酵母菌的培養(yǎng)與分離

1、微生物學(xué)大實驗實驗指導(dǎo)編者： 生物技術(shù)教研室2007.3目錄實驗一 酵母菌的培養(yǎng)與分離2實驗二 酵母菌的鑒定7實驗三 酵母菌耐受能力的測定19實驗四 酵母菌發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化22實驗五 耐高溫酵母菌株的誘變選育24實驗六 釀酒酵母細胞固定化與酒精發(fā)酵 27耐高溫酒精酵母菌的選育及發(fā)酵條件的研究 實驗一 酵母菌的培養(yǎng)與分離一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)培養(yǎng)和分離酵母菌的技術(shù)和方法二、基本原理大多數(shù)酵母菌為腐生，其生活最適pH為4.56，常見于含糖分較高的環(huán)境中，例如果園土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生長迅速，易于分離培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)基中，酵母菌比霉菌生長得快。利用酵母菌喜歡酸性環(huán)境的特點，常用酸性液體培養(yǎng)

2、基獲得酵母菌的培養(yǎng)液（這樣做的好處是酸性培養(yǎng)條件則可抑制細菌的生長），然后在固體培養(yǎng)基上用劃線法分離之。三、實驗主要內(nèi)容和要求（一）本次實驗的方案由同學(xué)們自己制定，實驗包括：1馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基, 乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的配制。2.菌株的篩選,根據(jù)一定的生產(chǎn)目的并從特定的樣品篩選出高產(chǎn)酒精的適宜的酵母菌株。3.酵母菌的分離,要求接種一次, 28-30，培養(yǎng)24小時，轉(zhuǎn)接一次，28-30，培養(yǎng)24小時，并用鏡檢的方法獨立判定所分離菌株是否為酵母菌。4.用劃線分離法對酵母菌進行純化，要求每組挑取單個菌落，連續(xù)劃線分離4代，鏡下為單一純菌株，每組擴繁10支斜面菌種，備用。四、實驗的準(zhǔn)備 1、甘蔗、成

3、熟葡萄或蘋果等果皮、0.1%美藍染液、1ml的無菌吸管、無菌培養(yǎng)皿等。2、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：原料：馬鈴薯（200克）、葡萄糖（20克）、瓊脂（15-20克）、蒸餾水（1000ml）。配制方法：（1）先將馬鈴薯去皮，切片，稱200克并加蒸餾水1000ml，煮沸半小時，用紗布過濾，補足蒸餾水量至1000ml ，制成20%的馬鈴薯汁。（2）在20%的馬鈴薯汁中加入瓊脂，煮沸溶化，補足水分并在115條件下高壓滅菌20分種。（3）加入葡萄糖，制成培養(yǎng)酵母菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。 3、乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液：配方同上，但不加瓊脂而加乳酸，按每1000ml培養(yǎng)液中含5ml乳酸的量加入，并分裝試管。

4、五、實驗設(shè)計l、接種：取一小塊果皮，不需沖洗，直接接入乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液管中，置28-30，培養(yǎng)24小時，可見培養(yǎng)液變混濁。2、培養(yǎng)，用無菌吸管取上述培養(yǎng)后培養(yǎng)液0.lml，注入另一管乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，置28一30再培養(yǎng)24小時或稍長(過長則霉菌長出)。3、觀察：用無菌操作法取少許菌液置于載玻片中央的0.l%美藍染色液中，混勻后加蓋玻片制成水浸片，先用低倍鏡后換高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽生殖情況。活酵母菌可使美藍還原，從而使菌體不著色，用此方法可判斷酵母菌的死活。4、分離：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溶化后制成平板。用劃線法分離酵母菌培養(yǎng)液，從而得到單個菌落。挑取單個菌落反復(fù)再次劃線分

5、離純化，最終可獲得純培養(yǎng)。六、實驗注意事項1.配制培養(yǎng)基時，應(yīng)注意瓊脂的加量，不同規(guī)格及批次的瓊脂的加量應(yīng)由實驗確定，不能照搬書上的加量。2.對培養(yǎng)基加熱時應(yīng)注意瓊脂的糊底與暴沸。3.滅菌鍋操作時，首先應(yīng)注意水一定要加足夠，排氣要徹底，其次滅菌期間不要離開人，滅菌結(jié)束后，關(guān)閉電源，拔掉插頭，最后放氣一定要緩慢，均勻，氣放徹底才能開鍋，取鍋內(nèi)物品，應(yīng)小心，防止?fàn)C傷。4.接種前應(yīng)注意無菌工作臺的消毒與殺菌，接種時應(yīng)注意手與接種工具的消毒。七、實驗結(jié)果的觀察及記錄1.24小時，觀察試管內(nèi)培養(yǎng)液的情況并作記錄，每組轉(zhuǎn)接2支試管。2.48小時，觀察試管內(nèi)培養(yǎng)液的情況，鏡檢培養(yǎng)液內(nèi)菌的數(shù)量，粗略判斷是否為

6、酵母菌并作記錄，每人蘸取培養(yǎng)液進行劃線分離，并作記錄。3.72小時后，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)菌的生長的情況，挑取單個菌落進一步劃線分離，直到為純菌落。4.每組轉(zhuǎn)接10支斜面試管，備用。八、實驗的延伸自然條件下釀造蘋果酒，葡萄酒、獼猴桃酒。七實驗報告要求1.實驗完畢后，每位同學(xué)都應(yīng)獨立作出實驗報告，實驗報告應(yīng)類似于小型論文格式。2.實驗報告內(nèi)容包括：（1）立題意義。（2）實驗設(shè)計。（3）實驗步驟詳細記錄。（4）對實驗結(jié)果的分析討論和總結(jié)。（5）實驗延伸。（6）實驗心得體會。附1：果酒的釀制方法、目的要求 了解果酒釀制原理，學(xué)習(xí)蘋果酒釀制技術(shù)。二、基本原理 果酒是一類營養(yǎng)豐富、含酒精度低的上乘飲料。它是用含

