氨基酸藥物課件

1、1 第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥物的基本概念氨基酸類藥物的基本概念 一、氨基酸類藥物的基本知識一、氨基酸類藥物的基本知識 從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有180180多種多種，但是但是 參與蛋白質組成的常見氨基酸或稱基本氨基酸只有二參與蛋白質組成的常見氨基酸或稱基本氨基酸只有二 十種。十種。19861986年年發(fā)現(xiàn)第21種 硒代胱氨酸硒代胱氨酸 最近發(fā)現(xiàn)第22種 遺傳基因編碼的氨基酸 吡咯賴氨酸。吡咯賴氨酸。 180多種天然氨基酸大多數(shù)是不參與蛋白質組成的， 這些氨基酸被稱為非蛋白質氨基酸非蛋白質氨基酸。 氨基酸是構成機體蛋白質的基本單位基本單位，且構成生 物體蛋白質的

2、氨基酸都是-氨基酸氨基酸，除外，-碳原碳原 子子均為不對稱碳原子不對稱碳原子，具有立體異構現(xiàn)象立體異構現(xiàn)象，均是L-L-型型 氨基酸氨基酸。 2 1 1、分類：、分類： （1 1）根據(jù)氨基酸在pH5.5pH5.5溶液中帶電狀況分為酸性、酸性、 中性及堿性中性及堿性氨基酸三類。 （2 2）依R R基團基團差異亦分為： 脂肪族脂肪族氨基酸、芳香族芳香族氨基酸及雜環(huán)雜環(huán)氨基酸三類三類 其中L-L-組氨酸、組氨酸、L-L-色氨酸、色氨酸、L-L-脯氨酸及脯氨酸及L-L-羥脯氨羥脯氨 酸酸為雜環(huán)氨基酸雜環(huán)氨基酸， L-L-酪氨酸及酪氨酸及L-L-苯丙氨酸苯丙氨酸為芳香族氨基酸芳香族氨基酸， 其余均為脂肪

3、族氨基酸脂肪族氨基酸。 3 2 2、性質：、性質： （1 1）物理通性：）物理通性： 天然氨基酸純品均為白色結晶性粉末白色結晶性粉末，熔點及分熔點及分 解點解點均在200200以上以上。 在有機溶劑有機溶劑中溶解度一般較小。 均為兩性電解質均為兩性電解質，各有一定等電點等電點。除甘氨酸外 都有旋光性旋光性。 氨基酸氨基酸能使水的介電常數(shù)增高,而一般的有機化 合物乙醇、丙酮等卻使水的介電常數(shù)降低介電常數(shù)降低。是以離子離子 晶格晶格組成，而一般的有機化合物是由分子晶格分子晶格組成的。 4 （2 2）化學通性：）化學通性： -氨基酸氨基酸共同的化學反應有兩性解離兩性解離及林海定反林海定反 應應(ni

4、nhyding reactiong) (ninhyding reactiong) 、?；?、烷基化、酯化、酰化、烷基化、酯化、 酰氯化、酰胺化、疊氮化、脫羧及脫氨反應、肽鍵結酰氯化、酰胺化、疊氮化、脫羧及脫氨反應、肽鍵結 合反應及與甲醛和亞硝酸的反應合反應及與甲醛和亞硝酸的反應等。 特殊基團反應特殊基團反應： 酪氨酸的酚羥基酪氨酸的酚羥基可產(chǎn)生米倫反應米倫反應與福林達尼斯福林達尼斯反 應； 精氨酸的胍基精氨酸的胍基產(chǎn)生坂口反應坂口反應； 5 色氨酸色氨酸的吲哚基吲哚基與芳醛芳醛產(chǎn)生紅色反應紅色反應； 組氨酸的咪唑基組氨酸的咪唑基產(chǎn)生PaulyPauly反應反應； 苯丙氨酸硝化后于堿性條件下苯丙氨

5、酸硝化后于堿性條件下產(chǎn)生桔黃色反應桔黃色反應； 胱氨酸及半胱氨酸胱氨酸及半胱氨酸經(jīng)酸或堿破壞后可與醋酸鉛醋酸鉛產(chǎn) 生鉛黑反應鉛黑反應； 半胱氨酸半胱氨酸在堿性條件下與亞硝基鐵氰化鈉（硝普亞硝基鐵氰化鈉（硝普 鹽）鹽）反應生成紫紅色化合物紫紅色化合物。 色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸均有特征紫外吸收光紫外吸收光 譜譜，色氨酸色氨酸最大吸收波長為279nrn279nrn，苯丙氨酸苯丙氨酸為 259nm259nm，酪氨酸酪氨酸為278nm278nm。但構成天然蛋白質的20種 氨基酸在可見光區(qū)均無吸收可見光區(qū)均無吸收。 6 氨基酸的上述理化性質是蛋白質與氨基酸合成、合成、 轉化轉化、

6、分離純化分離純化及定性定量檢測的依據(jù)定性定量檢測的依據(jù) 二、氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應用二、氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應用 1 1、氨基酸是構成蛋白質的基本組成單位基本組成單位，故生物體 中眾多蛋白質的生物功能生物功能，無不與構成蛋白質的氨基 酸種類、數(shù)量、排列順序種類、數(shù)量、排列順序及由其形成的空間構象有密空間構象有密 切的關系切的關系。因此氨基酸對維持機體蛋白質的動態(tài)平衡維持機體蛋白質的動態(tài)平衡 有極其重要的意義。生命活動中人及動物通過消化道 吸收氨基酸 。 通過體內(nèi)轉化體內(nèi)轉化而維持其動態(tài)平衡動態(tài)平衡，若其動態(tài)平衡失 調，則機體代謝紊亂代謝紊亂，甚至引起病變病變。 7 2 2、許多氨基

7、酸尚有其特定的藥理效應、許多氨基酸尚有其特定的藥理效應。 （）氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療的關系（）氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療的關系 氨基酸為構成天然蛋白質的基本單位，故蛋白質營蛋白質營 養(yǎng)價值養(yǎng)價值實際是氨甚酸作用氨甚酸作用的反映。健康人靠膳食膳食中的 蛋白質獲取各種氨基酸滿足機體需求。缺乏蛋白質則 影響機體生長及正常生理功能，抗病力減弱抗病力減弱引起病變病變。 消化道功能嚴重障礙者消化道功能嚴重障礙者及手術后病人手術后病人常因禁食無法 獲得足夠蛋白質，自身蛋白質過量消耗，致使營養(yǎng)不營養(yǎng)不 良而導致病情惡化或預后不良良而導致病情惡化或預后不良。 8 臨床上常通過直接輸入氨基酸制劑氨基酸

