薄層實(shí)驗(yàn)方法展開劑各項(xiàng)

1、1. 方法原理薄層色譜是一種微量分析的分離過程，它將樣品點(diǎn)在以玻璃板或鋁、塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上,利用流動(dòng)相在特定的展開室中將混合物中的組份推移到不同距離處，在色譜展開整個(gè)過程中，樣品的成份受到正反不同的力的作用。(1) 流動(dòng)相利用毛細(xì)管力帶著樣品穿過固定相。(2) 樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶極 - （誘導(dǎo)） - 偶極相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機(jī)理。由于樣品組份與流動(dòng)相和固定相之間的相互作用力程度不同，整個(gè)毛細(xì)管流動(dòng)過程中分離運(yùn)動(dòng)都在進(jìn)行。基于這點(diǎn)，tlc系統(tǒng)（流動(dòng)相和固定相）必須與樣品很好地匹

2、配。用顯色試劑處理，許多組份可在日光或紫外燈光下檢視。色譜可用肉眼或使用光密度計(jì)和照相機(jī)記錄或影像系統(tǒng)方法來評(píng)價(jià)。2. 薄層板2.1手工自制板2.1.1玻璃板的要求:用于制備薄層板的玻璃板要求表面光潔、平整，最好使用厚薄12mm的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄層板，玻璃板需洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用。玻璃板反復(fù)使用時(shí)，應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗，保持玻璃板面的光潔是保證薄層板質(zhì)量的最基本要求2.1.2制作方法:除另有規(guī)定外，將1份吸附劑加適量的水（如1份硅膠g一般加3份水），在研缽中用研杵沿一個(gè)方向小心研磨至成均勻的有適當(dāng)粘稠度的膠漿,立即傾入涂布器中,均勻地向前推進(jìn)

3、涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的規(guī)定操作涂布;涂布好的薄層板于室溫下在水平臺(tái)上晾干,再在規(guī)定的溫度(一般為105110)下烘約30分鐘活化,貯于干燥器中備用。薄層板的厚度一般為0.250.5mm.。2.2 商品化供應(yīng)的預(yù)制板和高效板2.2.1板的尺寸20x20cm 10x20cm 20x10cm 10x10cm圖1 不同的板尺寸tlc/hptlc預(yù)制板有不同的規(guī)格供應(yīng)。常用的尺寸為20 x 20，10 x 20，20 x 10，或10 x 10 cm。使用的規(guī)格取決于tlc或hptlc的類別和樣品的數(shù)目。2.2.3 tlc/hptlc板的預(yù)洗及活化一般來說，色譜板應(yīng)用溶劑如氯仿-甲醇(8:2

4、)，甚至用更強(qiáng)的洗脫溶劑的混合物進(jìn)行預(yù)洗。具體操作可通過空白色譜展開來實(shí)現(xiàn)。色譜板預(yù)洗完后,應(yīng)在105c加熱1小時(shí)進(jìn)行干燥，再在室溫下置放至少2小時(shí)（需采取保護(hù)措施以防止實(shí)驗(yàn)室空氣中的污染物重新附著在其上面，如放置在空的干燥器中）。3. 樣品點(diǎn)樣31點(diǎn)狀點(diǎn)樣和條帶狀點(diǎn)樣每次點(diǎn)樣前，tlc/hptlc板應(yīng)在正常光線下和紫外燈下用肉眼檢查薄層的損傷情況和雜質(zhì)，只有無損傷、清潔的tlc/hptlc板方可使用。樣品可進(jìn)行點(diǎn)狀或條帶狀點(diǎn)樣。要想獲得最佳的薄層分辨率，必須保證移行方向中的起點(diǎn)要小，常規(guī)的tlc薄層點(diǎn)狀點(diǎn)樣每次點(diǎn)0.5至5微升，相比之下，hptlc薄層最大點(diǎn)樣量為1微升。點(diǎn)樣量較大的樣品可使

5、用自動(dòng)化裝置點(diǎn)樣，噴霧成條帶狀是一種可以點(diǎn)樣量大而同時(shí)又能促成最有效分離的點(diǎn)樣方法。在常規(guī)操作過程中，人工點(diǎn)樣一般使用微量毛細(xì)管（0.5/1/2/3和5 l），點(diǎn)樣時(shí)毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空，要以垂直方向小心接觸tlc/hptlc板面，不要損傷薄層，受損的薄層會(huì)導(dǎo)致溶劑不規(guī)律地流動(dòng)而在色譜上產(chǎn)生失真的tlc譜帶。人工點(diǎn)樣建議使用nanomat。它點(diǎn)樣位置精確并安全，使薄層免于受損。用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)干燥nanomat也可用作單個(gè)量的多次點(diǎn)樣。樣品體積大于5 l，通常用如linomat或automatic tlc sampler iii的方法用氮?dú)鈬婌F成窄條。若（就是）要求點(diǎn)狀樣品點(diǎn)樣，linom