7、一定糖分和水分的果實壓汁，經(jīng)微生物發(fā)酵而成。其生化作用，除酒精發(fā)酵的主產(chǎn)物外，還有甘油、醋酸、琥珀酸、雜醇油等的形成；同時，陳釀期中，各種酸類與醇類的酯化反應(yīng)，賦予果酒特殊的香味；果酒中的單寧、色素、果屑微粒及蛋白質(zhì)（包括酵母尸體）等的氧化和下沉，使酒液澄清、風(fēng)味增濃。 各種果酒以原料而稱名。除堅果外，所有栽培果，野生果均可做釀果酒的原料。本實驗以蘋果酒為例，學(xué)習(xí)其釀制方法。三、實驗材料 1、菌種 在7Be麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上的葡萄酒酵母（s.cerevisae ellipsoieleus）。2、器材 蘋果汁培養(yǎng)基，7Be麥芽汁培養(yǎng)基，10ml管、100ml三角瓶等裝量，白糖，食用酒精，亞硫

8、酸，果膠酶，發(fā)酵缸，破碎機，果汁分離器等。a.蘋果汁培養(yǎng)基粗濾新鮮果汁（蔗糖調(diào)至13Be，酸度0.5%以下）1000mlK2HPO4 0.1g MgSO47H2O 0.1g配好后，加熱煮沸35分鐘，靜置10小時以上，過濾、分裝，0.7Kgcm2滅菌20分鐘。 四、實驗步驟（一）酒母培養(yǎng) 1、菌種活化（一級種） 取裝有10ml蘋果汁或7Be麥芽汁培養(yǎng)基1支，按無菌操作法接種葡萄酒酵母菌一環(huán)，混勻后置2830下培養(yǎng)25天（用蘋果汁活化菌種時需培養(yǎng)5天以上），鏡檢酵母繁殖良好，無雜菌即可。 2、母發(fā)酵劑制備（二級種） 在裝有100ml蘋果汁培養(yǎng)基的三角瓶中，接12ml經(jīng)活化的葡萄酒酵母菌液，于28下

9、培養(yǎng)23天，當(dāng)培養(yǎng)液表面有氣泡產(chǎn)生，嗅之有酒香味、取樣鏡檢無雜菌時使用。3、生產(chǎn)發(fā)酵劑的制備（三級種） 方法與母發(fā)酵劑相同，只是采取更大的容器。一般采用5001000ml的三角瓶或卡氏罐，盛裝占容積1235的果汁培養(yǎng)液，滅菌冷卻后，按10接種量接人母發(fā)酵劑，在2528下培養(yǎng)2448小時，待發(fā)酵正常，鏡檢無雜菌方可使用。4、如果使用活性干酵母，添加量為20g/L發(fā)酵醪，復(fù)水用水量是干酵母重量的510倍。復(fù)水用水的溫度應(yīng)保持在40左右（3843），將酵母靜置510min后攪拌，酵母在水中的時間不能超過30min。然后使酵母溶液緩慢冷卻到與將被接種發(fā)酵醪的溫差小于10，然后直接加入發(fā)酵醪。 （二）果

10、酒生產(chǎn) 工藝流程如下：果膠酶 蘋果分選除雜下清洗破碎壓榨粗果汁果楂、蘋果酸、丹寧 活化酵母母發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵劑 蔗糖發(fā)酵皮渣分離后發(fā)酵原酒 換捅除渣貯存陳釀配制貯存澄清過濾裝瓶巴氏滅菌封口成品。(23次)操作要點：1、分選 取成熟蘋果，除去腐爛、干疤和傷果。2、清洗 清水充分洗滌，除去果皮上的污物、雜質(zhì)及藥劑，以保證原料干凈衛(wèi)生。3、破碎 為易于壓榨，提高出汁率，需進行破碎。用破碎機破碎至果塊粒度05cm3左右，并除去果籽。4、壓榨分離 破碎后立即進行壓榨分離。分離出的果汁中不得夾帶果肉，同時需添加適量蘋果酸調(diào)整含量（要求果汁總酸含量為5gL），并加入0.10.15gL的果膠酶，促進果膠分解，使

11、果汁澄清并提高酒的風(fēng)味。由于蘋果汁易被自身含有的多酚氧化酶氧化，故需加SO2還原劑抑制酶活性，同時SO2也具有殺菌、防腐和澄清果汁作用。SO2來源，除工廠應(yīng)用液態(tài)SO2外，實驗室常加入亞硫酸鈉（Na2SO3）和偏重亞硫酸鉀（K2S2O5），其用量為果汁量的0.02即可。 5、前發(fā)酵 取澄清果汁放入經(jīng)干熱滅菌的發(fā)酵缸中，裝量占缸容積的45，按35的接種量接入酵母生產(chǎn)發(fā)酵劑進行發(fā)酵，保持品溫在1822之間，最高勿超過25，發(fā)酵應(yīng)在712天內(nèi)結(jié)束。一般蘋果汁糖分約為11，經(jīng)發(fā)酵后，酒精含量約達6以上，前發(fā)酵結(jié)束后，原酒酒度應(yīng)大于8（V），殘?zhí)?0gL，總酸（蘋果酸）5gL。 6、后發(fā)酵 前發(fā)酵結(jié)束后