8、制劑改善患者營 養(yǎng)狀況，增加治療機會，促進康復。 賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸等亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸等8 8種氨基酸種氨基酸 必需氨基酸：必需氨基酸：人及哺乳動物自身不能合成，需由 食物供應。 半必需氨基酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）半必需氨基酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）可分 別由其他氨基酸（氨基酸（蛋氨酸和苯丙氨酸)產(chǎn)生產(chǎn)生，若食物 中提供了足夠的該氨基酸（氨基酸（氨酸及酪氨酸），可減少 對其他氨基酸（氨基酸（蛋氨酸及苯丙氨酸）的需求量。 9 氨基酸（精氨酸及組氨酸）合成速度較低氨基酸（精氨酸及組氨酸）合成速

9、度較低，通 常難以滿足需求，需由外界補充一部分。 （二）治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物（二）治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物 （三）治療肝病的氨基酸及其衍生物（三）治療肝病的氨基酸及其衍生物 （四）治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物（四）治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物 （五）用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物（五）用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物 （六）其它氨基酸類藥物的臨床應用（六）其它氨基酸類藥物的臨床應用 10 第二節(jié)第二節(jié) 氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法 1 1、 目前全世界天然氨基酸全世界天然氨基酸的年總產(chǎn)量在百萬噸百萬噸左 右，其中產(chǎn)量較大者有谷氨酸、蛋氨酸及

10、賴氨酸谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸，其 次為天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它們主要用用 于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中。 2 2、 目前構成天然蛋白質的20種氨基酸的生產(chǎn)方法 有天然蛋白質水解法、發(fā)酵法、酶轉化法及化學合成天然蛋白質水解法、發(fā)酵法、酶轉化法及化學合成 法等四種。法等四種。 3 3、 氨基酸及其衍生物類藥物衍生物類藥物已有百種百種之多，但主 要是以以2020種氨基酸為原料經(jīng)酯化、?；?、取代及成鹽種氨基酸為原料經(jīng)酯化、?；⑷〈俺甥} 等化學方法或酶轉化法生產(chǎn)。等化學方法或酶轉化法生產(chǎn)。 11 一、水解法一、水解法 （一）基本原

11、理與過程（一）基本原理與過程 以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質為原料，通過酸、酸、 堿或酶水解堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各 種藥用氨基酸的方法稱為水解法水解法。 目前用水解法生產(chǎn)的氨基酸有L-L-胱氨酸、胱氨酸、L-L-精氨精氨 酸、酸、L-L-亮氨酸、亮氨酸、L-L-異亮氨酸、異亮氨酸、L-L-組氨酸、組氨酸、L-L-脯氨酸脯氨酸 及及L-L-絲氨酸絲氨酸等。 水解法生產(chǎn)氨基酸的主要過程為水解、分離和結水解、分離和結 晶精制晶精制三個步驟。 12 1 1、蛋白質水解方法、蛋白質水解方法 目前蛋白質水解分為酸水解法、堿水解法及酶水酸水解法、堿水解法及酶水 解法三種。解法三種。 （

12、1 1）酸水解法）酸水解法 蛋白質原料用6 610mol10molL L鹽酸鹽酸或 8mol8molL L硫酸硫酸于110110120120（回流煮沸）水解1212 24h24h，除酸后即得多種氨基酸混合物。此法優(yōu)點是水 解迅速迅速而徹底徹底，產(chǎn)物全部為L-L-型氨基酸型氨基酸，無消旋作消旋作 用用。缺點是色氨酸色氨酸全部被破壞，絲氨酸及酪氨酸絲氨酸及酪氨酸部 分被破壞，且產(chǎn)生大量廢酸污染環(huán)境。 13 （2 2）堿水解法）堿水解法 蛋白質原料經(jīng)6mol6molL L氫氧化鈉或氫氧化鈉或 4mol4molL L氫氧化鋇氫氧化鋇于100100水解6h6h即得多種氨基酸混 合物。該法水解迅速而徹底，

13、且色氨酸不被破壞，但 含羥基或巰基羥基或巰基的氨基酸全部被破壞，且產(chǎn)生消旋作且產(chǎn)生消旋作 用用。工業(yè)上多不采用。 （3 3）酶水解法）酶水解法 蛋白質原料在一定pH和溫度條件下經(jīng) 蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽氨基酸和小肽的過程稱為酶水 解法。 此法優(yōu)點為反應條件溫和，無需特殊設備，氨基 酸不破壞，無消旋作用無消旋作用。缺點是水解不徹底水解不徹底，產(chǎn)物中 除氨基酸外，尚含較多肽類。工業(yè)上很少用該法生產(chǎn) 氨基酸而主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋白胨水解蛋白及蛋白胨。 14 2 2、氨基酸分離方法、氨基酸分離方法 氨基酸分離方法較多，通常有溶解度法溶解度法、等電點等電點 沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及

14、離子交換法沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法等。 （1 1）溶解度法）溶解度法 是依據(jù)不同氨基酸在水中或其它溶劑 中的溶解度差異溶解度差異而進行分離的方法。 胱氨酸和酪氨酸胱氨酸和酪氨酸均難溶于水，但在熱水中酪氨酸熱水中酪氨酸 溶解度較大，而胱氨酸溶解度變化不大胱氨酸溶解度變化不大，故可將混合 物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分開。 （2 2）特殊試劑沉淀法）特殊試劑沉淀法 系采用某些有機或無機試劑有機或無機試劑與 相應氨基酸形成不溶性衍生物不溶性衍生物的分離方法。 15 如鄰二甲苯鄰二甲苯-4-4-磺酸能與亮氨酸磺酸能與亮氨酸形成不溶性不溶性 鹽沉淀鹽沉淀，后者與氨水反應氨水反應又

15、可獲得游離亮氨酸游離亮氨酸； 組氨酸可與組氨酸可與HgC1HgC12 2形成不溶性汞鹽沉淀汞鹽沉淀，后者經(jīng)處 理后又可獲得游離組氨酸組氨酸； 精氨酸可與苯甲醛精氨酸可與苯甲醛生成水不溶性苯亞甲基精氨酸苯亞甲基精氨酸 沉淀，后者用鹽酸鹽酸除去苯甲醛苯甲醛即可得精氨酸。 16 （3 3）吸附法）吸附法 是利用吸附劑對不同氨基酸吸附力的差 異進行分離的方法。如顆粒活性炭顆?；钚蕴繉Ρ奖彼?、酪苯丙氨酸、酪 氨酸氨酸及色氨酸色氨酸的吸附力大于對其它非芳香族非芳香族氨基酸的 吸附力，故可從氨基酸混合液中將上述氨基酸分離出 來。 （4 4）離子交換法）離子交換法 是利用離子交換劑對不同氨基酸吸 附能力的差

