蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)

1、蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)就是為有目的的蛋白質(zhì)工程改造提供設(shè)計(jì)方案。雖然經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)歲月的進(jìn)化，自然界已經(jīng)篩選出了數(shù)量眾多、種類(lèi)各異的蛋白質(zhì)，但天然蛋白質(zhì)只是在自然條件下才能起到最佳功能，在人造條件下往往就不行，例如工業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的高溫高壓條件。因而需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，使其能夠在特定條件下起到特定的功能。蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)又可按照改造部位的多寡分為三類(lèi)：第一類(lèi)為“小改”，可通過(guò)定位突變或化學(xué)修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)；第二類(lèi)為“中改”，對(duì)來(lái)源于不同蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝；第三類(lèi)為“大改”，即完全從頭設(shè)計(jì)全新的蛋白質(zhì)（de novo design）。有關(guān)全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的內(nèi)容請(qǐng)參見(jiàn)文獻(xiàn)，本文不贅述。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)工程改造包括提

2、高蛋白的熱、酸穩(wěn)定性，增加活性，降低副作用，提高專(zhuān)一性以及通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究等。由于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的了解不夠深入，成功的實(shí)例還不很多，因此更需要在蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的方法學(xué)上開(kāi)展深入研究。蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)可分為兩個(gè)層次，一種是在已知立體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上所進(jìn)行的直接將立體結(jié)構(gòu)信息與蛋白質(zhì)的功能相關(guān)聯(lián)的高層次的設(shè)計(jì)工作，另一種是在未知立體結(jié)構(gòu)的情形下借助于一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)所進(jìn)行的分子設(shè)計(jì)工作。此處只探討第一類(lèi)分子設(shè)計(jì)，因?yàn)樵诶萌?jí)結(jié)構(gòu)信息的同時(shí)也運(yùn)用了一級(jí)結(jié)構(gòu)序列及有關(guān)生化信息，第一類(lèi)的分子設(shè)計(jì)工作實(shí)際上已包含了第二類(lèi)工作，而后者實(shí)際上是在不得已的情形下所進(jìn)行

3、的努力。蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的過(guò)程簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)就是首先建立所研究對(duì)象的結(jié)構(gòu)模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究，然后提出設(shè)計(jì)方案，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后進(jìn)一步修正設(shè)計(jì)，往往需要幾次循環(huán)才能達(dá)到目的。一般的分子設(shè)計(jì)工作可以按以下五個(gè)步驟進(jìn)行：（1）建立所研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型，可以通過(guò)X射線晶體學(xué)、二維核磁共振等測(cè)定結(jié)構(gòu)，也可以根據(jù)類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)或其他結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法建立起結(jié)構(gòu)模型。（2）找出對(duì)所要求的性質(zhì)有重要影響的位置。同一家族中的蛋白質(zhì)的序列對(duì)比、分析往往是一種有效的途徑。需要認(rèn)真考慮此種性質(zhì)受哪些因素的影響，然后逐一對(duì)各因素進(jìn)行分析，找出重要位點(diǎn)，這是分子設(shè)計(jì)工作的關(guān)鍵。（3）選擇一系列的在（2）中所選出位點(diǎn)上

4、改變殘基所得到的突變體，一方面使蛋白質(zhì)可能具有所要求的性質(zhì)，另一方面又盡量維持原有結(jié)構(gòu)，使其不做大的變動(dòng)。盡量在同源結(jié)構(gòu)中此位點(diǎn)已有的氨基酸殘基序列中進(jìn)行選擇，同時(shí)考慮殘基的體積、疏水性等性質(zhì)的變化所帶來(lái)的影響。（4）預(yù)測(cè)突變體的結(jié)構(gòu)。（5）定性或定量計(jì)算優(yōu)化所得到的突變體結(jié)構(gòu)是否具有所要求的性質(zhì)。能否成功地進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，除了要求有好的計(jì)算機(jī)軟件和高質(zhì)量的力場(chǎng)以外，還要求工作者有一個(gè)堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)化學(xué)和物理化學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)所研究的問(wèn)題有一個(gè)深入細(xì)致的了解。要 蛋白質(zhì)工程是生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)的一門(mén)專(zhuān)業(yè)課，是四大生物工程之一。蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)貫穿于蛋白質(zhì)工程的整個(gè)過(guò)程，是蛋白質(zhì)工程的重要組成部分和中心環(huán)節(jié)。蛋