12、，迅速將酒液與皮渣分離，酒汁轉(zhuǎn)入經(jīng)干熱滅菌的發(fā)酵缸中，進行后發(fā)酵，使殘?zhí)抢^續(xù)分解。期間，控制品溫在1822之間，不要超過25，時間1個月，即得原酒。要求殘?zhí)呛啃∮?gL以下，揮發(fā)酸（以醋酸計）小于0.6gL，總酸（以蘋果酸計）大于5gL。 7、換桶除渣 為使已澄清的原酒與其酒腳（沉淀物）及時分離，以免酒腳產(chǎn)生異味而影響酒質(zhì)，故需進行換桶（缸）。換桶次數(shù)新酒每年換三次。 8、貯存陳釀 應(yīng)滿桶貯存。陳釀即酒的老熟，經(jīng)長期密閉貯存，可使酒質(zhì)澄清、風(fēng)味醇厚。貯存室溫816，存期半年以上。 9、配制 原酒貯存半年后可開始配制。配制時，按工藝規(guī)定將不同原酒按一定配比相混，然后添加適量的糖、酒精、繼續(xù)貯存

13、半年以上。 10、澄清過濾 可采用冷凍法使其澄清，即于-4左右存放7天，然后冷過濾。澄清后的酒置-5-7下冷凍3天不發(fā)生混濁沉淀，或暴露空氣中氧化4天不變混濁即為合格。 11、裝瓶滅菌 裝瓶后需進行巴氏滅菌，即在63下處理15分鐘，冷卻后封口保存。 五、實驗報告 1、簡述蘋果酒的釀制法。 2、二氧化硫在果酒釀制中的作用是什么？ 六、思考題 1、酵母菌釀酒的原理是什么？ 2、果酒釀制中為何要加入果膠酶？實驗二 酵母菌的鑒定酒精生產(chǎn)中所用酵母菌在微生物學(xué)中的分類依據(jù)是什么?微生物學(xué)的類別分門、綱、目、科、屬、種，生產(chǎn)酒精用酵母菌屬于微生物中的真菌門、子囊菌綱、原子囊菌亞綱、內(nèi)孢霉目、內(nèi)孢霉科、啤酒

14、酵母屬、卡爾斯伯酵母屬等。酵母菌的分類依據(jù)是根據(jù)它的形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)特征來確定的。在分類前將菌體細胞進行分離純化，得到由單細胞長成的菌落，然后再進行形態(tài)特征和生理生化鑒定。(一)形態(tài)特征的鑒定把酵母菌接種到麥芽汁固體培養(yǎng)基上，讓它長成菌落，觀察其菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地、邊緣、表面等特征。把它再接種到液體麥芽汁培養(yǎng)基中，觀察是否能產(chǎn)生醭、試管或培養(yǎng)儀器表面壁上能否形成菌環(huán)，培養(yǎng)液中是否產(chǎn)生沉淀、混濁程度等。另外，還要取樣在顯微鏡下觀察其單細胞的形態(tài)、大小、能否形成孢子、孢子的大小以及繁殖方式等。(二)生理生化特征的鑒定酵母菌的生理生化特征主要表現(xiàn)為發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等糖類的能力

15、。同時，還需測定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精，利用硝酸鹽還是硫酸鹽，發(fā)酵產(chǎn)酸、產(chǎn)醋、耐溫、耐酸、抗重金屬離子、抗雜菌性等的能力。最后，根據(jù)以上得出的形態(tài)特征和生理生化特征，查閱有關(guān)資料，把具有相同特征的一類酵母菌，就可以歸屬于某一屬。怎樣鑒定酵母菌在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征?將酵母菌種接種于米曲汁或麥芽汁液體培養(yǎng)基中，放于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)以2830保溫培養(yǎng)1824、2448、4872小時，取出觀察各個時期液體培養(yǎng)基表面有無白色浮膜物-醭的存在，各個不同時期培養(yǎng)基中有無沉淀或沉淀的多少、有無混濁和混濁程度、試管或其它培養(yǎng)器壁上有無菌環(huán)形成，最后取出各個不同時期的樣液，注入酵母細胞計數(shù)器-血球計

16、中，放置顯微鏡下觀察單個細胞的形態(tài)變化情況、液泡的大小、細胞數(shù)增加的多少以及培養(yǎng)基中pH值的變化情況等，并測定其酒精和二氧化碳的生產(chǎn)量。然后根據(jù)不同的反應(yīng)情況，作好詳細的原始記錄，便于以后培養(yǎng)菌種時比較和參考。酵母菌生理生化試驗一、酵母菌糖發(fā)酵試驗（一）實驗?zāi)康牧私忤b別酵母菌的實驗方法。（二）實驗原理酵母菌在厭氧條件下能分解糖類，產(chǎn)生各種有機酸、氣體和其它產(chǎn)物。酵母菌種類不同對各種糖類的發(fā)酵能力各異。因此，這是鑒別酵母菌種類的一項重要依據(jù)。酸的產(chǎn)生可根據(jù)培養(yǎng)基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫變黃）或溴麝香草酚藍（pH7.6-6.0由藍變黃）指標(biāo)劑顏色的改變來確定。產(chǎn)氣可由發(fā)酵管氣泡的產(chǎn)生予以