6、at 和automatic tlc sampler iii應(yīng)將條長(zhǎng)度設(shè)定在1至2 mm。3.2 樣品點(diǎn)樣位置起點(diǎn)的最佳位置如圖2和3所示。起點(diǎn)下緣的最小距離b取決于溶劑量。兩個(gè)起點(diǎn)之間的距離c必須令平行移行的主成份不會(huì)相互觸及。點(diǎn)狀點(diǎn)樣時(shí)原點(diǎn)的直徑應(yīng)小于或等于3mm（高效板原點(diǎn)的直徑應(yīng)更?。?條帶的長(zhǎng)度d由點(diǎn)樣樣品體積或樣品的種類和相對(duì)于板的尺寸點(diǎn)樣的數(shù)目來決定。到板側(cè)邊的距離a必須足夠大以避免分離區(qū)失真變形（見圖2和3）。圖2： 斑狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置（a = 20mm, b = 10mm, c =兩起點(diǎn)之間的距離。）圖3： 條狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置（a = 20mm, b = 10m

7、m, c = 兩起點(diǎn)之間的距離，d = 條的長(zhǎng)度）。4.層析4.1展開室4.1.1直立式雙槽展開室 具有節(jié)省溶劑、便于預(yù)平衡、可控制展開箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點(diǎn)。4.1.2 水平展開室 可以從薄層板的兩側(cè)向中間水平地展開，這樣可使一塊薄層板所承受的樣品個(gè)數(shù)比常規(guī)上行展開的薄層板增加一倍。4.1.3 自動(dòng)展開室(amd) 可使用五種溶劑對(duì)同一薄層進(jìn)行多次展開，自動(dòng)控制預(yù)飽和、展開方式、展開距離和干燥條件，分離效率比傳統(tǒng)方式提高三倍（可在80mm之內(nèi)分離40種成分），符合glp/gmp要求。4.2. 溶劑使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”，溶劑組成采用體積量比（如正丁醇 - 冰乙酸 - 水 = 4：1

8、：1，v/v/v），或者絕對(duì)量（如18ml甲苯 + 2 ml甲醇）。其總量應(yīng)足以使tlc/hptlc板的浸入深度約為5mm。展開劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用,如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用。在雙槽展開室中，對(duì)每種類型和規(guī)格和層析板，每槽通常注入的溶劑數(shù)量如表3。表3：板的規(guī)格 板的尺寸（寬高） 溶劑量預(yù)制板 2020cm2010cm1010cm 25ml15ml8ml高效板 2010cm1010cm 10ml5ml （1） 硫酸（sulphuri acid）通用顯色劑。 試液： a、5%濃硫酸乙醇或乙酐溶液 b、濃硫酸與甲醇或乙醇等體積混合 c、15%濃硫酸正

9、丁醇溶液 方法：用以上任一試液噴灑或浸濕晾干，于110攝氏度加熱至呈色，或達(dá)最強(qiáng)熒光。 （2）碘（iodine） 通用顯色劑。 試液： a：0.5%碘的氯仿溶液。 噴后處理：待薄層上過量碘揮散，噴1%淀粉溶液，斑點(diǎn)轉(zhuǎn)為蘭色，如有過量碘留在薄層上，則背景也呈蘭色。 b：碘蒸氣：將少許碘晶體放入一密閉的容器內(nèi)，使之充滿飽和碘蒸氣，將薄層放入容器片刻或數(shù)分鐘即顯色。有時(shí)在容器內(nèi)放一小杯水增加濕度，可提高顯色的靈敏度，可提高顯色的靈敏度。在化合物斑點(diǎn)處顯黃-棕色。 （3）磷鉬酸（molybdophosphoric acid） 用于還原性化合物、類脂、甾體化合物等。 試液：5%或10%磷鉬酸乙醇溶液噴或

10、浸后處理：于120攝氏度加熱至最佳顏色形成，如將薄層放入含25%氫氧化銨溶液的容器內(nèi)，可使背景顏色消退。 （4）香草醛-硫酸（vanillin-sulphuric acid）用于精油、高級(jí)醇、酚等 試液：香草醛1g溶于100ml硫酸或香草醛0.5g溶于100ml硫酸-乙醇（1：1）溶液。 噴或浸后處理：于120攝氏度加熱至顏色最深。 （5）三氯化鐵（ferric chloride）用于酚類、羥酰胺酸。 試液：1%5%三氯化鐵的0.5mol/l鹽酸溶液。 注：酚類呈蘭色或綠色，羥酰胺酸呈紅色。 （6）三氯化鋁（aluminium chloride）用于黃酮類化合物。 試液：1%三氯化鋁乙醇溶液，