16、異進行分離的方法。氨基酸為兩性電解質兩性電解質， 在特定條件下，不同氨基酸的帶電性質及解離狀態(tài)帶電性質及解離狀態(tài)不 同，故同一種離子交換劑對不同氨基酸的吸附力不同。 17 3 3、氨基酸的精制方法、氨基酸的精制方法 分離出的特定氨基酸中常含有少量其它雜質，需進 行精制，常用的有結晶和重結晶技術結晶和重結晶技術，也可采用溶解溶解 度法或結晶與溶解度法相結合的技術度法或結晶與溶解度法相結合的技術。 丙氨酸在稀乙醇或甲醇稀乙醇或甲醇中溶解度較小，且pIpI為為6.06.0， 故丙氨酸可在pH6.0pH6.0時，用5050冷乙醇冷乙醇結晶或重結晶 加以精制。 溶解度與結晶技術相結合溶解度與結晶技術相結

17、合的方法精制氨基酸。如在 沸水中苯丙氨酸苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若將含少 量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍體積（wv）的熱 水中，調pH4.0pH4.0左右左右，經(jīng)脫色過濾可除去大部分酪氨 酸；濾液濃縮至原體積的1 13 3，加2倍體積（vv） 的9595乙醇乙醇，4放置，濾取結晶， 18 用95%95%乙醇洗滌乙醇洗滌，烘干即得苯丙氨酸精品。 （二）用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝（二）用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝 絕大多數(shù)氨基酸均可采用酸水解法酸水解法生產(chǎn)，但目前由 于發(fā)酵方法及酶工程技術的迅速發(fā)展，僅有幾種氨基 酸仍采用酸水解法生產(chǎn)。現(xiàn)胱氨酸及亮氨酸生產(chǎn)為例。 1 1、L-L-

18、胱氨酸（胱氨酸（L-CystineL-Cystine，L-CysL-Cys2 2）的制備）的制備 （1 1）L-L-胱氨酸的結構與性質胱氨酸的結構與性質 L-胱氨酸存在于所有 蛋白質分子中，尤以毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白中含量最 多。其分子由兩分子半胱氨酸脫氫氧化脫氫氧化而成，結構為： 19 L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶體六角形或六角柱形晶體， 分解點分解點258261258261，pIpI為為5.055.05，25 25D D 為 為-232-232。 在2525水中溶解度為0.0110.011，在7575水中為0.0520.052。溶 于無機酸及無機堿，在熱堿液中

19、可被分解熱堿液中可被分解。不溶于乙乙 醇、乙醚及丙酮醇、乙醚及丙酮?？杀贿€原為還原為L-L-半胱氨酸半胱氨酸。 （2 2）工藝路線）工藝路線 20 （3 3）工藝過程）工藝過程 水解水解 110117水解7h（自100時計）后出料,玻 璃布過濾,收集濾液。 中和中和 直至pH4.8，靜置36h，滌綸布濾取沉淀，離心 甩干得L-胱氨酸粗品。 粗制粗制 升溫至6570，攪拌半小時，加活性炭16kg， 于8090保溫半小時，濾除活性炭。調濾液至 pH4.8，靜置結晶，吸出上清液后，底部沉淀經(jīng)離心 甩干得胱氨酸粗品（）。 21 精制精制 中和中和 升溫至70，加活性炭1.52.5kg， 85攪拌半小時

20、，過濾，加1.5倍體積蒸餾水，升溫 至7580，攪拌下用1212氨水氨水（化學純）中和至 pH3.5pH3.54.04.0，析出結晶，濾取胱氨酸結晶，蒸餾水洗 至無氯離子，真空干燥得L-胱氨酸成品。 （4 4）檢驗）檢驗 應為六角形或六角柱形白色結晶，含量在 98.5以上，干燥失重小于0.5，熾灼殘渣小于0.2 ，氯化物小于0.15，鐵鹽小于0.001，重金屬 小于20ppm。 22 含量測定含量測定： （5 5）作用與用途）作用與用途 L-胱氨酸具有增強造血機能、升高 白細胞、促進皮膚損傷的修復及抗輻射作用。臨床上 用于治療輻射損傷、重金屬中毒、慢性肝炎、牛皮癬 及病后或產(chǎn)后繼發(fā)性脫發(fā)。 2

21、3 2 2、L-L-亮氨酸（亮氨酸（L-LeucineL-Leucine，L-leuL-leu）的制備）的制備 （1 1）L-L-亮氨酸的結構與性質亮氨酸的結構與性質 L-亮氨酸存在于所有蛋 白質中，以玉米麩質及血粉玉米麩質及血粉中含量最豐富，其次在角角 甲、棉籽餅和雞毛甲、棉籽餅和雞毛中含量也較多。L-L-亮氨酸為人體必亮氨酸為人體必 需氨基酸之一需氨基酸之一，化學名稱為2-氨基-4-甲基戊酸或2- 氨基異己酸，分子式：C6H13NO2,分子量：131.17 ,結 構式： 24 L-LeuL-Leu自水及乙醇水及乙醇中得白色片狀結晶片狀結晶，pIpI 為為5.985.98，熔點為熔點為293

22、293，在2525水水中溶解度為2.19， 乙醇中為0.017;在7575水水中為3.82，在醋酸中為10.9， 不溶于乙醚。 （2 2）工藝路線：）工藝路線： 25 （3 3）工藝過程：）工藝過程： 水解、趕酸水解、趕酸 取6molL HC1 500L于1噸水解罐中， 投入100kg動物血粉，110110120120回流水解回流水解24h24h后，于 7080減壓濃縮至糊狀。加50L水稀釋后，再濃縮 至糊狀，如此趕酸趕酸三次，冷卻至室溫濾除殘渣。 吸附、脫色吸附、脫色 上述濾液稀釋1倍后，以每分鐘0.5L的 流速流進顆?；钚蕴恐?0180cm）至流出液出現(xiàn) 苯丙氨酸苯丙氨酸為止，用去離子水