5、白質(zhì)分子設(shè)計(jì)是理論和實(shí)驗(yàn)并重并交叉進(jìn)行的循環(huán)。本文在簡(jiǎn)要介紹蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)理念和分類(lèi)的基礎(chǔ)上，以Paracelsus挑戰(zhàn)為范例，對(duì)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)原則、方法和過(guò)程進(jìn)行了初步的論述。關(guān)鍵詞 蛋白質(zhì)工程 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì) Paracelsus挑戰(zhàn)中圖分類(lèi)號(hào)：G642.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1818-6539（2009）07-（0050）-（03） 蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是機(jī)體細(xì)胞的重要組成部分。經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)歲月的進(jìn)化，自然界已經(jīng)篩選出了數(shù)量眾多、種類(lèi)各異的蛋白質(zhì)，但天然蛋白質(zhì)只是在適宜的生理?xiàng)l件下才能很好的發(fā)揮功能，在其他條件下，例如工業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的高溫高壓條件，往往不能正常發(fā)揮功能。因而需要

6、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，使其能夠在特定條件下發(fā)揮功能。定點(diǎn)突變和PCR技術(shù)的發(fā)展使這種改造成為可能。20世紀(jì)80年代初，蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)工程是以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以基因重組技術(shù)為主要手段，對(duì)天然蛋白質(zhì)分子進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造1。蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)則是指從頭設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)分子或者在蛋白質(zhì)已知結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過(guò)適宜的改變來(lái)制備新的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)可分為兩個(gè)層次：一種是在已知立體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上所進(jìn)行的直接將立體結(jié)構(gòu)信息與蛋白質(zhì)的功能相關(guān)聯(lián)的高層次的設(shè)計(jì)工作；另一種是在未知立體結(jié)構(gòu)的情形下借助于一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)所進(jìn)行的分子

7、設(shè)計(jì)工作。蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)又可按照改造部位的多寡分為三類(lèi)：第一類(lèi)為“小改”，即對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個(gè)殘基的修飾、替換或刪除等，可通過(guò)定位突變或化學(xué)修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)；第二類(lèi)為“中改”，對(duì)來(lái)源于不同蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行裁剪拼接組裝；第三類(lèi)為“大改”，即完全從頭設(shè)計(jì)全新的蛋白質(zhì)（de novo design）2。蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的過(guò)程簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)就是首先建立所研究對(duì)象的結(jié)構(gòu)模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究，然后提出設(shè)計(jì)方案，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后進(jìn)一步修正設(shè)計(jì)，往往需要幾次循環(huán)才能達(dá)到目的。所以蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)是在計(jì)算機(jī)模擬的基礎(chǔ)上構(gòu)建突變基因，進(jìn)而獲得突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品，然后進(jìn)行功能驗(yàn)證。沒(méi)有達(dá)到目標(biāo)就再次循環(huán)。

8、因此蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)是理論和實(shí)驗(yàn)并重并交叉進(jìn)行的循環(huán)。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)工程改造包括提高蛋白的熱、酸穩(wěn)定性，增加活性，降低副作用，提高專(zhuān)一性以及通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究等。由于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的了解不夠深入，成功的實(shí)例還不是很多，因此更需要在蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的方法學(xué)上開(kāi)展深入研究。1994年，Rose在protein folding: predicting predicting這一篇展望中預(yù)測(cè)在下一個(gè)10年內(nèi)可以解決通過(guò)蛋白質(zhì)一級(jí)序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的結(jié)論3。雖然這個(gè)結(jié)論并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)，可是他在這篇展望中提出的一個(gè)挑戰(zhàn)卻引起了關(guān)注并很快被完成4。這就是以16世紀(jì)瑞士名醫(yī)Paracel