11、紫外光長(zhǎng)波下斑點(diǎn)顯黃色熒光。 （7）碘化鉍鉀試劑（dragendorff reagent)用于生物堿和某些含氮化合物。 試液：a：次硝酸鉍0.85g溶于10ml冰乙酸與40ml水中。 b：碘化鉀8g溶于20ml水中。 方法：試液a和b等量混合，置棕色瓶保存試液。用前將試液1ml加2ml冰乙酸和10ml水混合。 注：顯色斑點(diǎn)呈橙紅色。 （8）茚三酮（ninhydrin）用于氨基酸、胺與氨基糖類 試液：茚三酮0.2g溶于乙醇100ml或溶于100ml正丁醇，加乙酸3ml。 噴或浸后處理：于110攝氏度加熱至最佳顏色出現(xiàn)。 （9）鄰苯二甲酸苯胺用于還原糖。 試液：苯胺0.93g和鄰苯二甲酸1.66g

12、溶于100ml以水飽和的正丁醇中。 噴或浸后處理：于105攝氏度加熱10min，醛己糖及甲基戊糖呈棕色，醛戊糖呈櫻桃紅色（10） 硫酸鈰：用于生物堿 配制方法 ：10%硫酸鈰(iv)+15%硫酸的水溶液 （11）桑色素(羥基黃酮) 通用顯色劑, 有熒光活性 配制方法 ：0.1% 桑色素+甲醇 （13） 二硝基苯肼(dnp) 用于醛和酮 配制方法：12g二硝基苯肼+ 60ml 濃硫酸 + 80ml 水 + 200ml 乙醇 （14）高錳酸鉀 用于含還原性基團(tuán)化合物，比如羥基，氨基，醛 配制方法 ：1.5g kmno4+ 10g k2co3+ 1.25ml 10% naoh + 200ml 水.

13、使用期3個(gè)月（15）溴甲酚綠 用于羧酸，pka=5.0 配制方法 ：在100ml乙醇中，加入0.04g溴甲酚綠，緩慢滴加0.1m的naoh水溶液，剛好出現(xiàn)藍(lán)色即至。 （16）鉬酸鈰 通用顯色劑 配制方法 ：235ml 水 + 12g 鉬酸氨 + 0.5g 鉬酸鈰氨 + 15ml 濃硫酸 （17）茴香醛(對(duì)甲氧基苯甲醛)1 通用顯色劑 配制方法 ：135乙醇 + 5ml 濃硫酸 + 1.5ml of 冰醋酸 + 3.7ml 茴香醛，劇烈攪拌，使混合均勻. 茴香醛(對(duì)甲氧基苯甲醛)2 用于萜烯，桉樹腦(cineoles), withanolides, 出油柑堿(acronycine) 配制方法 ：

14、茴香醛:hclo4:丙酮:水 (1:10:20:80) （18）醋酸改良碘化鉍鉀試液的配制：a取次硝酸鉍0.52g加冰醋酸6ml，純化水24ml；b取碘化鉀12g加純化水30ml。將a、b兩液混合，再加純化水120ml，冰醋酸160ml即得。實(shí)例談薄層色譜展開劑選擇 根據(jù)本人的幾年薄層層析經(jīng)驗(yàn)，參考藥典等國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)文獻(xiàn)，將 2000版藥典一部里部分有代表性的對(duì)照品的薄層層實(shí)例按展開劑極性排序，并對(duì)其規(guī)律做一些分析。以下的分析和介紹是總體描述性的，目的是快速、簡(jiǎn)便地選擇展開劑。如果想了解展開劑選擇的各種理論，請(qǐng)參考其他專著。 選擇展開劑，要依據(jù)溶劑極性和他們的混溶性，溶劑對(duì)被分析物的溶解

15、性，以及被分析物的結(jié)構(gòu)。這里只討論藥典里通常使用的以硅膠為固定相主體的正相薄層，也不考慮板的活性。 e( 5lq3y列出溶劑極性參數(shù)表，方便以下比較展開劑。環(huán)已烷 :-0.2、石油醚（類，3060）、石油醚（類，6090）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、異丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氫呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2 1 。 關(guān)于溶劑混溶性，一般根據(jù)相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶，比如正己烷與甲醇。多元展開劑，主體的兩種溶劑不能混溶，就需