23、以同樣流速洗至流出液 pH4.0為止，穿柱液與洗滌液合并。 26 濃縮、沉淀與解析濃縮、沉淀與解析 上述流出液減壓濃縮減壓濃縮至進柱液體 積的13，攪拌下加入110體積（vv）的鄰二甲鄰二甲 苯苯-4-4-磺酸，產(chǎn)生亮氨酸磺酸鹽沉淀磺酸，產(chǎn)生亮氨酸磺酸鹽沉淀。濾取沉淀并用2 倍體積（wv）去離子水攪拌洗滌兩次，抽濾壓干得 亮氨酸磺酸鹽。濾餅加2倍體積（wv）去離子水攪 勻，用用6mol/L 6mol/L 氨水中和至氨水中和至pH6pH68 8，70708080保溫攪保溫攪 拌拌1h1h，冷卻過濾。沉淀用2倍體積（wv）去離子水 攪拌洗滌兩次，過濾得亮氨酸粗品。 精制精制 L-亮氨酸粗品用40倍

24、體積（wv）去離子水 加熱溶解加熱溶解，加0.5活性炭于70攪拌脫色1h，過濾， 濾液濃縮至原體積的14，冷卻后即析出白色片狀亮 氨酸結晶。過濾收集結晶，用少量水洗滌、抽干， 7080烘干得L-亮氨酸成品。 27 （4 4）檢驗）檢驗 應為白色片狀結晶，含量98.5101.5%， 干燥失重不超過0.2，熾灼殘渣不超過0.4，氯化 物不超過0.05，鐵鹽不超過0.003%，重金屬不超過 0.0015，砷鹽不超過1.5ppm。 含量測定含量測定 （5 5）作用與用途）作用與用途 L-亮氨酸為人體必需氨基酸之一， 是各種氨基酸輸液的原料之一。 28 二、發(fā)酵法二、發(fā)酵法 （）基本原理與過程（）基本原

25、理與過程 1 1、發(fā)酵的基本原理、發(fā)酵的基本原理 生物化學中稱酵母無氧呼吸無氧呼吸過程為發(fā)酵發(fā)酵，反應過程 中電子供體與受體皆為有機物，有時電子受體為電子 供體的分解產(chǎn)物，氧化作用不完全，最終形成還原性 產(chǎn)物。 工業(yè)上，發(fā)酵發(fā)酵實質上是利用微生物細胞中酶的作用， 將培養(yǎng)基中有機物轉化為細胞或其它有機物的過程。 29 30 初生氨基酸：初生氨基酸：微生物通過固氮作用固氮作用、硝酸還原硝酸還原及 自外界吸收氨使酮酸氨基化酮酸氨基化成相應的氨基酸，或微生 物通過轉氨酶轉氨酶作用，將一種氨基酸的氨基轉移到另一 種酮酸酮酸上，生成的新氨基酸也稱為初生氨基酸。初生氨基酸。 次生氨基酸：次生氨基酸：在微生物

26、作用下，以初生氨基酸為初生氨基酸為 前體轉化成的其它氨基酸前體轉化成的其它氨基酸。 大多數(shù)氨基酸均可通過以初生氨基酸為原料的微生微生 物轉化物轉化作用而產(chǎn)生。 31 32 2 2、發(fā)酵法的基本過程、發(fā)酵法的基本過程 發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的基本過程包括培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制與 滅菌處理滅菌處理，菌種誘變與選育菌種誘變與選育，菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng)、滅菌滅菌及接種接種 發(fā)酵發(fā)酵，產(chǎn)品提取及分離純化等步驟。 現(xiàn)代生物工程采用細胞融合細胞融合技術及基因重組基因重組技術 改造微生物細胞，已獲得多種高產(chǎn)氨基酸高產(chǎn)氨基酸雜種菌株及 基因工程菌基因工程菌。 如用北京棒狀桿菌和鈍齒棒狀桿菌原生質體融合原生質體融合 形成的雜

27、種，其中7070雜種細胞雜種細胞產(chǎn)生兩親菌株所產(chǎn)生 的氨基酸氨基酸。 33 氨基酸發(fā)酵方式發(fā)酵方式主要是液體通風深層培養(yǎng)法，其 過程是由菌種試管培養(yǎng)逐級放大直至數(shù)噸至數(shù)百噸發(fā) 酵罐。發(fā)酵結束，除去菌體，清液用于提取、分離純提取、分離純 化和精制化和精制有關氨基酸，其分離純化、精制方法及過程 與水解法相同。 （二）發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝（二）發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝 構成動物、植物及微生物體所有蛋白質的氨基酸種 類與構型均無任何差異均無任何差異，但植物體內(nèi)所有氨基酸皆由 COCO2 2、氨和水合成、氨和水合成，動物體除8種必需氨基酸需從外界 攝取外，其余非必需氨基酸均可通過體內(nèi)氨基酸之

28、間 的轉化或碳水化合物中間代謝物而合成，而微生物利微生物利 用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。 34 目前絕大部分氨基酸絕大部分氨基酸皆可通過發(fā)酵法生產(chǎn)，其 缺點是產(chǎn)物濃度低，設備投資大，工藝管理要求嚴格， 生產(chǎn)周期長，成本高。本文僅以L-異亮氨酸及L-賴氨 酸直接發(fā)酵法為例，說明發(fā)酵法的基本過程。 1 1、L-L-異亮氨酸（異亮氨酸（L-IsoleucineL-Isoleucine，L-IleL-Ile）的制備）的制備 （1 1）L-L-異亮氨酸的結構與性質異亮氨酸的結構與性質：L-Ile存在子所有蛋 白質中，為人體必需氨基酸之一必需氨基酸之一，

29、分子式為C6H13NO2， 分子量為131.17，結構式為： 35 L-Ile在乙醇中形成菱形葉片狀或片狀晶體， 分解點為285286，L-Ile溶于熱醋酸溶于熱醋酸，在20乙 醇中溶解度為0.072，在25水中為4.12，在75水 中為6.08，不溶于乙醚溶于乙醚。 （2 2）工藝路線）工藝路線 36 （3 3）工藝過程）工藝過程 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基組成（種子培養(yǎng)基組成（% %）為：）為： 葡萄糖 2 尿素 0.3 玉米 漿 2.5 豆餅水解液0.1（以干豆餅計） pH6.5。 二級種子培養(yǎng)基另加菜籽油0.4，其余同一級種子 培養(yǎng)基。 一級種子培養(yǎng)：1000ml三解瓶中培養(yǎng)基裝量為

