EB病毒檢測技術(shù)進展及臨床應(yīng)用

1、精選ppt,1,EB病毒檢測技術(shù)及臨床應(yīng)用,精選ppt,2,概述,Epstein-Barr病毒（EBV） 皰疹病毒科，亞科，嗜淋巴細胞病毒屬， 1964年由Epstein、Barr等人首次在非洲兒童的惡性淋巴瘤組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)。 EBV是是傳染性單核細胞增多癥的病原體，也是一種重要的腫瘤相關(guān)病毒，與鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖癥等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，被列為致癌性病毒之一。,精選ppt,3,概述,傳播途徑：EBV感染主要通過唾液接觸傳播，也可通過血液傳播； 人感染EBV后建立終身潛伏感染，人群感染率超過90%。 1-6歲兒童、14-20歲青少年及年輕成年人高度易感，發(fā)展中國家EBV感染

2、多發(fā)生在兒童早期。,精選ppt,4,病原學(xué),皰疹病毒科，皰疹病毒亞科，淋巴隱病毒屬，人皰疹病毒4型 球形雙鏈DNA病毒，基因組平均大小約為172 kb,精選ppt,5,精選ppt,6,精選ppt,7,EBV致病機制,原發(fā)EBV感染時，EBV先是在口咽部上皮細胞內(nèi)增殖，然后感染附近的B淋巴細胞，受到感染的B淋巴細胞進入血液循環(huán)可以造成全身性感染。 EBV原發(fā)感染后，大多數(shù)無臨床癥狀，尤其是6歲以下幼兒大多表現(xiàn)為隱性或輕型發(fā)病，但在兒童期、青春期和青年期 ，約50%的原發(fā)性感染均表現(xiàn)為IM。,精選ppt,8,EBV致病機制,EBV在人體B細胞建立潛伏感染，EBV只表達潛伏抗原（包括EBNA-1、E

3、BNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及EBER），受感染者將成為終身帶毒者。 在機體免疫功能下降和某些因素觸發(fā)下，潛伏的EBV可以被再激活，引起病毒復(fù)制及臨床疾病。,精選ppt,9,EBV常見相關(guān)疾病,傳染性單核細胞增多癥 （Infectious mononucleosis,IM) 慢性活動性EB病毒感染 （Chronic active EBVinfection，CAEBV） EB病毒相關(guān)性嗜血細胞綜合征 （EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS) Burkitts淋巴瘤 何奇金

4、淋巴瘤,精選ppt,10,EBV感染的抗原表達,EBV溶解性感染期，可表達： 早期抗原（EA）： EA/R和EA/D（具DNA多聚酶活性）； EA出現(xiàn)表明EBV活躍增殖，EA抗體出現(xiàn)在感染早期； 衣殼蛋白（VCA） 晚期表達的結(jié)構(gòu)蛋白 VCA-IgM出現(xiàn)在急性感染早期，VCA-IgG出現(xiàn)在急性感染期并持續(xù)存在 膜抗原（MA）： 細胞表面包膜糖蛋白（MA gp350/220,gp85)，是EBV的中和性抗原 抗MA-IgM可用于早期診斷,精選ppt,11,EBV潛伏感染期，選擇性表達早期抗原以及： 核抗原（EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C）： 為DNA結(jié)合蛋白，在感染的B細胞核

5、內(nèi)； EBNA-1與感染有關(guān)，EBNA-2與細胞轉(zhuǎn)化和永生化有關(guān)； EBNA抗體出現(xiàn)在感染晚期。 潛伏膜蛋白（LMP-1,-2A,-2B）： 在感染B細胞表面，與細胞惡化有關(guān)， 未翻譯的轉(zhuǎn)錄物BARF0和EBER EBNA-3、EBNA-2、LMP-1是EBV-CTL CD8+的主要目標,EBV感染的抗原表達,精選ppt,12,原發(fā)性EBV感染過程中首先產(chǎn)生針對衣殼抗原（capsid antigen, VCA）IgG和IgM，在急性感染的晚期，抗早期抗原（early antigen, EA）抗體出現(xiàn)在恢復(fù)期晚期，抗核抗原（nuclear antigen, NA）抗體產(chǎn)生， 抗VCA-IgG和抗