9、sus（帕拉切爾蘇斯）命名的Paracelsus挑戰(zhàn)。帕拉切爾蘇斯（14931541），原名菲利普斯奧雷奧盧斯特奧夫拉斯圖斯邦巴斯特馮霍恩海姆（Philippus Aureolus Bombastus von Hohenheim），16世紀(jì)瑞士有名的醫(yī)學(xué)家，他自己取名帕拉切爾蘇斯（意為賽過(guò)1世紀(jì)羅馬名醫(yī)切爾蘇斯）。發(fā)現(xiàn)并使用多種新藥，促進(jìn)了藥物化學(xué)的發(fā)展。他對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，尤其是精神病治療的興起都做出了貢獻(xiàn)，提出了劑量決定是否為毒藥的著名理論。同源蛋白質(zhì)或者具有相似氨基酸組成和序列長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)一般具有相似的空間結(jié)構(gòu)。但是卻有一些具有相似氨基酸組成和序列長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)具有不同的折疊結(jié)構(gòu)如核酸酶和溶菌酶

10、。所以通過(guò)選擇改變少部分適宜殘基的途徑改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。Paracelsus挑戰(zhàn)的內(nèi)容就是要求在不改變一個(gè)球蛋白50%序列的前提下把其從一種構(gòu)象轉(zhuǎn)換為另一種構(gòu)象3。因帕拉塞爾蘇斯曾經(jīng)說(shuō)過(guò)：所有的物質(zhì)都是毒藥，所有的物質(zhì)都不是毒藥，唯一的區(qū)別是它們的劑量（All substances are poisons:there is none which is not a poison. The right dose differentiates a poison and a remedy）。所以這個(gè)挑戰(zhàn)命名為Paracelsus挑戰(zhàn)。Paracelsus挑戰(zhàn)提出以后，有三個(gè)實(shí)驗(yàn)小組應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)分別設(shè)計(jì)

11、了三個(gè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的實(shí)驗(yàn)，這三個(gè)蛋白分別命名為Paracelsin-43、Crotein-G、Janus5,6,7,8。這三個(gè)蛋白的命名都很有意思，而且它們的設(shè)計(jì)都涉及到兩種蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)-helices和-sheets的相互轉(zhuǎn)換。1996年，Jones報(bào)道了第一個(gè)應(yīng)對(duì)Paracelsus挑戰(zhàn)的蛋白-Paracelsin-43,這個(gè)名字很簡(jiǎn)單，顧名思義，就是奔著Paracelsus挑戰(zhàn)來(lái)的。因?yàn)檫@個(gè)蛋白由43AA組成，所以命名為Paracelsin-43。Paracelsin-43是利用蛋白質(zhì)反向折疊的方法通過(guò)從頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)獲得的。進(jìn)行這個(gè)從頭設(shè)計(jì)的時(shí)候考慮了兩個(gè)方面，一個(gè)是采用短片段，這是當(dāng)時(shí)固相

12、合成多肽技術(shù)水平的限制所決定；另一個(gè)是采用兩個(gè)易于區(qū)別的二級(jí)結(jié)構(gòu)全helix和全-sheet結(jié)構(gòu)，這樣利于隨后的檢測(cè)。首先從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank, PDB）中選擇合適的蛋白要求是長(zhǎng)度45AA，只有全和全結(jié)構(gòu)，這個(gè)條件是非常嚴(yán)格的，當(dāng)時(shí)它們就只找到了一對(duì)蛋白。第一個(gè)蛋白是BDS-1，它是一種抗高血壓和抗病毒的蛋白，43AA，全sheet結(jié)構(gòu)，是一個(gè)小的含有3個(gè)二硫鍵的反向平行sheet的結(jié)構(gòu)；第二個(gè)蛋白質(zhì)是與葡萄球菌免疫蛋白結(jié)合的蛋白A的B結(jié)構(gòu)域。蛋白A的B結(jié)構(gòu)域共有58AA，是一個(gè)4螺旋捆，但是當(dāng)只有前43個(gè)氨基酸時(shí)，X-射線晶體衍射表明最后一個(gè)螺旋被刪除，而第三個(gè)