17、證實。（三）材料糖發(fā)酵基礎(chǔ)液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚藍溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖，啤酒酵母斜面菌種。（四）實驗內(nèi)容1、糖發(fā)酵基礎(chǔ)液配制好后，按培養(yǎng)液容量的1%加入糖，分裝于杜氏發(fā)酵管中（培養(yǎng)液的高度約為4-5厘米），再在試管內(nèi)加入倒置的小玻管（約0.42.02.5厘米）一支。每種糖設(shè)三個重復(fù)管，高壓滅菌15分鐘。2、將酵母分別接入上述各發(fā)酵管中，置下培養(yǎng)48-72小時，另以不接種者作對照3、如產(chǎn)酸則培養(yǎng)液pH值下降而變黃色；如產(chǎn)氣，則必先產(chǎn)酸，并在杜氏小管頂端出現(xiàn)氣泡。4、結(jié)果記錄。以“ ”表示產(chǎn)酸，“表示產(chǎn)氣，“”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，“”表示無變化，“堿”表示產(chǎn)堿。二、酵母菌

18、碳源同化試驗（一）實驗?zāi)康牧私饨湍妇鷮Ω鞣N碳源的利用情況。（二）實驗原理碳是酵母菌細胞的重要組成成分，約占酵母菌體重量的50%，為酵母菌生命活動提供所需的能量和組成其結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。酵母菌對各種碳源的利用，因種類不同而異。這是酵母菌分類鑒定的一個重要依據(jù)。（三）材料無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基，啤酒酵母斜面菌種，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖溶液。（四）實驗內(nèi)容1、液體試管法（1）每管加無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基5毫升，加被測試的某種碳源，并以葡萄糖作為對照。（2）接入啤酒酵母，下培養(yǎng)1-2周，觀察結(jié)果。2、生長圖譜法（1）無碳培養(yǎng)基內(nèi)加入2%的水洗瓊脂，融化后冷卻至45，到至平板。（2）接種新鮮培養(yǎng)的啤酒酵

19、母于1毫升無菌生理鹽水內(nèi)，攪勻后倒入上述未凝平板內(nèi)，搖勻待凝。（3）皿底用特種蠟筆寫上被測試各種碳源的標(biāo)記。（4）用不銹鋼匙，按標(biāo)記加入相應(yīng)的米粒大小的碳源，并以葡萄糖作對照。（5）下培養(yǎng)24-48小時后觀察結(jié)果。3、結(jié)果觀察（1）液體試管中是否形成醭，環(huán)島等。（2）生長圖譜中測量菌落大小，說明對碳源的利用情況。三、酵母菌氮源同化試驗（一）實驗?zāi)康牧私饨湍妇鷮Ω鞣N氮源的利用情況。（二）實驗原理酵母菌蛋白酶不分泌于菌體外，故酵母菌對復(fù)雜的蛋白質(zhì)不能利用，酵母菌對一些較簡單的含氮化合物的利用程度也不一致。（三）材料無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，啤酒酵母斜面菌，0.5%的蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨和尿素溶液。（四）實

20、驗內(nèi)容1、液體試管法方法同二，以被測試的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白對照。2、生長圖譜法方法同二，以被測試的氮源代替碳源，不加任何氮化物作空白對照。3、結(jié)果觀察（1）液體試管中溶液pH值的變化。（2）生長圖譜中測量形成菌落的大小，說明對各種氮源的利用情況。四、酵母菌生長曲線的測定試驗（一）實驗?zāi)康恼莆諉渭毎⑸锶后w生長曲線的幾種測定方法。（二）實驗原理酵母菌屬于單細胞真核型微生物，把一定數(shù)量的酵母菌接種于的液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)時，它的生長過程具有一定的規(guī)律性。在其生長過程中，定時取樣測定酵母菌細胞數(shù)量，然后以酵母菌細胞數(shù)的對數(shù)作縱坐標(biāo)，生長時間作橫坐標(biāo)，繪制所得的曲線叫生長曲

21、線。此生長曲線大致可劃分為四個階段：調(diào)整期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰退期。（三）材料酵母菌增殖培養(yǎng)基，蘋果酒酵母斜面菌種。（四）實驗內(nèi)容1、將培養(yǎng)24小時左右的酵母斜面菌種，用無菌水洗下菌苔，以3000轉(zhuǎn)/分的速率離心，得菌體。將酵母菌體沉淀物再用無菌水洗2-3次后，制備酵母菌懸液（細胞數(shù)量約106左右/毫升），測數(shù)備用。2、取上述菌懸液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培養(yǎng)液的試管中，下培養(yǎng)，以此為起始時間，記錄起始溶液的細胞數(shù)。并在培養(yǎng)1，2，4，6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24小時時分別取樣檢測酵母菌細胞數(shù)量。3、酵母菌細胞數(shù)量的檢測方法：活菌計數(shù)法。此法是將以上定時取出

22、的被檢樣品作一系列稀釋后，取一定量體積（在0.1-1毫升之間）的稀釋液涂布于盛有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，在下培養(yǎng)24小時左右，計算培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)就可測出溶液中活菌數(shù)量。方法：血球計數(shù)板計數(shù)法。此法是先將以上定時取出的被檢樣品作一系列稀釋后，使菌落數(shù)約為105-106個/毫升，取一滴稀釋液滴于血球計數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下直接計算細胞總數(shù)。4、繪制生長曲線以酵母菌細胞數(shù)的對數(shù)作為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間作為橫坐標(biāo)，畫出酵母菌的生長曲線。并分析酵母菌群體的生長規(guī)律。五、實驗結(jié)果的觀察及記錄（見表12）六、思考題1. 為什么碘液反映無色糖化即可結(jié)束？2. 煮沸強度對麥芽汁質(zhì)量有什么影響？表1 酵母菌分屬鑒定結(jié)果菌