16、要通過第三種溶劑來調(diào)和。比如：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、環(huán)已烷和甲醇、水之類的。 k #; #i一般正相色譜，固定相為極性，被分析物質(zhì)的極性越大，需要極性更大的展開劑。 ni-yl<y_了解被分析物的極性可以通過分析其結(jié)構(gòu)獲得，很難獲得它的極性指數(shù)。物質(zhì)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)中，通常由較極性部分和非極性部分兩部分。例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團(tuán)部分的增加，總體的極性就增加，展開劑極性也增加了。， 依次為肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸。 snz ;v相應(yīng)展開劑分別為：正己烷乙醚冰醋酸 (5:5:0.1)、苯冰醋酸甲醇(30:1:3)、氯仿甲醇甲酸（9:1: 0.5）、石油醚乙

17、酸乙酯甲酸（3:6: 1）、醋酸丁酯甲酸水(7:2.5:2.5)。（由于薄層板、比移值不同的原因，展開劑極性比較是相對(duì)的，并非絕對(duì)的后者大于前者）。 ?5$d|fe=現(xiàn)在最重要的問題是，不同化合物，怎么定它的極性，又用什么標(biāo)準(zhǔn)來定它對(duì)應(yīng)的展開劑呢？以下分開討論不同化合物極性情況及其對(duì)應(yīng)的展開劑。 bjuhg.hvq首先是極性較小的揮發(fā)性物質(zhì)。比如：冰片：石油醚 (3060)醋酸乙酯(17:3)、厚樸酚：苯醋酸乙酯(9:1.5)、-香附酮：苯醋酯乙酯冰醋酸(92:5:5)、丹皮酚：環(huán)己烷醋酸乙酯(3:1)，這類化合物，以石油醚、正構(gòu)烷和苯為體積百分?jǐn)?shù)比較大的溶劑，通常起溶解和分離化合物的作用，而

18、用醋酸乙酯為調(diào)節(jié)rf（比移值）的溶劑。為了減少拖尾之類其他相似相溶原則以外的影響，適當(dāng)加入添加劑，如有機(jī)酸或者有機(jī)堿。 2rkf $)q m極性較小的不揮發(fā)性物質(zhì)。比如： -谷甾醇：環(huán)己烷醋酸乙酯甲醇(6:2.5:1)或者環(huán)己烷丙酮(5:2) 、熊果酸：甲苯醋酸乙酯冰醋酸(12:4:0.5)、齊墩果酸：氯仿甲醇(40:1)、豬去氧膽酸：氯仿乙醚冰醋酸(2:2:1)、大黃素：苯醋酸乙酯甲醇(15:2:0.2)或者苯乙醇 (8:1)、丹參酮a：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4) 、穿心蓮內(nèi)酯：氯仿-無水乙醇(9:1)、靛玉紅、靛藍(lán)氯仿乙醇(9:1)或者苯氯仿丙酮(5:4:1)。這類物質(zhì)展開劑極性

19、比極性較小的揮發(fā)性物質(zhì)洗脫力強(qiáng)一些，因?yàn)檫@類物質(zhì)極性小的母核大，而極性大的基團(tuán)通?？梢孕纬蓺滏I，比如羧酸、羥基。以上物質(zhì)，母核分子量減小、母核結(jié)構(gòu)中不飽和健的增加（尤其是出現(xiàn)苯環(huán)），極性基團(tuán)的增加，都使極性增加，展開劑極性也增大。這個(gè)范圍內(nèi)的物質(zhì)很多，一般展開劑大百分?jǐn)?shù)的溶劑可以從環(huán)己烷甲苯二甲苯苯氯仿的順序，按照極性要求選擇。這里注意，異丙醇、正丁醇極性指數(shù)也比較小，在這范圍的化合物很少用，因?yàn)檎承源?、展開慢，造成斑點(diǎn)擴(kuò)散；另外，羥基的氫鍵作用力也有不利。調(diào)節(jié)rf值的溶劑，從醋酸乙酯甲醇丙酮乙醇。揮發(fā)性物質(zhì)也有很多帶羰基、羥基的，但從它的揮發(fā)性就可以明白，分子間作用力不強(qiáng)，另外，母核與石油醚

20、、正構(gòu)烷和苯的結(jié)構(gòu)差異小，估計(jì)更容易脫離硅膠吸附，更快進(jìn)入溶劑中，而不需要通過提高展開劑的極性。 bt 6o 7z皂苷類。人參皂苷：氯仿甲醇水 (65:35:10)10以下放置的下層溶液或正丁醇醋酸乙酯水(4:1:5)的上層溶液或氯仿醋酸乙酯甲醇水(15:40:22:10)10以下放置的下層溶液、芍藥苷：氯仿醋酸乙酯甲醇甲酸(40:5:10:0.2)、黃芩苷：醋酸乙酯丁酮醋酸水(10:7:5:3)、橙皮苷：苯醋酸乙酯甲酸水(1:12:2.5:3)的上層溶液、葛根素：氯仿甲醇水(14:5:0.5)、蘆丁：醋酸乙酯甲酸水(8:1:1)。這類物質(zhì)，由于存在糖的多羥基結(jié)構(gòu)，苷元的結(jié)構(gòu)影響變小。展開劑中