6、NA-IgG可持續(xù)終身,精選ppt,13,EBV感染的血清學(xué)診斷,精選ppt,14,傳統(tǒng)檢測策略的問題,精選ppt,15,EBV感染的血清學(xué)診斷,抗VCA-IgM和IgG可以同時出現(xiàn)，通常IgG出現(xiàn)較IgM晚，但偶爾較IgM出現(xiàn)早12周，抗VCA-IgM幾周后檢測不到 抗EA-IgG在發(fā)病后3-4周后升高，34月后檢測不到 抗EBNA-1-IgG在發(fā)病后34周被檢測到，持續(xù)終身，部分慢性EBV感染者檢測不到 抗VCA-IgG和抗EBNA-1-IgG終生持續(xù)陽性,精選ppt,16,EBV常見相關(guān)疾病,精選ppt,17,傳染性單核細胞增多癥(IM)infectious mononucleosis,

7、特指由EBV感染引起的發(fā)熱、咽炎和淋巴結(jié)腫大的綜合征 1889年被首次描述為“glandular fever” 1920年正式定義為IM 1932年發(fā)現(xiàn)嗜異性凝集實驗 1968年實驗室工作人員感染EBV，出現(xiàn)IM臨床癥狀和嗜異性凝集抗體，明確EBV是IM的病原,精選ppt,18,IM臨床表現(xiàn),25-30%的青少年和30歲的成年人原發(fā)感染EBV后表現(xiàn)IM 兒童時期EBV感染多為亞臨床型或不典型癥狀 臨床癥狀：發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、扁桃體炎（灰白色滲出）、咽炎、肝脾腫大、眼瞼水腫和皮疹、上腭粘膜出血點 皮疹經(jīng)常發(fā)生于使用氨芐西林、阿莫西林和一些內(nèi)酰胺類抗生素1周后，發(fā)生率90% 并發(fā)癥：粒細胞減少、血

8、小板減少、脾破裂、扁桃體肥大致氣道阻塞、暴發(fā)性肝炎、溶血性貧血、再生障礙性貧血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,精選ppt,19,精選ppt,20,慢性活動性EBV感染, CAEBV chronic active EBV infection,1975年Horwitz首次描述一些持續(xù)性IM患者血清存在高滴度的抗EBV-VCA和EA抗體 1982年Tobi進一步描述并證實該病 1984年被稱為慢性單核細胞增多樣綜合征 1986年被定義為慢性癥狀性EBV感染 1991年被稱為慢性活動性EBV感染,精選ppt,21,CAEBV,發(fā)生于兒童或年輕成年人 該病表現(xiàn)為慢性或反復(fù)的單核細胞增多樣癥：發(fā)熱、肝脾腫大、持續(xù)性肝

9、炎、廣泛性淋巴結(jié)腫大 EBV感染的NK和T細胞克隆擴增在CAEBV具有重要意義 通常是一種腫瘤前狀態(tài)或者與嚴重免疫缺陷有關(guān)，可進一步引起EBV相關(guān)的T/NK細胞增殖性疾病 預(yù)后差，病死率高,精選ppt,22,CAEBV的診斷標準,1）持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作的IM樣癥狀 2）異常升高的抗VCA-IgG和EA-IgG 和/或受累組織包括外周血檢測到EBV基因組 3）慢性疾病不能以其他已知的疾病解釋,Okana M, et al. Proposed guidelines for diagnosing chronic active Epstein-Barr virus infection. America