23、種號形態(tài)特征生理特征群體個體假菌絲子囊孢子葡萄糖發(fā)酵類淀粉化合物的生成硝酸鉀同化肌醇同化其他巨大菌落沉淀瞨環(huán)島細胞形狀大小無性繁殖方式KleynGorodkowa馬鈴薯塊石膏塊表2酵母種的鑒定結(jié)果記錄菌株形態(tài)特征生理特征糖發(fā)酵糖同化菌落瞨膜細胞形態(tài)大小無性繁殖方式假菌絲子囊孢子葡萄糖乳糖半乳糖麥芽糖蜜二糖蔗糖棉子糖葡萄糖乳糖半乳糖麥芽糖蔗糖纖維二糖蜜二糖海藻糖L阿拉伯糖D阿拉伯糖棉子糖D木糖可溶性淀粉山梨糖菌株氮源同化醇類同化在無維生素培養(yǎng)基上生長其他維生素需要硝酸鉀硫酸銨乙醇甘油山梨醇衛(wèi)矛醇赤蘚醇阿東醇肌醇甘露醇牛奶反應(yīng)油脂分解抗放線菌酮產(chǎn)生類淀粉于37生長耐高滲透壓生物素微生素B1微生素B

24、2微生素B6微生素B12葉酸煙酸泛酸鈣對氨基苯甲酸附1麥芽汁培養(yǎng)基的制備：麥芽汁制備俗稱糖化。所謂糖化是指將麥芽和輔料中高分子貯藏物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、淀粉、半纖維素等機器分解中間產(chǎn)物）通過麥芽中各種水解酶類（或外加酶制劑）作用降解為低分子物質(zhì)并溶于水的過程。溶解于水的各種干物質(zhì)稱為浸出物，糖化后未經(jīng)過濾的料液稱為糖化醪，過濾后的清夜稱為麥芽汁，麥芽汁中浸出物含量和原料干物質(zhì)之比（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）稱為無水浸出率。方法一（1）取50g麥芽，在EBC標(biāo)準(zhǔn)磨上粉碎；（2）將已經(jīng)粉碎好的麥芽粉放入已稱重的糖化杯中，加200mL46水，不斷攪拌并在46水浴中保溫30min；（3）使醪液以1/ min速率升溫到70。

25、此時杯內(nèi)加入100mL70水，保持恒溫。（4）5min后用玻璃棒取麥芽汁1滴，置于白滴板上，再加碘液1滴，混合后觀察碘液顏色變化。直到碘液呈純黃色不再變色，停止保溫，糖化結(jié)束。（5）在1015min內(nèi)急劇冷卻到室溫；（6）沖洗攪玻璃棒拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其內(nèi)容物準(zhǔn)確稱量為450g；（7）用玻璃棒攪拌糖化杯，并注于漏斗中進行過濾，即獲得麥芽汁。方法二稱取市售麥芽粉或大麥經(jīng)浸泡、發(fā)芽、干燥、粉碎的麥芽粉，按每Kg麥芽粉加入6065溫?zé)崴?.54kg。于5560保溫糖化3-4小時，用碘液檢查，然后4層紗布過濾，過濾液中加雞蛋白加水20 mL，調(diào)勻之生出豐富的泡沫為止，然后倒在糖化液中攪拌煮沸

26、后用4層紗布過濾，即得到澄清、透明的麥芽汁，滅菌后方可備用。附2 酵母菌鑒定常用培養(yǎng)基1.酵母菌生孢培養(yǎng)基（1）麥?zhǔn)檄傊咸烟?1g KCL 1.8g酵母浸膏 2.5g醋酸鈉 8.2g瓊脂 12g蒸餾水 1000ml115滅菌20min（2）胡蘿卜培養(yǎng)基將葫蘿卜切成的67cm的長條，下后上薄，裝入培養(yǎng)管中，加水1ml，殺菌，即成。（3）Gorodkowa氏培養(yǎng)基消化蛋白 1g葡萄糖 0.1g氯化鈉 0.5g瓊脂 1.2g水 100ml2.12.5豆芽汁培養(yǎng)基黃豆芽125g加1L，煮沸半小時，過濾后補足水至1L。115滅菌30min3.0.6酵母浸汁加60g干酵母粉于1L水中，必要時加入一些蛋清

27、以澄清濾液，121滅菌15min，趁熱用雙層濾紙過濾；115滅菌15min。4.同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(NH4)2SO40.5%,KH2PO40.1，MgSO4-7H2O0.05%,酵母膏0.02，水洗瓊脂2。115滅菌15min同化碳源液體培養(yǎng)基(NH4)2SO40.5%,KH2PO4,MgSO4-7H2O0.05%,CaCl2-2H2O0.01%.NaCl0.01%,酵母膏0.02，糖或其它碳源0.5。用蒸餾水配，培養(yǎng)基過濾后分裝小試管，每管3 ml, 115滅菌20min。5. 同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基葡萄糖2，KH2PO40.1，MgSO4-7H2O0.05%,酵母膏0.02，水洗瓊脂2。用蒸餾