21、使用極性大的有機(jī)溶劑（氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇）和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展開劑極性，另外也可以抑制硅膠羥基的作用，減少拖尾。由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。 c b 4 d極性大的小分子有機(jī)酸。沒食子酸：氯仿醋酸乙酯甲酸 (5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸、異綠原酸。這類物質(zhì)多數(shù)是苯乙烯母核的，這個(gè)結(jié)構(gòu)的極性本身比較大，另外有酚羥基和羧酸基團(tuán)，個(gè)別有多羥基配基。皂苷的展開劑差不多，極性大。注意甲酸通常指的是濃度85%左右的，含有水。 cbcnsr3 ej含氮有機(jī)物。鹽酸小檗堿：苯醋酸乙酯甲醇異丙醇濃氨試液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸氣飽和

22、) 或正丁醇冰醋酸-水(7:1:2)、麻黃堿：氯仿甲醇濃氨試液(20:5:0.5)或正丁醇冰醋酸水(8:2:1)、甘草酸銨：醋酸乙酯甲酸冰醋酸水(15:1:1:2)。由于nh2硅醇基的作用很強(qiáng)，在強(qiáng)極性展開劑加有機(jī)酸、有機(jī)堿掃尾。對(duì)于極性化合物，使用正丁醇對(duì)斑點(diǎn)擴(kuò)散影響較小，因?yàn)榛衔锖凸枘z的作用強(qiáng)。 d b#kvl:進(jìn)行薄層分析基本可以根據(jù)母核、基團(tuán)，選擇相似的化合物對(duì)號(hào)入座。當(dāng)然，具體的條件優(yōu)化則需要根據(jù)實(shí)際情況了。遇到較困難的分離，需要使用到做有機(jī)合成時(shí)走板子是常有的事情,展開劑的選擇就至關(guān)重要了.需要使用到設(shè)計(jì)優(yōu)化方法的，已經(jīng)不屬于本文討論范圍了薄層色譜，或稱薄層層析(thin1aye

23、r chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動(dòng)相，對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質(zhì)的特別有效的層析方法，從50年代發(fā)展起來至今，仍被廣泛采用。 薄層層析(一)基本原理薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板(常用玻璃板，也可用滌綸布等)上形成薄層，然后用相應(yīng)的溶劑進(jìn)行展開。薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層

24、吸附層析。吸附是表面的一個(gè)重要性質(zhì)。任何兩個(gè)相都可以形成表面，吸附就是其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解于其中的溶質(zhì)在此表面上的密集現(xiàn)象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發(fā)生吸附現(xiàn)象。物質(zhì)分子之所以能在固體表面停留，這是因?yàn)楣腆w表面的分子(離子或原子)和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不相等。在固體內(nèi)部，分子之間相互作用的力是對(duì)稱的，其力場(chǎng)互相抵消。而處于固體表面的分子所受的力是不對(duì)稱的，向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運(yùn)動(dòng)中遇到固體表面時(shí)受到這種剩余力的影響，就會(huì)被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸

25、出來。在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動(dòng)態(tài)平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡、吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡過程。例如用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數(shù)的不同，使混合物得以分離。當(dāng)溶劑沿著吸附劑移動(dòng)時(shí)，帶著樣品中的各組分一起移動(dòng)，同時(shí)發(fā)生連續(xù)吸附與解吸作用以及反復(fù)分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對(duì)它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點(diǎn)。如作為標(biāo)準(zhǔn)的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據(jù)這些已知化合物的rf值（后面介紹rf值）對(duì)各斑點(diǎn)的組分進(jìn)行鑒定，同時(shí)也可以進(jìn)一步采用某些方

26、法加以定量。薄層層析有許多優(yōu)點(diǎn)：它保持了操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、顯色容易等特點(diǎn)，同時(shí)展開速率快，一般僅需1520分鐘；混合物易分離，分辨力一般比以往的紙層析高10100倍，它既適用于只有001g的樣品分離，又能分離大于500mg的樣品作制備用，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點(diǎn)是對(duì)生物高分子的分離效果不甚理想。(二) 固定相支持劑的選擇和處理 在薄層層析時(shí)，對(duì)支持劑的選擇主要考慮兩方面：一是支持劑的性質(zhì)與適用范圍；二是支持劑的顆粒大小。一般來說，所選吸附劑應(yīng)具有最大的比表面積和足夠的吸附能力，它對(duì)欲分離的不同物質(zhì)應(yīng)有不同的吸附能力，即有足夠的分辨力；所選吸附劑與溶劑及

