酶活性的測(cè)定課件

1、酶活性的測(cè)定,1,過(guò)氧化物酶()活性的測(cè)定愈創(chuàng)木酚法,一、實(shí)驗(yàn)原理 過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)的反應(yīng)，產(chǎn)物為醌類(lèi)化合物。 實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚為過(guò)氧化物酶的底物。在此酶存在下，H2O2 將愈創(chuàng)木酚氧化生成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470nm 有最大光吸收，故可通過(guò)470nm處的吸光度變化測(cè)定過(guò)氧化物酶的活性。,酶活性的測(cè)定,2,二、材料和設(shè)備,、材料 ：馬鈴薯塊莖 、儀器設(shè)備：751 型分光光度計(jì)、離心機(jī)、研缽、25ml 容量瓶、量筒、試管、吸量管。 、試劑：0.05ml/L愈創(chuàng)木酚溶液， 0.05ml/L的磷酸緩沖液(pH5.5)， 2%H2O2，0.1mol/L兒茶酚溶液， 20%三氯乙酸溶液,酶

2、活性的測(cè)定,3,三、實(shí)驗(yàn)步驟,、酶液的制備 取5.0g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放入研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于3000g水中離心10min，上清液轉(zhuǎn)入25ml 容量瓶中。沉淀用5ml磷酸緩沖液再提取次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下保存?zhèn)溆谩?酶活性的測(cè)定,4,、過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定 酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系包括:2.9ml 0.05mol/L磷酸緩沖液、1.0ml 2%H2O2、1.0ml 0.05mol/L 愈創(chuàng)木酚和0.1ml酶液。 以在沸水中加熱5min的酶液為對(duì)照，做二組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系加入酶液后，立即于37水浴中保溫15min，然后迅

3、速轉(zhuǎn)入冰浴中，并加入2.0ml 20%三氯乙酸終止反應(yīng)。然后，過(guò)濾(或5000g 離心10min),濾液適當(dāng)稀釋?zhuān)?51型分光光度計(jì)在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度。,酶活性的測(cè)定,5,四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以每min內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活力單位 酶活力=D 酶的比活力=D 式中， A為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為馬鈴薯鮮重（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；D為稀釋倍數(shù)，即提取的總酶液為反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)酶液的倍數(shù),A,0.01t,A,0.01Wt,酶活性的測(cè)定,6,CAT過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法,酶活性的測(cè)定,7,過(guò)氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)又名觸酶(Catal

4、ase，CAT)，是一類(lèi)以鐵卟琳為輔基的結(jié)合酶，由4個(gè)亞基組成，分子量為240 000。存在于動(dòng)植物組織與細(xì)胞中的氧化還原酶類(lèi)，它專(zhuān)一性地將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的過(guò)氧化氫分解成H2O和02，避免了H202在體內(nèi)積累，從而可維持體內(nèi)正常的活性氧水平。是最早發(fā)現(xiàn)的與種子活力有關(guān)的氧化酶類(lèi)之一.,酶活性的測(cè)定,8,過(guò)氧化氫酶的應(yīng)用：,被用于食品包裝，防止食物被氧化。 在紡織工業(yè)中，被用于除去紡織物上的過(guò)氧化氫，以保證成品是不含過(guò)氧化物的。 它還被用在隱形眼鏡的清潔上：眼鏡在含有過(guò)氧化氫的清潔劑中浸泡后，使用前再用過(guò)氧化氫酶除去殘留的過(guò)氧化氫。 近年來(lái)，過(guò)氧化氫酶開(kāi)始使用在美容業(yè)中。一些面部護(hù)理中加入了該酶和

5、過(guò)氧化氫，目的是增加表皮上層的細(xì)胞氧量。 植物細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶體參與了光呼吸（利用氧氣并生成二氧化碳）和共生性氮固定（將氮?dú)?N2）解離為活性氮原子）。細(xì)胞被病原體感染時(shí)，過(guò)氧化氫可以被用作一種有效的抗微生物試劑。 其活性也與糧食品質(zhì)之間有一定的相關(guān)性，是一項(xiàng)衡量谷物品質(zhì)的重要指標(biāo)。,酶活性的測(cè)定,9,過(guò)氧化氫酶的測(cè)定：,化學(xué)測(cè)定法：高錳酸鉀滴定法，碘量法。 光度法：紫外分光光度法，熒光分析法，化學(xué)發(fā)光法。 電化學(xué)法：極譜氧電極法，電流測(cè)定法，電泳一染色法。 放射化學(xué)測(cè)定法。 簡(jiǎn)易氣量測(cè)定法。,酶活性的測(cè)定,10,高錳酸鉀滴定法：,過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫

6、分解為水和分子氧，在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。 據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2 。 即可求出消耗的H2O2的量。,酶活性的測(cè)定,11,酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示： 酶活(mgH2O2/gFWmin)= 式中 A對(duì)照KMnO4滴定毫升數(shù)； B酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)； VT酶液總量（ml）； V1反應(yīng)所用酶液量（ml）; W樣品鮮重（g）； 1.71ml 0.1mol/L的KMnO4相當(dāng)于

7、1.7mg H2O2。,酶活性的測(cè)定,12,紫外分光光度法: H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活性。 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。 過(guò)氧化氫酶活性(u/gFW/min)= 式中 A240 = AS0 AS0加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值； AS1, AS2樣品管吸光值； Vt粗酶提取液總體積（ml）； V1測(cè)定用粗酶液體積（ml）； FW樣品鮮重（g）； 0.1A240每下降0.1為1個(gè)酶活單位（u）； t加過(guò)氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間（min）。,

8、酶活性的測(cè)定,13,方法比較： 研究認(rèn)為，化學(xué)滴定法重復(fù)性差、緊密度低、操作繁瑣、檢測(cè)線低，不適于大批量的樣品測(cè)定。其優(yōu)點(diǎn)是不需要任何特殊的儀器，適用性比較廣泛。 紫外分光光度法具有重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)線相對(duì)較低得到優(yōu)點(diǎn)。但是對(duì)于測(cè)定底物或產(chǎn)物改變量方面不太準(zhǔn)確。,酶活性的測(cè)定,14,總結(jié)：,綜上所述，過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定的方法大都基于過(guò)氧化氫酶催化過(guò)氧化氫的分解反應(yīng)：根據(jù)反應(yīng)生成的氧氣的量、反應(yīng)剩余的過(guò)氧化氫的量或根據(jù)反應(yīng)時(shí)的電子的轉(zhuǎn)移及電流的變化等。同時(shí)，影響測(cè)定結(jié)果的因素很多，如過(guò)氧化氫的濃度、酸度、溫度及重金屬的含量等；并且各種方法的準(zhǔn)確性和靈敏度也有一定差異。因此，在測(cè)定CA

9、T活性時(shí)，應(yīng)該根據(jù)具體組織種類(lèi)及測(cè)量要求選擇適合的測(cè)定的方法。,酶活性的測(cè)定,15,抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定 在茶葉中,酶活性的測(cè)定,16,實(shí)驗(yàn)原理,APX（抗壞血酸過(guò)氧化物酶）催化AsA與H2O2反應(yīng)而使H2O2:2AsA+ H2O22MD-AsA( 單脫氫抗壞血酸)+2H2O。抗壞血酸過(guò)氧化物酶是以抗壞血酸為電子供體的，APX首先與H2O2形成中間復(fù)合物，中間復(fù)合物接著氧化AsA形成產(chǎn)物，當(dāng)AsA未被復(fù)合物利用時(shí)，APX失活。只要AsA能夠再生，APX就能充分進(jìn)行催化反應(yīng)，從而保護(hù)葉綠體維持正常的光合能力。,酶活性的測(cè)定,17,APX酶液的制備,稱(chēng)取0.5g的茶樹(shù)鮮葉剪碎，加入

10、適量的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液，在冰浴中充分研磨，離心（10000g、4、20min）取上層清夜1mL，分裝于小離心管中置于4備用或-20保存。,酶活性的測(cè)定,18,APX活性的測(cè)定,提取液：50mmol/LPBS（磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液），pH7.8；2mmol/L AsA；5mmol/L EDTA。 反應(yīng)液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5mmol/L AsA；0.1 mmol/L EDTA。 在三個(gè)比色皿中各加入20L鮮葉APX粗酶液，再加入3mL反應(yīng)液；1號(hào)比色皿中不加AsA和H2O2啟動(dòng)反應(yīng)；每10s連續(xù)記錄室溫下290nm吸光值的變化X。室溫下每一分鐘氧