30、 200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床30 培養(yǎng)（沖程7cm，頻率105次min）16h。 二級種子培養(yǎng)：接種量3.5，培養(yǎng)8h，如此逐級 37 放大培養(yǎng)得足夠量菌種。 滅菌、發(fā)酵滅菌、發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)液組成（%）為: 硫酸銨 4.5 豆餅水解液 0.4，玉米漿 2.0 碳酸鈣 4.5 pH7.2，淀粉水解還原糖 初糖濃 度 11.5。 在5m3發(fā)酵罐中添加3噸發(fā)酵培養(yǎng)液，加熱至118 120，維持在1.1105Pa壓力，滅菌30min，立即通 冰鹽水冷卻至25。接入1 1菌種菌種（vv），維持180 轉min的攪拌速度，升溫至3031， 38 以0.2L（minL）通氣量發(fā)酵

31、60h，在2450h之間 不斷補加尿素至0.6，氨水至0.27。 除菌體、酸化除菌體、酸化 發(fā)酵結束后，發(fā)酵液加熱至100并維持10min，冷 卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5，過濾除沉 淀。 離子交換、吸附分離離子交換、吸附分離 上述濾液每分鐘以樹脂量1.5的流速進H十-型732 離子交換柱（40100cm），以100L去離子水洗柱， 再以60、0.5molL氨水按3L/min的流速進行洗脫， 分部收集洗脫液。 39 濃縮趕氨濃縮趕氨 合并pH312的洗脫液，7080減壓蒸餾、濃縮至 粘稠狀，加去離子水至原體積的14，再濃縮至粘稠 狀。如此重復三次。 脫色、濃縮、中和脫色、濃縮、中和

32、 上述濃縮物加去離子水至原體積的14，攪拌均勻， 加2molL鹽酸調pH3.5，加上1（wv）活性炭， 70攪拌脫色1h。濾除活性炭，濾液減壓濃縮至適當 體積，用2molL氨水調pH6.0，5沉淀過夜,過濾抽 千，105烘干得：L-異亮氨酸半成品。 40 精制、烘干精制、烘干 每10kg L-異亮氨酸半成品加8L濃鹽酸和20L去離子水， 加熱至80，攪拌溶解，加10kg氯化鈉至飽和，加工 業(yè)液堿調pH10.5，過濾，濾液用堿調pH 1.5，5放 置過夜。濾取沉淀，用80L，去離子水加熱至80攪 拌溶解，加適量氯化鈉氯化鈉和1%（wv）活性炭，70攪 拌脫色lh過濾，濾液減壓濃縮至適當濃度，用氨

33、水調 pH6.0，5放置結晶過夜。次日過濾收集結晶，抽干， 于105烘房中烘干得L-異亮氨酸成品。 （4 4）檢驗）檢驗 應為菱形葉片狀或片狀晶體，含量應為98.5 101.5，干燥失重不超過0.3，熾灼殘渣不大于含 量測定與L-亮氨酸的規(guī)定相同。 41 0.3%，氯化物不超過0.05，硫酸鹽不超過0.03， 鐵鹽不超過0.003,重金屬不超過0.0015，砷鹽不 超過1.5ppm。 （5 5）作用與用途）作用與用途 L-Ile為必需氨基酸，是復方氨基 酸輸液的重要成份之一。 2 2、L-L-賴氨酸（賴氨酸（L-LysineL-Lysine，L-LysL-Lys）的制備）的制備 （1）L-賴氨

34、酸的結構和性質 L-賴氨酸存在于所有蛋 白質中，為人體必需氨基酸之一人體必需氨基酸之一。分子量為146.20， 結構為： 42 L-LysL-Lys自乙醇水溶液中得針狀結晶針狀結晶，其鹽酸鹽為單斜鹽酸鹽為單斜 晶系白色粉末晶系白色粉末，無臭、味苦，熔點熔點263263264264，易溶 于水，幾乎不溶于乙醇和乙醚。PIPI為為10.5610.56， （2 2）工藝路線）工藝路線 43 （3 3）工藝過程）工藝過程 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 菌種為北京棒狀桿菌北京棒狀桿菌（corymebacterium perkinense） AS l.563。斜面培養(yǎng)基成分（）為斜面培養(yǎng)基成分（）為: : 葡萄糖0.

35、5，牛肉膏1.0，蛋白胨0.5，瓊脂2.0， pH7.0。 種子培養(yǎng)基成分（種子培養(yǎng)基成分（% %）為）為: : 葡萄糖2.0，磷酸氫二鉀0.1，硫酸鎂0.05，硫酸銨 0.4，玉米漿2.0，毛發(fā)水解廢液1.0，pH6.87.0， CaCO3 0.5。 1000ml三角瓶中種子培養(yǎng)基裝量200ml，接種一環(huán) 斜面培養(yǎng)菌種，30振搖（沖程7.6cm，頻率108次 min），培養(yǎng)16h。 44 二級種子培養(yǎng)接種量2.5，培養(yǎng)48h。如此逐級擴大 培養(yǎng)。 滅菌、發(fā)酵滅菌、發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)液成分（）為發(fā)酵培養(yǎng)液成分（）為 淀粉水解糖13.5，磷酸二氫鉀0.1，硫酸鎂0.05， 硫酸銨1.2，尿素0.4，

36、玉米漿1.0，毛發(fā)水解廢液1.0， 甘蔗糖蜜2.0，pH6.7，滅菌前加甘油聚醚lL（指5m3發(fā) 酵罐）。在5m3發(fā)酵罐中投入培養(yǎng)液3噸，在 1.01105Pa壓力下，加熱至118120滅菌30min， 立即通入冰鹽水冷卻至30，按10（vv）比例接 種，以1:0.6（vv）通氣量于30發(fā)酵4251h，攪 拌速度為180轉min。 45 發(fā)酵液處理：離心除菌體；發(fā)酵液處理：離心除菌體；80 80 加熱；加熱； 離子交換：銨型離子交換：銨型732732樹脂樹脂;PH=5.0;PH=5.0為飽和為飽和( (串聯(lián)串聯(lián)) ) 濃縮結晶：收集濃縮結晶：收集PH=8.0PH=8.014.014.0洗脫液（

37、氨水洗脫）洗脫液（氨水洗脫） 46 三、酶轉化法三、酶轉化法 （一）基本原理及過程（一）基本原理及過程 酶轉化法酶轉化法亦稱為酶工程技術酶工程技術，實際上是在特定酶特定酶 的作用下使某些化合物轉化某些化合物轉化成相應氨基酸相應氨基酸的技術。 酶工程法酶工程法與直接發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸之反應本質相本質相 同同，皆屬酶轉化反應，但前者為單酶或多酶的高密度單酶或多酶的高密度 轉化轉化，而后者為多酶低密度多酶低密度轉化。 酶工程技術酶工程技術工藝簡單，產(chǎn)物濃度高產(chǎn)物濃度高，轉化率及生轉化率及生 產(chǎn)效率產(chǎn)效率較高，副產(chǎn)物少。 固定化酶或細胞固定化酶或細胞可進行連續(xù)操作，節(jié)省能源和勞 務，并可長期反復使用。

