB1mRNA口蛋白質(zhì)表達,且呈劑量依賴性。5.鹽酸青藤堿抑制HMGB基因啟動子活性 成功克隆到具有活性的HMGB基因5上游啟動子區(qū)域(-2484+200),并構(gòu)建 長度不同的HMGB基因啟動子區(qū)域截短突變體(-1998+200、-1598+200、-1198+200、 -798+200、 -397+200) 報告基因檢測質(zhì)粒。熒光素酶(Luc)報告基因檢測實驗結(jié)果知,鹽酸青藤堿可抑制-2484+200、 -1998+200、-1598+200、-1198+200報告基因質(zhì)粒啟動子活性 ,但對-798+200、 -397+200報告基因質(zhì)粒啟動子活性無影響，此結(jié)果表明HMGB基因5上游啟動子區(qū)域-1198-