27、樣品組分不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。吸附力的強(qiáng)弱規(guī)律可概括如下：吸附力與兩相間界面張力的降低成正比，某物質(zhì)溶液中被吸附的程度與其在溶劑中的溶解度成反比。極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。同族化合物的吸附程度有一定的變化方向，例如，同系物極性遞減，而被非極性表面吸附的能力將遞增。1支持物的性質(zhì)與適用范圍薄層層析的支持劑較常用的是硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素、聚酰胺及deae纖維素。(1)硅膠 硅膠是應(yīng)用最廣泛的一種極性吸附劑。它的主要優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)惰性，具有較大的吸附量，易制備成不同類型、孔徑、表面積的多孔性硅膠，一般以sio2xh2o通式表示。硅膠的吸附活性取決于含水量，吸附層析一般采

28、用含水量為1012的硅膠，含水量小于1的活性最高，而大于20時(shí)，吸附活性最低。用加熱脫水法可使硅膠活化，降低吸附活性的硅膠能顯著改善分離性能，增加樣品的負(fù)載量。硅膠適用于分離酸性和中性物質(zhì)，堿性物質(zhì)能與硅膠作用，因此如用中性溶劑展開，堿性物質(zhì)有時(shí)留在原點(diǎn)不動(dòng)，或者斑點(diǎn)拖尾，而不能很好地分離。為了使某一類化合物得到滿意的分離，可改變硅膠酸堿性。例如，可用稀酸或稀堿液(0105moll)或一定ph值的緩沖溶液代替水制備酸性、堿性或某一ph值的薄層；也可在硅膠中加入氧化鋁(堿性)制成薄層；或在展開劑中加入少量的酸或堿進(jìn)行展層。使用硅膠和硅藻土?xí)r，通常要先加入粘合劑再在支持板上涂布。常用的粘合劑為煅石

29、膏和淀粉，在硅膠、氧化鋁和硅藻土中分別加入520石膏后，稱為硅膠g、氧化鋁g和硅藻土g。用煅石膏為粘合劑的薄層易從玻璃板上脫落，但具有耐腐蝕性試劑的優(yōu)點(diǎn)。加淀粉制成的薄層，機(jī)械性能較好，但不宜用腐蝕性強(qiáng)的試劑。(2)氧化鋁 氧化鋁為微堿性吸附劑，適用于親脂性物質(zhì)的分離制備，氧化鋁具有較高的吸附容量，價(jià)格低廉，分離效果好，因此應(yīng)用也較廣泛。在使用氧化鋁作吸附層析時(shí)，要注意選擇適當(dāng)活性及適當(dāng)酸堿度的產(chǎn)品。氧化鋁通?？砂粗苽浞椒ú煌譃閴A性、中性和酸性三種。堿性氧化鋁可應(yīng)用于碳?xì)浠衔锏姆蛛x；中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、某些苷類及酸堿溶液中不穩(wěn)定的酯、內(nèi)酯等化合物的分離；酸性氧化鋁適用于天然及合成

30、的酸性色素以及醛、酸的分離。(3)聚酰胺 聚酰胺由己二酸與己二胺聚合而成，也可用己內(nèi)酰胺聚合而成，因它們都含有大量酰胺基團(tuán)，故統(tǒng)稱聚酰胺。聚酰胺薄膜層析是1966年后發(fā)展起來的一種薄層層析方法，用此方法分析氨基酸衍生物dnp一氨基酸、pth一氨基酸、dns一氨基酸及dabth一氨基酸時(shí)，具有靈敏度高、分辨力強(qiáng)、展層迅速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。目前由國(guó)產(chǎn)原料制成的聚酰胺薄膜性能良好、效果滿意，已用于酚類、醌類、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸堿基、核苷、核苷酸、雜環(huán)化合物、合成染料；磺胺、抗菌素、環(huán)酮、殺蟲劑及維生素b等16類化合物的分析。(4)硅藻土和纖維素 它們是中性支持劑，需在吸附水、緩沖溶液

31、或甲酰胺等之后，才能用于薄層層析。2支持劑的顆粒大小用作薄層層析固定相的支持劑顆粒，要求大小適當(dāng)、均勻。顆粒過大，展開時(shí)溶劑推進(jìn)速率太快，分離效果不好；顆粒太小，展開太漫，斑點(diǎn)拖尾不集中，分離效果也差。顆粒大小固定在一定范圍內(nèi)并且薄層厚度均勻一致時(shí)，每次得出的rf值即可保持恒定。無機(jī)類支持劑的顆粒以150200目(直徑為00701mm)、薄層厚度為0251mm較合適。有機(jī)吸附劑如纖維素等的顆粒為70140目(直徑0102mm)、薄層厚度為12mm最恰當(dāng)。(三)薄層板制作薄層板制作簡(jiǎn)稱制板，是指作為固定相的支持劑被均勻地涂布在玻板上，形成一薄層。所用的玻板要求表面平滑、清潔。玻板的大小按需要選定