38、47 （二）酶轉化法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝（二）酶轉化法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝 目前醫(yī)藥工業(yè)中，用酶工程法生產(chǎn)的氨基酸已有十十 多種多種。 DL-蛋氨酸、DL-纈氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-色氨 酸、DL-丙氨酸及DL-蘇氨酸等分別經(jīng)氨基?；覆鸱职被；覆鸱?獲得了相應的L-氨基酸，并已投入了工業(yè)化生產(chǎn)。 1 1、L-L-天冬氨酸及天冬氨酸及L-L-丙氨酸的制備丙氨酸的制備 （1 1）L-L-天冬氨酸及天冬氨酸及L-L-丙氨酸的結構與性質丙氨酸的結構與性質 L L天冬氨酸（天冬氨酸（L-Aspartic acidL-Aspartic acid，AspAsp）的結構）的結構 與性質與性質 L

39、-Asp存在于所有蛋白質分子中，含兩個羧基兩個羧基 和一個氨基，為酸性酸性氨基酸，分子式為C4H7NO4，分子 量為133.10，結構式為： 48 L-AspL-Asp的化學名稱為-氨基丁二酸或氨基琥珀 酸，純品為白色菱形葉片狀結晶菱形葉片狀結晶，等電點為等電點為2.772.77， 熔點為269269271271。溶于水及鹽酸溶于水及鹽酸，不溶于乙醇及不溶于乙醇及 乙醚乙醚，在2525水中溶解度為水中溶解度為0.80.8，在，在7575水中為水中為 2.882.88，在乙醇中為0.00016。在堿性溶液中為左旋性左旋性， 在酸性溶液中為右旋性右旋性。25D 為 +5.05（C 0.52.0，在

40、水中）， 25D為 +25.4（C 0.52.0，在5molL HCl中）。 49 L-L-丙氨酸（丙氨酸（L-AlanineL-Alanine，簡稱，簡稱L-AlaL-Ala）的結構與性）的結構與性 質質 L-Ala存在于所有蛋白質分子中,為中性氨基酸中性氨基酸。分 子式為C3H7NO2，分子量為89.09，結構式為： L-AlaL-Ala自水和乙醇中形成菱形結晶自水和乙醇中形成菱形結晶，等電點為等電點為6.06.0， 分解點為297，在在2525水中溶解度為水中溶解度為16.6516.65，在在7575 水中為水中為28.528.5，在20乙醇中為0.16，不溶于丙酮及乙 醚。25D 為+

41、18（C0.52.0，在水中）， 25D為-14.6（C0.52.0，在5molL HCl 中）。 50 （2 2）L-AspL-Asp和和L-AlaL-Ala的酶轉化反應的酶轉化反應 （3 3）工藝路線）工藝路線 51 固定化酶固定化酶 凡限制在一定的空間范圍內(nèi)并能連續(xù)反復的使用 的酶都稱為固定化酶。固定化酶。 通常采用的固定化方法可大體概括為四種類型： 吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法。吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法。 吸附法吸附法 這是通過載體表面和酶分子表面間的次級次級 鍵相互作用鍵相互作用而達到固定目的的方法，又可分：物理吸物理吸 附和離子交換吸附附和離子交換吸附。 物理吸附物

42、理吸附是通過氫鍵、疏水鍵和氫鍵、疏水鍵和電子親和力電子親和力等 物理作用力將酶固定于不溶性載體不溶性載體的方法。 常用的載體載體有：皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠和 微孔玻璃等無機吸附劑，纖維素、膠原、賽珞玢賽珞玢以及 火棉膠等有機吸附劑有機吸附劑。 52 最常用的交換劑有CMCM（羧甲基）纖維素、（羧甲基）纖維素、 DEAEDEAE（二乙基氨基乙基）纖維素、（二乙基氨基乙基）纖維素、DEAEDEAE葡聚糖凝葡聚糖凝 膠膠等。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑， 約50150mg蛋白g載體。 共價偶聯(lián)法共價偶聯(lián)法 這是借助共價鍵共價鍵將酶的活性非必需側鏈基團非必需側鏈基團和載 體的功能基團功

43、能基團進行偶聯(lián)以制備固定化酶的方法。 常用的載體載體有：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、聚 丙烯酰胺、多聚氨基酸、乙烯與順丁烯二酸酐共聚物、 聚苯乙烯、尼龍等；還有無機載體如多孔玻璃等。 53 交聯(lián)法交聯(lián)法 利用雙功能或多功能試劑雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶分子與酶分子間或酶分子與 惰性蛋白間、或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應以共價惰性蛋白間、或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應以共價 鍵鍵制備固定化酶。 包埋法包埋法 將聚合物聚合物的單體單體和酶溶液混合后，再借助聚合促進聚合促進 劑（包括交聯(lián)劑）劑（包括交聯(lián)劑）的作用進行聚合，將酶包埋于聚合 物中以達到固定化的目的。 （1）膠格包埋膠格包埋最常用的包埋

44、劑是聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠， 它以丙烯酰胺丙烯酰胺為單體、N N，N-N-亞甲基雙丙烯酰胺為交亞甲基雙丙烯酰胺為交 聯(lián)劑聯(lián)劑聚合而成。 54 （2）微囊型包埋微囊型包埋是用直徑幾十到幾百微米、厚約 25nm的半透膜半透膜將酶分子進行包埋固定化的方法。 （3）脂質體包埋脂質體包埋 脂質體是指具有脂雙層結構脂雙層結構和一定 包裹空間的微球體微球體。 輔酶及偶聯(lián)酶輔酶及偶聯(lián)酶的固定化 輔酶物質的固定化一般采用載體共價偶聯(lián)法載體共價偶聯(lián)法。 55 （4 4）工藝過程）工藝過程 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 大腸桿菌（大腸桿菌（Esscherichia coliEsscherichia coli）AS1.88