11、化1molAsA的酶量作為一個(gè)酶活性單位（U）。,酶活性的測(cè)定,19,計(jì)算公式,每克鮮葉APX的酶活性U=（X7.51000601000）/（m2.82010） 上式中，X：OD值的變化；7.5：每克材料提取7.5mL粗酶液；1000：將ml轉(zhuǎn)化成L；60：將1min轉(zhuǎn)化成60s；1000：將mmol轉(zhuǎn)化成mol；m：鮮葉的重量，單位為g；2.8：吸光系數(shù)mmol/L cm；20：用20L酶液進(jìn)行活性測(cè)定；10：每10s記錄吸光值的變化。,酶活性的測(cè)定,20,測(cè)定茶樹(shù)鮮葉APX活性的最佳條件,PVPP的加入量為鮮葉重的1.5倍，提取液pH為7.8，反應(yīng)液pH為7.0，底物AsA濃度為0.5mm

12、ol/L。,酶活性的測(cè)定,21,注意事項(xiàng)：,（1）由于測(cè)定反應(yīng)是通過(guò)測(cè)定反應(yīng)底物AsA的降低來(lái)計(jì)算APX活性，因此所加的酶量一般不宜過(guò)大，應(yīng)使加液量控制在60s內(nèi)，使產(chǎn)生的A290光值下降呈良好的線性關(guān)系。 （2）由于此反應(yīng)中AsA和H2O2量都很少，可以將30%的H2O2稀釋500倍，在測(cè)定時(shí)直接吸取15L的H2O2與3mL反應(yīng)液將加入到比色皿中，啟動(dòng)反應(yīng)。 （3）H2O2由于本身對(duì)AsA的氧化作用在測(cè)定時(shí)間內(nèi)可以忽略不計(jì)。,酶活性的測(cè)定,22,超氧化物歧化酶（SOD）的活性測(cè)定,酶活性的測(cè)定,23,黃嘌呤氧化酶法,原理:通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-），后者氧

13、化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專(zhuān)一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。,酶活性的測(cè)定,24,實(shí)驗(yàn)試劑： 硫酸鹽緩沖液，鹽酸羥胺，黃嘌呤，黃嘌呤氧化酶，醋酸等。,酶活性的測(cè)定,25,實(shí)驗(yàn)步驟：,酶活性的測(cè)定,26,計(jì)算方法：,每毫升反應(yīng)液中SOD 抑止率達(dá)50時(shí)對(duì)應(yīng)的SOD 量為一個(gè)SOD 活力單位（U），待測(cè)樣品中的SOD 活力由下式計(jì)算： SOD抑制率（）（A2-A1）/A2100% SOD 活力（U/ml）（A2-

14、A1）/A2100%50反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù) 式中：A1:測(cè)定管的吸光值；A2:空白管的吸光值。,酶活性的測(cè)定,27,鄰苯三酚自氧化法,原理： 在堿性條件下, 鄰苯三酚迅速氧化釋放出超氧化物陰離子，生成有色中間產(chǎn)物，吸光度隨之增加，使吸光度值與反應(yīng)時(shí)間呈良好的線性關(guān)系。 SOD 加入鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系后，催化超氧化物陰離子生成過(guò)氧化氫，使有色中間產(chǎn)物的生成受阻，導(dǎo)致吸光值下降，鄰苯三酚自氧化速率降低，可作為測(cè)定 SOD 活性的理論依據(jù)。,酶活性的測(cè)定,28,1.試劑： 0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.2內(nèi)含 2mmol/L EDTA)0.2mol/L （Tris）三羥甲基氨基甲烷(內(nèi)含 4mmol/L 乙二胺四乙酸EDTA )100ml 與 0.2mol/L HCl44.76ml 混合加雙蒸水至 200ml調(diào) pH8.20.01;鄰苯三酚(45mmol/L)以 10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液存放于冰箱備用。 2.儀器: 紫外分光光度計(jì)，酸度計(jì)，恒溫水浴鍋,酶活性的測(cè)定,29,實(shí)驗(yàn)步驟：,（1）.鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定： 在試管中加入4.5ml