32、，常用的規(guī)格為6cm20cm、20cm20cm及25cm75cm。1軟板制作軟板也稱干板，是不加粘合劑，將支持劑干粉直接均勻地鋪在玻板上制成的。這種薄層板制作簡(jiǎn)單，展開快，但極易吹散。其具體制作方法如下：(1)選用直徑約為05cm的玻璃管一根，根據(jù)薄層的厚度(一般為041mm)在其兩端繞膠布數(shù)圈。(2)將支持物干粉倒在玻板上，固定玻板一端以防玻璃推進(jìn)時(shí)移動(dòng)。(3)將玻璃管壓在玻板上，將支持劑干粉由一端推向另一端即成薄層。2硬板制作硬板或稱濕板，是將支持劑加粘合劑和水或其他液體后，均勻地鋪在玻璃板上，再經(jīng)烘干而成的薄層板。制作方法可用專門的薄層制板器，也可用手工，均能得到滿意的效果。下面介紹三種

33、手工涂布制板的方法：(1)玻棒涂布 將支持劑用水或適當(dāng)溶劑調(diào)成膠漿，倒在玻板上，然后依軟板制作相同方法，用玻棒在玻板上將支持劑由一端向另一端推動(dòng)，即成薄層。(2)玻片涂布 在玻板兩旁放置兩塊稍厚的玻板，把支持劑膠漿倒在中間的玻板上，然后用另一塊玻片的邊緣將膠漿刮向另一端，即成一定厚度的薄層。干燥后用刀刮去薄板兩側(cè)的支持劑。更換玻板兩旁不同厚度的玻片，即可調(diào)節(jié)薄層的厚度。(3)傾斜涂布 將支持劑膠漿倒在玻片上，然后將玻板傾斜，使膠漿均勻涂布于玻板上。上述任何一種方法將支持劑均勻涂布于玻板上后，靜置片刻，待薄層表面無水漬后，置烘箱中，讓溫度升到100，持續(xù)1小時(shí)。關(guān)閉電源，待溫度降至接近室溫時(shí)，取

34、出薄層板，放入干燥器備用。此一步驟稱為活化。(四)點(diǎn)樣點(diǎn)樣是將經(jīng)處理后的樣品點(diǎn)加在薄層的特定部位，這是一項(xiàng)需要十分仔細(xì)的操作步驟，點(diǎn)樣的好壞會(huì)直接影響分離效果。點(diǎn)樣可用玻璃毛細(xì)管，如作定量測(cè)定，應(yīng)使用微量移液管或微量注射器，市售血球計(jì)數(shù)管經(jīng)加工磨尖頭部并標(biāo)定體積后使用也甚理想。點(diǎn)樣的位置，上行展開法一般點(diǎn)樣在離薄層下端45cm處，下行展開法在離上端68cm處。如作雙相紙層析分離，點(diǎn)樣處應(yīng)位于距薄層右側(cè)邊5cm與距底邊5cm直線的交點(diǎn)。薄層層析點(diǎn)樣方法應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：(1)樣品最好用具揮發(fā)性的有機(jī)溶劑(如乙醇、氯仿等)溶解，不應(yīng)用水溶液，因水分子與吸附劑的相互作用力較弱，當(dāng)它占據(jù)了吸附劑表面上的

35、活性位置時(shí)，就使吸附劑的活性降低，而使斑點(diǎn)擴(kuò)散。(2)點(diǎn)樣量不宜太多，否則會(huì)降低rf值，一般為幾到幾十g，體積為120g。(3)原點(diǎn)直徑要控制在2mm以內(nèi)。欲達(dá)此目的，就須分次點(diǎn)樣，邊點(diǎn)樣，邊用冷、熱風(fēng)交替吹干。(4)薄層板在空氣中不能放置太久，否則會(huì)因吸潮降低活性。(五)展層1展開劑的選擇選擇展開劑須視被分離物的極性及支持劑的性質(zhì)而定。對(duì)初選展開劑合適與否的評(píng)價(jià)，要根據(jù)其分離有效成分的效果來確定。如果不合適，還需進(jìn)行極性調(diào)整，直到達(dá)到對(duì)有效成分的完全分離為止。如果薄層層析所用的支持劑是吸附劑，在同一吸附劑上，不同化合物的吸附性質(zhì)有如下規(guī)律：飽和碳?xì)浠衔锊灰妆晃?；不飽和碳?xì)浠衔镆妆晃剑?/p>