13、螺旋也不會(huì)形成，所以形成了只有兩個(gè)螺旋的結(jié)構(gòu)。然后以BDS-1為模板，以蛋白A的43AA片段的結(jié)構(gòu)為目標(biāo)。僅通過(guò)算法設(shè)計(jì)了一段具有43個(gè)氨基酸殘基的序列，這段序列與BDS-1有53.5的相同，與目標(biāo)蛋白質(zhì)有16.3的相同。算法表明原蛋白有26sheet,沒(méi)有-helix；而設(shè)計(jì)蛋白中58-helix，沒(méi)有sheet。序列設(shè)計(jì)后通過(guò)固相合成，HPLC純化，質(zhì)譜檢測(cè)。pH6.5時(shí)，Paracelsin-43沒(méi)有完全的二級(jí)結(jié)構(gòu)，只有2的-helix，pH4.5時(shí)有11的-helix。加乙二醇，降溫，從50至70，-helix從2升到15；用水/甲醇作溶劑更好，-helix 50有32，42有54，但

14、都有35sheet結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)檢測(cè)表明Paracelsin-43并沒(méi)有完成Paracelsus挑戰(zhàn)的設(shè)計(jì)目標(biāo)。本設(shè)計(jì)失敗的主要原因是第二遺傳密碼的簡(jiǎn)并性造成的-當(dāng)兩個(gè)蛋白氨基酸序列具有超過(guò)30同源性的時(shí)候，一般就會(huì)具有相似的三維結(jié)構(gòu)。而具有相似三維結(jié)構(gòu)的氨基酸序列長(zhǎng)度不同則對(duì)同源性的要求也不同。長(zhǎng)片段對(duì)同源性的要求低，短片段對(duì)同源性的要求高。當(dāng)氨基酸長(zhǎng)度80AA，要求同源性26，而氨基酸長(zhǎng)度是43AA時(shí)，則至少要求具有35的同源性。本設(shè)計(jì)中要求具有53同源性而具有不同的結(jié)構(gòu)在氨基酸長(zhǎng)度較短時(shí)是比較困難的。使用具有更長(zhǎng)氨基酸片段的蛋白成功的可能性更大。長(zhǎng)片段氨基酸就不再適合用固相合成的方法，用分子

15、生物學(xué)的方法更適宜。Crotein-G是Yuan與1998年報(bào)道的針對(duì)Paracelsus挑戰(zhàn)的蛋白質(zhì)。因?yàn)榉謩e直接采用了434Cro蛋白的序列和protein-G的序列，就像一個(gè)二者的雜合體，所以命名為Crotein-G。其中434Cro蛋白原有71AA組成，但只有具有前65AA的多肽的晶體結(jié)構(gòu)被測(cè)定，表現(xiàn)為4個(gè)-helix的結(jié)構(gòu)。而protein-G則含有56AA，表現(xiàn)為通過(guò)一個(gè)-helix連接的兩個(gè)反向平行的sheet。因?yàn)镃rotein-G是以protein-G為目標(biāo)，所以設(shè)計(jì)時(shí)也確定為56AA。設(shè)計(jì)原則是首先選擇所有434Cro蛋白與protein-G具有不間斷的同源性中具有最多AA

16、的比對(duì)，其中二者具有相同氨基酸最多可為7個(gè)。然后這7個(gè)氨基酸作為Crotein-G的首先被確定的殘基。還要在模板-Cro蛋白剩余的49個(gè)殘基中改變28個(gè)。第二類(lèi)Crotein-G的殘基是通過(guò)氨基酸殘基的極性來(lái)確定的，要求殘基的極性與protein-G相同而與434Cro蛋白不同。需要改變的殘基共有11個(gè)，分別是E3Y，K6I，K7L，R9G，K26A，I30F，E34A，K39V，F(xiàn)43W，N52F和D54V。第三類(lèi)殘基要求適應(yīng)protein-G的疏水內(nèi)核，有8個(gè)氨基酸殘基需要改變，分別是M14G，L19E，I33Y，P41G，I47D，A50K，L51T和C53T。現(xiàn)已改變了19（118）個(gè)