10、J Hematol.2005,80:64-69,精選ppt,23,Hydroavacciniforme牛痘樣水皰,hypersensitivity to mosquito bites,精選ppt,24,CAEBV的診斷標準(1),臨床癥狀 持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作的IM樣癥狀 發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大 并發(fā)癥： 血液系統(tǒng)（EBV-HLH、淋巴瘤、白血病、DIC、血小板減少、貧血） 消化系統(tǒng)（肝功能衰竭、消化道潰瘍） 中樞神經(jīng)系統(tǒng) 間質(zhì)性肺炎 心血管（冠狀動脈瘤、心肌炎、心瓣膜病） 皮膚（蚊蟲叮咬過敏、皮膚牛痘樣水皰 ）,精選ppt,25,CAEBV的診斷標準(2),血清抗體滴度異常升高 抗VCA-I

11、gG1:640和抗EA-IgG1:160 抗VCA-IgA和/或抗EA-IgA常呈陽性 受累組織和外周血檢測到EBV-DNA、RNA、有關(guān)抗原和克隆 PCR：外周血PBMC中EBV-DNA定量102.5copies/g 原位雜交：檢測出EBER-1陽性細胞 Southern雜交：受累組織或外周血中檢測出EBV DNA 免疫熒光：檢測到抗原（EBNA、LMP） 感染的B、T、NK細胞、單核/巨噬/組織細胞檢測到EBNA、EBER、EBV-DNA,精選ppt,26,EBV相關(guān)的噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥EBV-associated hemophagocytic lymphohistocytosi

12、s EBV-HLH,是一種與EBV感染有關(guān)的淋巴增殖伴隨吞噬血細胞現(xiàn)象的一類疾病 EBV感染所致CD8+T細胞的異常增殖及其激活巨噬細胞，導(dǎo)致炎癥細胞因子大量釋放產(chǎn)生高細胞因子血癥（細胞因子風(fēng)暴）是EBV-HLH的主要病例生理特征 臨床表現(xiàn)發(fā)熱、肝脾腫大、黃疸、全血細胞減少、DIC，骨髓和其他組織見嗜血細胞、LDH、鐵蛋白、微球蛋白 EBV-HLH常見于兒童和青少年,精選ppt,27,抗EBV病毒藥物,無環(huán)核苷擬似劑 acyclovir（阿昔洛韋），ED50 0.3 ganciclovir（更昔洛韋）， ED50 0.05 valaciclovir（纈昔洛韋 ） 無環(huán)核苷酸 cidofovir

13、，adefovir 焦磷酸鹽 擬似劑 foscarnet（磷甲酸鈉） 作用機制 作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒復(fù)制,精選ppt,28,EBV感染的實驗室診斷,外周血分類 淋巴細胞50% WBC 不典型淋巴細胞10% WBC（系激活的CD8+ CTL） 血清學(xué)檢查 嗜異性凝集實驗（heterophile test/spot test） VCA-IgM、IgG，EA-IgG，EBNA-IgG 病毒學(xué)標志 在PBMC、血清、全血或感染組織檢測EBV-DNA、EBER、EBNA、LMP,精選ppt,29,EBV感染疾病的血清學(xué)診斷,精選ppt,30,臨床需要回答的問題,是否感染EBV? EBV感染的時

14、相？ 是否EBV活動性感染？ 疾病是否與EBV感染相關(guān)？,精選ppt,31,EBV實驗室檢測方法,病毒培養(yǎng) 免疫學(xué)技術(shù)（免疫熒光法，免疫組化技術(shù)） 血清學(xué)方法（ELISA法，化學(xué)發(fā)光法） 基因診斷技術(shù),精選ppt,32,EBV實驗室檢測方法,嗜異凝集抗體試驗：也稱“Monospot”試驗。在EBV還未確定為IM的病因之前，1932年引入臨床實踐診斷IM。 當時發(fā)現(xiàn)IM患者的血清或血漿可以凝集馬或綿羊的紅細胞。該抗體在病程第12周出現(xiàn)，持續(xù)約6個月。 在青少年原發(fā)性EBV感染中其陽性率可達80-90，約10的青少年缺乏對嗜異性抗體的陽性反應(yīng)。,精選ppt,33,EBV感染的血清學(xué)診斷評價,嗜異性