28、水配，培養(yǎng)基過濾后分裝大試管，每管20 ml, 115滅菌15min。附3酵母各屬檢索表(一) 1.生子囊孢子(簡稱孢子)，營養(yǎng)細胞芽殖(二)。 2. 生子囊孢子，營養(yǎng)細胞裂殖或兼有芽殖(三)。3.不生子囊孢子，但生擲孢子營養(yǎng)細胞芽殖(四)4.不生子囊孢子及擲孢子(五)(二) 營養(yǎng)細胞芽殖，生子囊孢子1.除芽生細胞外，有真菌絲（1）擬內(nèi)孢霉屬（Endomycopsis）。2.無真菌絲（1）營養(yǎng)細胞多邊芽殖（A）（2）營養(yǎng)細胞兩極芽殖（B）（A）1.孢子圓卵形，光面，無凸線（） 2. 孢子半圓形，光面，無凸線（） 3. 孢子痣面（） 4. 孢子有凸線（） 5. 孢子長條形（） 6.生袋狀子囊，孢

29、子多到16個，圓形（2）油脂酵母屬（Lipomyces）（）1. 孢子14個，圓，卵形，光面，無凸線；營養(yǎng)細胞多邊芽殖，圓形，卵形，長形。（3）酵母菌屬（Saccharomyces） （a）孢子生成時，子囊有二營養(yǎng)細胞結(jié)合而成。結(jié)合酵母亞屬（Zygosaccharomyces）（b）孢子生成時，子囊生試探接合枝，但無二細胞結(jié)合現(xiàn)象孢子圓酵母亞屬(Torulaspora) （c）孢子生成時，子囊直接有營養(yǎng)細胞變成，無試探枝及結(jié)合現(xiàn)象酵母菌亞屬（Saccharomyces）2.孢子14個，光面，無凸線；圓卵形，但營養(yǎng)細胞兩極芽殖，為檸檬形（4）類酵母屬(Saccharomycodes)（）孢子為半

30、圓形或腎形1. 孢子為半圓形，多角形，或兼有圓形的（5）畢氏酵母屬(Pichia)（a）孢子生成時，子囊有二營養(yǎng)細胞結(jié)合而成。接合畢氏酵母亞屬（Zygopichia） （b）孢子生成時，子囊有營養(yǎng)細胞直接變成畢氏酵母亞屬(Pichia) 2. 孢子為腎形（a）孢子生成時，子囊有二營養(yǎng)細胞結(jié)合而成。接合腎孢酵母亞屬（Zygofabospora） （b）孢子生成時，子囊有營養(yǎng)細胞直接變成腎孢酵母亞屬(Fabospora) （）孢子痣面 1. 孢子痣面，無凸線；營養(yǎng)細胞多邊芽殖（7）德巴利酵母屬(Debaryomyces) 2. 孢子痣面，無凸線，子囊由接合子的芽子而成，營養(yǎng)細胞兩極芽殖（8）納酵母

31、屬(Nadsonia)3.孢子痣面，圓或卵形，中腰有凸線；營養(yǎng)細胞多邊芽殖，（9施氏酵母屬(Schwanniomyces)（）孢子有凸線1. .孢子痣面，圓或卵形，中腰有凸線施氏酵母屬2. .孢子光面，圓或卵形，中腰有凸線，使整個形體如土星狀（10）魏氏酵母屬(Williopsis)（a）孢子生成時，子囊有二營養(yǎng)細胞結(jié)合而成接合魏氏酵母亞屬（Zygowilliopsis） （b）孢子生成時，子囊直接由營養(yǎng)細胞變成魏氏酵母亞屬（Williopsis） 3. 孢子光面，凸線生在一邊，使孢子形如草帽，營養(yǎng)細胞多邊芽殖（11）漢氏酵母屬(Hansenula)（a）孢子生成時，子囊有二營養(yǎng)細胞結(jié)合而成接

32、合漢氏酵母亞屬（Zygohansenula） （b）孢子生成時，子囊直接由營養(yǎng)細胞直接生成漢氏酵母亞屬(Hansenula) 4. 孢子光面，凸線生于一邊，使孢子形如草帽，營養(yǎng)細胞兩極芽殖，（12）孢子檸檬形酵母屬(Hanseniaspora)（）孢子長條，梭形或鞭形。1. 一個子囊中只有一個孢子（13）單孢酵母屬(Monosporellu) 2. 孢子28個，長條帶鞭毛，如鞭子（14）鞭子酵母屬(Nematospora)3.孢子無鞭毛（15）蠅腸酵母屬(Coccidiasous)（B）營養(yǎng)細胞，兩極芽殖，檸檬形。1. 孢子生成時，營養(yǎng)細胞直接變成子囊（4）類酵母屬(Saccharomycod

33、es)2. 孢子上有凸線，使之成草帽形（12）孢子檸檬形酵母屬(Hanseniaspora)3. 孢子痣面，子囊由接合子的芽子而成（8）納酵母屬(Nadsonia)（三）營養(yǎng)細胞裂殖，或兼及芽殖，生子囊孢子。 1.由真菌絲（） 2.假菌絲發(fā)達（）無真菌絲（）（）只有裂生子，無真菌絲。1. 孢子圓形卵形（16）裂殖酵母屬(Schizosaccharamyces) 2. 孢子腎形（17）北港酵母屬（）有真菌絲1. 有真菌絲，只裂殖生裂生子（18）內(nèi)孢霉(endomyces) 2.有真菌絲，芽殖兼及裂殖（1）擬內(nèi)孢霉屬（Endomycopsis）。（四）生擲孢子1. 擲孢子腎形，不對稱，菌落紅色或紅