17、氨基酸殘基，還需改變9（2819）個(gè)殘基。最后檢查剩余的30（4919）個(gè)殘基對(duì)穩(wěn)定性和折疊的貢獻(xiàn)，重點(diǎn)選取可能對(duì)protein-G和434Cro蛋白穩(wěn)定能量差異最大的位置。通過(guò)考慮主鏈的扭角、側(cè)鏈間的相互作用、側(cè)鏈和主鏈間的相互作用以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性確定了最后的9個(gè)殘基。通過(guò)合成6個(gè)69bp的核苷酸片段，然后通過(guò)激酶激活，退火、連接得到設(shè)計(jì)的207bp的核苷酸序列。進(jìn)而通過(guò)基因克隆、原核表達(dá)、蛋白純化等步驟獲得目的蛋白Crotein-G。在制備Crotein-G的基礎(chǔ)上，他們進(jìn)而合成了ZCrotein-G。ZCrotein-G是通過(guò)定點(diǎn)突變的方法在Crotein-G上引入潛在的金屬結(jié)合位點(diǎn)

18、(H16，H18，H30和C33)。這幾個(gè)位點(diǎn)都與434Cro蛋白不同，所以改變的氨基酸總數(shù)不變，仍然符合Paracelsus挑戰(zhàn)的要求。圓二色光譜檢測(cè)表明，在低濃度（2.6m）并且含有20TFE時(shí)ZCrotein-G的結(jié)構(gòu)與434Cro蛋白不同而與protein-G的突變體Z1相似；但是高濃度下（1040m）或者TFE不存在時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集沉淀而使有序結(jié)構(gòu)減少。蛋白質(zhì)聚集的直接原因是因?yàn)榈鞍讻](méi)有形成一個(gè)很好的內(nèi)核。而內(nèi)核的形成是蛋白質(zhì)正確折疊的關(guān)鍵因素。Crotein-G的設(shè)計(jì)并沒(méi)有采用從頭設(shè)計(jì)的方法，而是在氨基酸極性、疏水內(nèi)核的形成，殘基對(duì)穩(wěn)定性和折疊的貢獻(xiàn)等方面綜合考慮434Cro和p

19、rotein-G的不同，直接采用二者之一的氨基酸序列。通過(guò)分子生物學(xué)的方法，通過(guò)基因克隆、原核表達(dá)、蛋白純化等步驟獲得目的蛋白。設(shè)計(jì)的主要缺陷是只能從二者的氨基酸中選取，造成目標(biāo)蛋白沒(méi)有形成一個(gè)很好的疏水內(nèi)核。綜合來(lái)說(shuō)，Crotein-G并沒(méi)有形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，離Paracelsus挑戰(zhàn)的要求仍然相去甚遠(yuǎn)。真正符合Paracelsus挑戰(zhàn)的是第三個(gè)名為Janus的蛋白的設(shè)計(jì)。Janus（杰納斯）是羅馬神話中的天門(mén)神，早晨打開(kāi)天門(mén)，讓陽(yáng)光普照人間，晚上又把天門(mén)關(guān)上，使黑暗降臨大地。他的頭部前后各有一副面孔，同時(shí)看著兩個(gè)不同方向，一副看著過(guò)去，一副看著未來(lái)，因此也稱兩面神，或被尊稱為時(shí)間之

20、神。而Janus蛋白命名的含義包括兩個(gè)方面，第一個(gè)指它的兩面性，即-helix和sheet兩種不同結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)換；另一個(gè)意思則是打開(kāi)了一扇門(mén)，暗示開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)新的局面。Janus是以protein-G（56AA，表現(xiàn)為通過(guò)一個(gè)-helix連接的兩個(gè)反向平行的sheet）為模板，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)換為4螺旋捆的Rop蛋白。這是因?yàn)樵诋?dāng)時(shí)對(duì)-helix形成機(jī)制的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于對(duì)sheet的形成機(jī)制的研究。Janus設(shè)計(jì)理念是綜合考慮殘基的短程和長(zhǎng)程相互作用，protein-G中傾向于形成-helix的殘基不變而傾向于形成sheet的殘基則替換成傾向于形成-helix的殘基。形成-helix捆的a,d位的殘基設(shè)計(jì)為疏水殘基，而在Rop蛋白中形成鹽橋的Arg16和Asp46也引入到Janus中。為了形成Rop蛋白中相似的電荷分布，在1/1引入中性和正電荷而在2/2引入負(fù)電荷。最后在49位引