15、抗體（heterophile antibody，HA）凝集實驗（“spot” test） 嗜異性抗體（IgM）在發(fā)病后7天內(nèi)出現(xiàn)，2-5周達高峰，可以持續(xù)6-12個月，偶有12個月后以低水平存在 HA陽性提示原發(fā)急性感染，EBV再激活感染幾乎陰性 陽性率：青少年和成年人71%-90%， 2-5歲兒童50% 假陰性：發(fā)病第1周內(nèi)假陰性率25%，10%成人始終陰性 假陽性：2-3%自身免疫性疾病、HIV感染、心內(nèi)膜炎、HAV肝炎,精選ppt,34,缺點 需要硬件設(shè)備 成本昂貴,優(yōu)點 敏感性高 特異性強 操作簡便,化學(xué)發(fā)光技術(shù),精選ppt,35,膠體金是氯金酸HAuCl4的水溶膠，氯金酸在還原劑的作

16、用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),簡便，快捷，敏感度和特異度較差,精選ppt,36,EBERS原位雜交試驗 EBV潛伏感染的細胞含有大量的EBERlEBER2（EBERS）轉(zhuǎn)錄子，其主要功能是抑制干擾素介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)和凋亡。該轉(zhuǎn)錄子不翻譯成蛋白質(zhì)，每個EBV潛伏感染的細胞含有大約106拷貝EBERS，被認為EBV潛伏感染的最好標志物，因此原位雜交檢測腫瘤細胞中EBERS是診斷腫瘤是否EBV相關(guān)的金標準,EBV實驗室檢測方法,精選ppt,37,EBV病毒核酸檢測,實時熒光定量PCR是目前最主要的監(jiān)測EBV載量的方法 鑒別EBV健康攜帶者的低水平復(fù)制與EBV相關(guān)

17、疾病患者高水平活動性感染。,精選ppt,38,EBV載量檢測有多種方法，Real-time PCR是目前最主要的監(jiān)測EBV載量的方法，有較強的敏感性和特異性。不同的EBV疾病進行Real-time PCR檢測時，需要的標本不同。,EBV病毒核酸檢測,精選ppt,39,EBV相關(guān)性疾病的病毒DNA定量檢測,血清游離的EBV-DNA提示原發(fā)感染或者再激活 健康攜帶者血清EBV-DNA通常檢測不到,精選ppt,40,精選ppt,41,精選ppt,42,精選ppt,43,傳單的EBV感染實驗室診斷,血清學(xué)檢測： 同時滿足下列2條者可以診斷為EBV-IM: 1.下列臨床癥狀中的3項：發(fā)熱、咽峽炎、頸淋巴

18、結(jié)腫大、肝腫大、脾腫大； 2.原發(fā)性EBV感染的血清學(xué)證據(jù)，滿足下列2條中任一項： （1）抗EBV-CA-IgM和抗EBV-CA-IgG陽性，且抗EBV-NA-IgG陰性 （2）抗EBV-CA-IgM陰性，但抗EBV-CA-IgG陽性，且為低親和力抗體,精選ppt,44,傳單的EBV感染實驗室診斷,DNA檢測？: IM患者外周血中EB病毒載體在2周內(nèi)達到峰值，隨后很快下降。 至病程14天，多數(shù)EBV-IM患者血清中已檢測不到病毒核酸，病程22天后，所有EBV-IM患者血清中均檢測不到病毒核酸。 IM患者不推薦進行EB病毒載量檢測,45,慢性活動性EBV感染的實驗室診斷,EBV抗體檢測,精選ppt,46,慢性活動性EBV感染的實驗室診斷,DNA檢測 絕大多數(shù)CAEBV患者PBMC中EBV-DNA水平高于102.5拷貝/ug DNA 部分CAEBV患者血漿/血清中EBV-DNA陰性 CAEBV患者血漿/血清中EBV-DNA水平與病情嚴重程度和預(yù)后有關(guān),47,EB病毒相關(guān)噬血淋巴組織細胞增生癥,EBV-HLH可以發(fā)生在原發(fā)性EBV感染時期，既往EBV感染再激活時期 EBV-HLH患者血清中EBV抗體反應(yīng)呈多種反應(yīng)類型， 單純血清EBV