34、（19）擲孢酵母屬(Sporobolomyces) 2. 擲孢子圓形或卵圓形，菌落無色或淺黃色（20）布爾酵母屬（Bullera）。（五）不生子囊孢子或擲孢子1. 芽殖細胞及假菌絲外生真菌絲且分裂生裂生子（21）芽裂酵母屬(Trichosporon) 2. 芽殖細胞，假菌絲及真菌絲可能有，但無裂生子（）。（）1. 普通假菌絲甚發(fā)達，真菌絲可能有（22）假絲酵母屬(Candida) 2. 無真菌絲，假菌絲原始型或無（）。（）1. 生類胡蘿卜素（23）紅酵母屬(Rhodotorrula) 2. 無類胡蘿卜素（）。（）1. 兩極芽殖，普通細胞常為檸檬形（24）無孢檸檬形酵母屬(Kloeckera)

35、2. 三角芽殖，營養(yǎng)細胞常為三角形（25）三角酵母屬(Trigonopsis) 3.營養(yǎng)細胞瓶形，芽殖，子母細胞基部甚寬，生橫膜（26）瓶形酵母屬(Pityrosporum)4. 營養(yǎng)細胞一端為尖穹窿狀，含糖培養(yǎng)基中生大量的酸（27）瓶形酵母屬(Brettanomyces)5. 營養(yǎng)細胞圓形或卵圓形（）。（）1. 生莢膜及淀粉樣物質(zhì)，不發(fā)酵（28）隱球酵母屬(Cryptococcus)。 2. 無淀粉樣（29）圓酵母屬(Torulopsis)。 酵母菌亞屬各種檢索表（）1. 只發(fā)酵葡萄糖（包括果糖及甘露糖）及半乳糖： （a）細胞圓形，子囊孢子一個，單孢子酵母（S.unisporus）（b）細胞

36、圓形，子囊孢子2或多個大連酵母 (S.dairens) （c）細胞卵形球形酵母（S.globosus）。（）1. 只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖及蔗糖S.ribis 2. 發(fā)酵糖類不同（）。（）1. 只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖及棉子糖： （a）同化麥芽糖水果酵母（S.fructuum）（b）不同化麥芽糖少孢酵母 (S.exiguus) 2. 發(fā)酵糖類不同（）（）1. 只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖及麥芽糖意大利酵母(S. italicus) 2. 發(fā)酵糖類不同（）。（）1. 只發(fā)酵葡萄糖、蔗糖及麥芽糖異質(zhì)酵母(S. heterogenicus) 2. 發(fā)酵糖類不同（）。（）1. 只發(fā)酵葡萄糖、蔗糖及棉子糖舍氏酵母

37、(S. chevalieri) 2. 發(fā)酵糖類不同（）。（）1. 只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖及麥芽糖士泰因酵母(S. Steineri) 2. 發(fā)酵糖類不同（）。（）1. 只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖及蜜二糖微球酵母(S. microellipsodes) 2. 發(fā)酵糖類不同（）。（）1. 只發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及棉子糖：（a）細胞圓形卵形酵母（S.oviformis）（b）細胞卵到長形白氏酵母 (S.bayanus) 。2. 發(fā)酵糖類不同（）。() 1. 只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖及棉子糖：（a）細胞圓形及卵形釀酒酵母（S.cervisiae）（b）細胞長卵及長形韋爾酵母

38、(S.willianus) 。2. 發(fā)酵糖類不同（）。() 1. 只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖及蜜二糖：（a）細胞圓及卵形卡爾斯伯酵母（S.carlsbergensis）（b）細胞長卵形婁哥酵母 (S.logos) 。（c）細胞長卵形及發(fā)達的假菌絲果汁酵母 (S.uvarum) 。2. 發(fā)酵糖類不同（）。()1. 只發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖及蜜二糖巴氏酵母 (S.pastorianus)2. 只發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖及棉子糖乳糖酵母 (S.lactis) 。實驗三 酵母菌耐受能力的測定一、酵母菌耐高溫能力的測定（一）實驗?zāi)康牧私饨湍改透邷卦囼灥脑砑皯?yīng)用。學(xué)習(xí)酵母

39、菌耐高溫試驗的操作技術(shù)。（二）實驗原理酵母生殖，需要一定的溫度，溫度過低或過高，均不生長，生殖率最大的溫度，稱為最適溫度；一般的酵母，在35以上，生殖困難，發(fā)酵力弱。（三）實驗材料（1）菌種 釀酒酵母（2）培養(yǎng)基 10Bx麥芽汁（3）其它 發(fā)酵瓶，吸管，接種針，培養(yǎng)箱等。（四）方法與步驟配制酵母培養(yǎng)液15瓶，10的接種量接入酵母菌，加拴，抹干，稱量。按標(biāo)簽各置32，35，38，40，42保溫箱中。每個處理3瓶。每天稱量一次，并觀察發(fā)酵情況，5天為止。計算總減輕量，以定溫度過高之害及最高發(fā)酵溫度。（五）實驗結(jié)果見表3 表3酵母耐高溫測定結(jié)果溫度瓶原重第1天第2天第3天第4天第4天總減輕量最高發(fā)酵

