實驗七---DNA的瓊脂糖凝膠電泳

1、實驗七-DNA的瓊脂糖凝膠電 泳實驗七 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳( 4 學時)實驗目的瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法，具有操作方便、經(jīng)濟快速等優(yōu)點。 本實驗學習 DNA 瓊脂糖凝膠電泳的使用技術， 掌握有關的技術和識讀電泳圖譜 的方法。實驗原理瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA 、RNA 分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物， 利用 DNA 分子在泳動時的電荷效應和分 子篩效應， 達到分離混合物的目的。 DNA 分子在高于其等電點的溶液中帶負電， 在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下， DNA 分子的遷移速度取決于分子 篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因

2、素。 DNA 分子的遷移速度與 其相對分子量成反比。不同構型的 DNA 分子的遷移速度不同。如環(huán)形 DNA 分 子樣品，其中有三種構型的分子：共價閉合環(huán)狀的超螺旋分子(cccDNA )、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的 遷移速度大小順序為：cccDNA IDNA ocDNA核酸分子是兩性解離分子， pH3.5 是堿基上的氨基解離，而三個磷酸基團中 只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負極泳動；而 pH8.0-8.3 時， 堿基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分子帶負電，在電場中向正極泳 動。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對

3、泳動速度影響不大。在中性 或堿性時，單鏈 DNA 與等長的雙鏈 DNA 的泳動率大致相同。影響核酸分子泳動率的因素主要是：1、樣品的物理性狀即分子的大小、電荷數(shù)、顆粒形狀和空間構型。一般而言，電荷密度愈大，泳 動率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對泳動率的影響不明 顯。對線形分子來說，分子量的常用對數(shù)與泳動率成反比，用此標準樣品電泳并測定其泳動率，然后進行DNA分子長度（bp）的負對數(shù)一一泳動距離作標準曲線 圖，可以用于測定未知分子的長度大小。DNA 分子的空間構型對泳動率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動率的大小順序 為：cDNA IDNA ocDNA但是由于瓊脂糖濃度、電場強度、

4、離子強度和溴化 乙錠等的影響，會出現(xiàn)相反的情況。2、支持物介質(zhì)核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合 鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，是 于分離不同濃度范圍的核酸分子。 聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N- 四甲基乙四胺（TEMED ）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形成長鏈，并通過 交聯(lián)劑N,N-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）交叉連接而成，其網(wǎng)孔的大小由 Acr與Bis 的相對比例決定。瓊脂糖凝膠適合分離長度 100至 60 的分子，而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段（5bp-500bp ）的分離效果最好。選擇不同濃度的凝膠，可以分

5、離不同大小范圍 的 DNA 分子。3、電場強度電場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而 減小，所以電泳時一般采用低電壓，不超過4V/cm。而對于大片段電泳，甚至用 0.5-1.0V/cm 電泳過夜。進行高壓電泳時，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。4、緩沖液離子強度核酸電泳常采用 TAE、 TBE、 TPE 三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊。 TAE 價格 低廉，但緩沖能力低，必須進行兩極緩沖液的循環(huán)。 TPE 在進行 DNA 回收時， 會使 DNA 污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應。所以多采用 TBE 緩沖液。在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價離子，抑制 DNase，保護DNA。緩沖

6、液 pH 常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負電，向正極移動 核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ ethidium bromide EB ）。溴化乙錠是 種扁平分子，可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射 BE-DNA 復合 物時，出現(xiàn)不同的效應。 254nm 的紫外線照射時，靈敏度最高，但對 DNA 損傷 嚴重； 360nm 紫外線照射時，雖然靈敏度較低，但對 DNA 損傷小，所以適合對 DNA 樣品的觀察和回收等操作。 300nm 紫外線照射的靈敏度較高，且對 DNA 損傷不是很大，所以也比較適用。使用溴化乙錠對DNA樣品進行染色，可以在凝膠中加入終濃度為0.5卩g/m的EB。EB摻入D

7、NA分子中，可以在電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況，但是 如果要測定核酸分子大小時，不宜使用以上方法，而是應該在電泳結束后，把 凝膠浸泡在含0.5卩g/mlEB的溶液中1030min進行染色。BE見光分解，應在 避光條件下4C保存。材料、試劑及器具1 、材料1kbMarker （分子量標準）； DNA 樣品2、試劑加樣緩沖液（6x）: 0.25%溴酚蘭，40%蔗糖；瓊脂糖；溴化乙錠（EB ）;酶 液（ 10mg/ml）。3、器具（ 1）電泳系統(tǒng)：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。（ 2）紫外透射儀。操作步驟1、按所分離的 DNA 分子的大小范圍，稱取適量的瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶 中，加入適量的0

8、.5河BE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透 明。稍搖勻，得膠液。冷卻至 60C左右，在膠液內(nèi)加入適量的溴化乙錠至濃度 為 0.5 卩 g/m。2、取有機玻璃制膠板槽，有透明膠帶沿膠槽四周封嚴，并滴加少量的膠液封好 膠帶與膠槽之間的縫隙。3、 水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60C左右的膠液， 使之形成均勻水平的膠面。4、.待膠凝固后，小心拔起梳子，撕下透明膠帶，使加樣孔端置陰極段放進電泳 槽內(nèi)。5、在槽內(nèi)加入0.5 XBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面6、把待檢測的樣品，按以下量在潔凈載玻片上小心混勻，用移液槍加至凝膠的 加樣孔中。1卩加樣緩沖液（6% +5卩待測

9、DNA樣品+0.5卩1EB（ 10mg/ml）（注：若膠內(nèi)未加 EB，可選用此法）。7、接通電泳儀和電泳槽， 并接通電源， 調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出， 電壓最高不超過 5V/cm， 開始電泳。點樣端放陰極端。根據(jù)經(jīng)驗調(diào)節(jié)電壓使分帶清晰。8、 觀察溴酚蘭的帶（藍色）的移動。當其移動至距膠板前沿約1cm處，可停止 電泳。9、染色：把膠槽取出， 小心滑出膠塊， 水平放置于一張保鮮膜或其他支持物上， 放進 EB 溶液中進行染色，完全浸泡約 30min。10、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把已染色的凝膠放在上面。關上樣品室外門，打開紫外燈（360nm或254nm），通過觀察孔進行觀察。

10、注意事項1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強致癌性物質(zhì)，務必小心，勿沾 染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的電泳區(qū)域操作，戴 一次性手套，并及時更換。2、預先加入 EB 時可能使 DNA 的泳動速度下降 15% 左右，而且對不同構型的 DNA 的影響程度不同。所以為取得較真實的電泳結果可以在電泳結束后再用0.5卩g/m勺EB溶液浸泡染色。若膠內(nèi)或樣品內(nèi)已加 EB，染色步驟可省略；若 凝膠放置一段時間后才觀察，即使原來膠內(nèi)或樣品已加 EB，也建議增加此步。3、加樣進膠時不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時清除，否則，需重新 制膠。4、以0.5來BE作為電泳緩沖液時，溴酚蘭在 0.5%1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳 動速度大約相當于 300bp 勺