36、分子中雙鍵愈多，則吸附得愈緊密；當(dāng)碳?xì)浠衔锉灰粋€(gè)功能基取代后，吸附性增大。吸附性較大的化合物，一般需用極性較大的溶劑才能推動(dòng)它。選擇展開劑的另一個(gè)依據(jù)是溶劑的極性大小。一般而論，在同一種支持劑上，凡溶劑的極性愈大，則對(duì)同一性質(zhì)的化合物的洗脫能力也愈大，即在薄層上能把此化合物推進(jìn)得愈遠(yuǎn)，rf值也愈大。如果用一種溶劑去展開某一成分，當(dāng)發(fā)現(xiàn)它的rf值太小時(shí)，可考慮換用一種極性較大的溶劑，或在原來的溶劑中加入一定量極性較大的溶劑進(jìn)行層層。溶劑極性大小的次序是：石油醚二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇甲醇水。2展層展層裝置種類較多，根據(jù)展層方式基本上可分上行、下行、連

37、續(xù)及水平式四種。不加粘合劑的薄層只能作近水平式(板與水平成10度20度角)的上行或下行展開。不論何種展層方式，展層容器必須關(guān)閉，并事先要使展開劑蒸氣達(dá)到飽和。容器的體積大小要視薄層板的面積而定，因?yàn)榇笕萜饕_(dá)到溶劑蒸氣飽和所需的時(shí)間比小的長(zhǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)證明，在不飽和的展層裝置中，由于混合展開劑內(nèi)含有幾種揮發(fā)性試劑，致使薄層板邊緣與中間的試劑比例不同，因此樣品在邊緣和中間展層的距離也不同，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響分離效果。薄層層析時(shí)為了獲得更好的分離效果，可采用雙向展層和分次展層。分次展層是先用一種溶劑展開至一定距離后，將薄層板取出，待溶劑揮發(fā)后再按同一方向用第二種溶劑展開。(六)顯色和

38、定量薄層板展開完成后，從展開裝置中取出，于室溫或烘箱中干燥，然后根據(jù)被分離物質(zhì)的種類和性質(zhì)，選用相應(yīng)的顯色劑噴霧顯色，或用紫外燈檢測(cè)被分離的物質(zhì)斑點(diǎn)，測(cè)量和計(jì)算各斑點(diǎn)的rf值。通過薄層層析被分離的各種溶質(zhì)組分在濾紙上移動(dòng)的速率通常用rf表示：rf組分移動(dòng)的距離溶劑前沿移動(dòng)的距離原點(diǎn)至組分斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)至溶劑前沿的距離。在薄層、溶劑、溫度等各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件恒定的情況下，各物質(zhì)的rf值是不變的，它不隨溶劑移動(dòng)距離的改變而變化。rf與分配系數(shù)k的關(guān)系：rf1(1+k)，是由薄層性質(zhì)決定的一個(gè)常數(shù)。由此可見，k值愈大，溶質(zhì)分配于固定相的趨勢(shì)愈大，而rf值愈小；反之，k值愈小，則分配于流動(dòng)相的趨勢(shì)愈大，

39、rf值是定性分析的重要指標(biāo)。在樣品所含溶質(zhì)較多或某些組分在單相薄層層析中的rf比較接近，不易明顯分離時(shí)，可采用雙相薄層層析法。該法是將濾紙?jiān)谀骋惶厥獾娜軇┫到y(tǒng)中按一個(gè)方向展層以后，即予以干燥，再轉(zhuǎn)向90度，在另一溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行展層，待溶劑到達(dá)所要求的距離后，取出薄層，干燥顯色，從而獲得雙相層析譜。應(yīng)用這種方法，如果溶質(zhì)在第一種溶劑中不能完全分開，而經(jīng)過第二種溶劑的層析能得以完全分開，大大地提高了分離效果。由于薄層層析在分析定量時(shí)需注意以下幾點(diǎn)：(1)在噴霧顯色時(shí)，不加粘合劑的薄層要小心操作，以免吹散吸附劑。(2)薄層層析還可以用強(qiáng)腐蝕性顯色劑，如硫酸、硝酸、鉻酸或其他混合溶液。這些顯色劑幾乎可以使所有的有機(jī)化合物轉(zhuǎn)變?yōu)樘?，如果支持劑是無機(jī)吸附劑，薄層板經(jīng)此類顯色劑噴霧后，被分離的有機(jī)物斑點(diǎn)即顯示黑色。此類顯色劑不適用于定量測(cè)定或制備用的薄層上。(3)如果樣品斑點(diǎn)本身在紫外光下不顯熒光，可采用熒光薄層檢測(cè)法，即在吸附劑中加入熒光物質(zhì)，或在制備好的薄層上噴霧熒光物質(zhì)，制成熒光薄