45、1AS1.881的培養(yǎng)的培養(yǎng) 斜斜 面培養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基面培養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基； 搖瓶培養(yǎng)基成分（）搖瓶培養(yǎng)基成分（）為玉米漿7.5，反丁烯二酸 2.0，MgSO47H2O0.02，氨水調pH6.0,煮沸后過濾， 500ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量50100m1。 從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子，接種于搖瓶培養(yǎng) 基中，37振搖培養(yǎng)24h，逐級擴大培養(yǎng)至1000 2000L規(guī)模。培養(yǎng)結束后用1molL HCl調pH5.0，升 溫至45并保溫1h，冷卻至室溫，轉筒式高速離心機轉筒式高速離心機 收集菌體（含天冬氨酸酶）收集菌體（含天冬氨酸酶），備用。 56 德阿昆哈假單胞菌（德阿昆哈假單胞菌（Pse

46、udomonas dacunhaePseudomonas dacunhae）6868變異變異 株的培養(yǎng)株的培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)基組成（）為斜面培養(yǎng)基組成（）為 蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaC1 0.5， pH7.0，瓊脂2.0。 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基相同，唯不加瓊脂， 250ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為40m1。 搖瓶培養(yǎng)基組成搖瓶培養(yǎng)基組成（）為L-谷氨酸3.0，蛋白胨 0.9，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氯鉀0.05， MgSO47H2O 0.01，用氨水調pH 7.2，500ml三角瓶中 培養(yǎng)基裝量為80ml。 57 將培養(yǎng)24h的新鮮斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基

47、中，30振搖培養(yǎng)8h，再接種子搖瓶培養(yǎng)基中，30 振蕩培養(yǎng)24h，如此逐級擴大至10002000L的培養(yǎng)罐 培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后用1molLHCl調pH至4.75，于30 保溫1h，用轉筒式高速離心機離心收集菌體（含含L-L-天天 冬氨酸冬氨酸-脫羧酶），備用。脫羧酶），備用。 細胞固定細胞固定EcoliEcoli的細胞固定的細胞固定 取濕菌體20kg懸 浮于80L，生理鹽水（或離心后的培養(yǎng)清液）中，保保 溫至溫至4040，再加入90L90L保溫至保溫至4040的1212明膠明膠溶液及 10L1.010L1.0戊二醛戊二醛溶液，充分攪拌均勻，放置冷卻凝固， 再漫于漫于0.250.25戊二醛溶液戊二

48、醛溶液中。于5過夜后，切成3 3 5mm5mm的立方小塊，浸于0.250.25戊二醛戊二醛溶液中55過夜、 蒸餾水充分洗滌，濾干得含天冬氨酸酶的固定化 E.coli，備用。 58 假單胞菌體固定假單胞菌體固定 取濕菌體20kg，加生理鹽水攪勻并稀釋至40L，另 取溶于生理鹽水的5 5角叉菜膠角叉菜膠溶液85L，兩液均保溫 至45后混合，冷卻至5成膠。浸于600L2%KCl600L2%KCl和和 0.2mol0.2molL L己二胺的己二胺的0.5mol0.5molL pH7.0L pH7.0的磷酸緩沖液中的磷酸緩沖液中， 5下攪拌10分鐘，加戊二醛至戊二醛至0.6mol0.6molL L濃度濃

49、度，5 攪拌30分鐘，取出切成35mm的立方小塊，用2% KCl 溶液充分洗滌后，濾去洗滌液，即得含含L-L-天冬氨酸天冬氨酸- - -脫羧酶的固定化細胞脫羧酶的固定化細胞，備用。 59 轉化反應轉化反應 將保溫至保溫至3737的lmollmolL L延胡索酸銨延胡索酸銨（含1mmolL MgC12，pH8.5）底物溶液按一定空間速度（Sv）連續(xù) 流過生物反應堆反應堆I I，控制達到最大轉化率（最大轉化率（9595） 為限度，收集轉化液制備制備L-AspL-Asp或用于生物反應堆反應堆 的再轉化。 當需要生產(chǎn)L-丙氨酸時，向上述轉化液中加磷酸磷酸 吡哆醛吡哆醛至0.1mmol0.1mmolL

50、L濃度濃度，調pH6.0，保溫至37， 按一定空間速度流入1.515105Pa壓力下的生物反應 堆，控制達到最大轉化率（最大轉化率（9595）為限，收集轉 化液，用于制取L-L-丙氨酸丙氨酸。 60 產(chǎn)品純化與精制產(chǎn)品純化與精制 生物反應堆生物反應堆轉化液經(jīng)過濾澄 清，攪拌下用1mol1molL HClL HCl調調pH2.8pH2.8，55結晶結晶過夜， 濾取結晶，用少量冷水洗滌抽干，105105干燥干燥得L-L- AspAsp粗品。粗品。粗品用稀氨水溶解（稀氨水溶解（pH5pH5）成15溶液， 加1%1%（w wv v）活性炭，）活性炭，7070攪拌脫色攪拌脫色1h1h過濾過濾,濾液于 5

51、結晶過夜，濾取結晶，85真空干燥得藥用藥用L-AspL-Asp。 生物反應堆生物反應堆轉化液過濾澄清，于于60607070下減 壓濃縮至原體積的5050，冷卻后加等體積甲醇甲醇，55 結晶過夜結晶過夜，濾取結晶并用少量冷甲醇洗滌抽干，80 真空干燥得L-Ala粗品。粗品用3 3倍體積（倍體積（w wv v）去離 子水于80攪拌溶解，加0.5%0.5%（w wv v）藥用活性炭）藥用活性炭 于7070攪拌脫色攪拌脫色1h1h，過濾，濾液冷后加等體積甲醇， 55結晶過夜結晶過夜，濾取結晶，于80真空干燥得藥用L Ala。 61 （5 5）檢驗）檢驗 （6 6）作用與用途）作用與用途 L-Asp有助

52、于鳥氨酸循環(huán)，促進氨 和CO2生成尿素，降低血中氨和CO2,增強肝功能，消 除疲勞，用于治療慢性肝炎、肝硬化及高血氨癥。同 時L-Asp和L-Ala都是復合氨基酸輸液的原料。 2 2，酶拆分法制備，酶拆分法制備L-L-苯丙氨酸苯丙氨酸 （1 1）L-L-苯丙氨酸（苯丙氨酸（L-phenylalanineL-phenylalanine，L-pheL-phe）的結）的結 構與性質構與性質 L-phe，存在于所有蛋白質中，為人體必需人體必需 氨基酸之一氨基酸之一，其分子式為C9H11NO2，分子量為165.19， 結構為： 62 L-Phe自水中結晶成白色葉片狀晶體葉片狀晶體，無臭， 微苦，pIpI

53、為為5.485.48；分解點為分解點為283283284284。在2525水中 溶解度為2.962.96，在7575水中為6.626.62，微溶于甲醇及乙 醇，不溶于乙醚。1%1%水溶液水溶液pHpH為為5.45.46.06.0。25D 為-4.47（C0.52.0，在5molL HCl中）， 25D為-34.5（C0.52.0，在水中）。 （2 2）酶拆分）酶拆分DL-PheDL-Phe的原理：的原理：DL-Phe與醋酸酐反應醋酸酐反應生 成乙酰乙酰-DL-Phe-DL-Phe（Ac-DL-Phe），氨基?；缚蓪Ｒ恍园被；缚蓪Ｒ恍?水解水解Ac-L-PheAc-L-Phe的酰胺鍵生成的

54、酰胺鍵生成L-PheL-Phe，而不水解不水解Ac-D-Ac-D- PhePhe酰胺鍵酰胺鍵，再利用利用L-PheL-Phe與與Ac-D-PheAc-D-Phe在水中溶解度的在水中溶解度的 差異進行分離差異進行分離。 Ac-D-PheAc-D-Phe又可經(jīng)消旋生成又可經(jīng)消旋生成Ac-DL-PheAc-DL-Phe，再行水解和 分離，如此反復進行，可將DL-Phe全部轉化為L-Phe。 DL-Phe拆分的基本反應過程如下： 63 （3 3）工藝路線）工藝路線 （4 4）工藝過程）工藝過程 固定化氨基?；傅闹苽涔潭ɑ被；傅闹苽?取DEAE-SephadexDEAE-Sephadex A-5

55、0 （二乙氨基乙基葡聚糖,G后面的阿拉伯數(shù)為凝膠得水 值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克） 于去離子水中充分浸泡后，依次用10倍量0.5mol0.5molL L HClHCl和和0.5mol0.5molL NaOHL NaOH溶液攪拌處理溶液攪拌處理30min30min，再用去離 子水洗至中性，然后依次用0.1mol.1molL L及及0.01mol0.01molL L 的的pH7.0pH7.0磷酸緩沖液處理磷酸緩沖液處理1 12h2h，濾干備用。 64 另取培養(yǎng)4050h的米曲擴大曲米曲擴大曲用6倍量去離子水 分兩次抽提，濾去殘渣濾去殘渣。濾液用2molL NaOH溶液調

56、 pH6.77.0pH6.77.0，按100L酶液加1kg已處理的濕DEAE- SephadexA-50的比例混合比例混合，于04攪拌吸附45h， 濾取DEAE-Sephadex A-50，依次用去離子水、0.1mol L醋酸鈉醋酸鈉、0.01molL的pH7.0磷酸緩沖液洗滌34 次，濾干得固定化氨基?；腹潭ɑ被；?，加1 1甲苯甲苯后于冷庫 中貯存，備用。 Ac-DL-PheAc-DL-Phe的制備的制備 將DL-Phe、冰醋酸及醋酸酐冰醋酸及醋酸酐按 171（wVv）的比例加入反應釜中，9090反應反應 4 45h5h，回收醋酸，濃縮液加一定量去離子水，再濃 縮至一定體積，冷卻結晶

57、冷卻結晶，濾取結晶于6060真空干真空干 燥得燥得AcAcDLDLPhePhe。 65 酶水解酶水解 在1000L反應罐中加700L 0.1molL Ac-DL-PheAc-DL-Phe鈉鈉 鹽溶液鹽溶液，攪拌下滴加6molL HCl至pH6.7pH6.77.07.0，加 1520kg固定化氨基?；腹潭ɑ被；?，5050反應反應4 45h5h，過濾， 濾液待分離LPhe，固定化酶再用于轉化。 分離純化分離純化 上述濾液用6molL HCl調至pH4.8pH4.8 5.15.1，減壓濃縮濃縮至35L左右，濃縮液于00結晶結晶過夜， 濾取結晶并用10L冷乙醇洗滌三次，抽干,于8080烘烘 3

58、4h34h，得LPhe粗品。濾液和洗滌液合并后減壓濃縮 至20L左右，得Ac-D-Phe溶液，待消旋和再轉化。 66 精制精制 取50L去離子水于100L反應罐中，加熱至 95100，投入5kg L LPhePhe粗品粗品，攪拌溶解溶解，加藥 用活性炭活性炭0.25kg，攪拌脫色3min。趁熱過濾趁熱過濾，濾液 轉移至200L結晶罐中，冷卻至40，加50 L 40 50 L 40 9595乙醇，用乙醇，用6mol6molL HClL HCl調調pH5.5pH5.5，于00結晶結晶過夜， 濾取結晶，用10L冷乙醇洗滌冷乙醇洗滌3 34 4次次，抽干，于80 干燥34h。母液濃縮回收L-Phe結晶

59、，所得結晶如 上法重結晶一次，得藥用LPhe。結晶母液及洗滌 液合并,減壓濃縮后轉入粗品母液，待消旋待消旋。 AcAcD DPhePhe的消旋的消旋 上述粗品及精品粗品及精品L-PheL-Phe母液母液及洗 滌液合并后濃縮至60L,于100L反應罐中在攪拌下緩 緩加入醋酸酐醋酸酐18.5L，在2545攪拌反應30min， 冷卻至室溫，放置6h，用濃鹽酸調調PH l.5PH l.52.02.0， 5結晶過夜，濾取結晶，用去離子水洗滌35次， 每次20L，抽干，于40真空干燥得真空干燥得AcAcDLDLPhePhe。 67 （5 5）檢驗）檢驗 應為白色葉片狀結晶，其含量應在98.5 101.5之

60、間，25D為-32.3+34.3，1 水溶液pH為5.46.0，干燥失重應不超過0.3， 熾灼殘渣應不超過0.4，氯化物、硫酸鹽及重金屬 均與異亮氨酸規(guī)定相同，砷鹽應不超過1.5ppm，鐵鹽 應不超過0.003%。 含量測定含量測定： （6 6）作用與用途）作用與用途 L-苯丙氨酸為復合氨基注射液復合氨基注射液的重 要原料之一，也是合成苯丙氨酸 氮芥及對氟苯丙氨酸 等抗癌藥的原料。 68 四、化學合成法四、化學合成法 （一）基本原理與過程（一）基本原理與過程 以-鹵代羧酸、醛類、甘氨酸衍生物、異氰酸鹽、鹵代羧酸、醛類、甘氨酸衍生物、異氰酸鹽、 乙酰氨基丙二酸二乙酯、鹵代烴、乙酰氨基丙二酸二乙酯