40、溫度酵母3235384042二、酵母菌耐酒精能力的測定（一）實驗?zāi)康牧私饨湍改途凭囼灥脑砑皯?yīng)用。學(xué)習(xí)酵母菌耐酒精試驗的操作技術(shù)。（二）實驗原理酵母在糖液中發(fā)酵，到某一時刻即行停止，其最大原因之一是由于酒精濃度增高所致。每一種酵母都有其忍耐的最高酒精濃度，酵母的這個特性在應(yīng)用上很重要。（三）實驗材料（1）菌種 釀酒酵母（2）培養(yǎng)基 10Bx麥芽汁（3）藥品 95乙醇，（4）器材 無菌試管，吸管，接種針，培養(yǎng)箱等。（四）方法與步驟 表4乙醇配制濃度項目12345678910111213添加95乙醇量ml10Bx麥芽汁量ml培養(yǎng)基中酒精含量0.849.1680.959.0591.058.7510

41、1.168.84111.268.74121.378.63131.478.53141.588.42151.689.32161.798.21171.898.17182.008.00192.117.8920（五）實驗結(jié)果若氣泡產(chǎn)生時間越早，產(chǎn)氣量越大，說明酵母的耐酒精能力越強。三、酵母菌耐酸能力的測定（一）實驗?zāi)康牧私饨湍改退嵩囼灥脑砑皯?yīng)用。學(xué)習(xí)酵母菌耐酸試驗的操作技術(shù)。（二）實驗原理酸對于微生物，除其氫離子的作用外，未解離的酸及酸根，都會發(fā)生影響，所以pH值相同的各種酸，與微生物有不同的作用，且酵母菌是一種生酸菌，培養(yǎng)酵母時不斷的增加堿量，酵母也可漸漸生酸，可是于不加堿的培養(yǎng)液中，酵母生酸，達其

42、最高度后，即不再增加，此最高度，因菌而異。（三）實驗材料（1）菌種 釀酒酵母（2）培養(yǎng)基 10Bx麥芽汁或曲汁（3）藥品 冰醋酸，75的乳酸，0.1NNaOH，酚酞（4）器材 大試管，吸管，接種環(huán)，培養(yǎng)箱等。（四）方法與步驟（1）貼標(biāo)簽于6瓶上，分別醋0.2，醋0.4，醋0.6，乳1，乳2，乳3號。用1ml無菌吸管，移冰醋酸0.2ml于醋0.2號瓶，0.4ml于醋0.4號瓶及0.6ml于醋0.4號瓶，移75乳酸1.25ml于乳1號瓶，2.5ml于乳2號瓶，3.75ml于乳3號瓶中，混勻。（2）各瓶口殺菌，待冷。12支無菌大試管分6組，各組標(biāo)簽記醋0.2號，醋0.4號，醋0.6號，乳1號，乳2號

43、，乳3號。將各瓶培養(yǎng)液傾注于同號的兩管。（3）接種，25保溫箱中培養(yǎng)。（4）用滴管及0.1NNaOH液，分別滴定各瓶中所剩培養(yǎng)液的酸度，每次取10ml滴定，反復(fù)2次或3次，求其所用NaOH液用的平均毫升數(shù)。以代之。以下式求培養(yǎng)液中含酸量：醋酸：100.160.051001000培養(yǎng)液百毫升含醋酸克數(shù)。乳酸：100.190.081001000培養(yǎng)液百毫升含乳酸克數(shù)。各瓶所含酸量，算出計入附表。（5）3天與1周后觀察各管，看酵母是否增殖（沉渣增多）及發(fā)酵（有其生出），計入附表。 表5酵母忍耐醋酸、乳酸濃度表試管分組醋0.2醋0. 4醋0.6乳1乳2乳3培養(yǎng)液內(nèi)酸類醋酸乳酸培養(yǎng)液內(nèi)酸量（g/ml）兩

44、管重復(fù)甲乙甲乙甲乙甲乙甲乙甲乙增殖與發(fā)酵3天7天實驗四 酵母菌發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化一實驗?zāi)康恼莆瘴⑸镄泵媾囵B(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基確定方法，學(xué)會對已確定菌種確定實驗室發(fā)酵工藝。二實驗原理 培養(yǎng)的目的有二：一是尋求發(fā)酵培養(yǎng)基的合適配方，二是尋找最佳發(fā)酵條件。微生物發(fā)酵法是一個受多種因素影響的工藝過程，應(yīng)用一般的簡單比較法很難得到滿意的結(jié)果，實驗室中往往采用正交設(shè)計方法，對所研究的菌種進行試驗。正交試驗法是一種安排和分析試驗的方法，這種方法可以通過較少的試驗次數(shù)和比較簡便的分析方法，獲得較好的結(jié)果，它的特點是挑選一部分有代表性的試驗項目，利用正交表來進行整體設(shè)計?？梢酝瑫r做一批試驗，減少試驗次

45、數(shù)，縮短試驗周期。通過分析，它能告訴我們，哪些因素是顯著因素，哪些是非顯著因素，以及哪些因素同有交互作用和交互作用的大小，還能分析出試驗誤差的大小。正交試驗包括兩部分內(nèi)容，設(shè)計試驗方案和分析試驗結(jié)果。三.實驗菌種與材料：1.菌種：酵母菌2.發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖、蔗糖、麥芽粉3.材料：按正交表配制培養(yǎng)基，確定發(fā)酵條件。四實驗設(shè)計：（1）發(fā)酵液的配制(見表6,7) 表6 正交表試驗設(shè)計 因素水平 糖含量（）接種量(ml)溫度()1 103 162 15722 3 201028表7 正交表實驗方案 編號糖含量(A) 接種量(B) 溫度(C) 糖耗 感官評價1 (1) (1) (1) 2 (1) (2)

46、 (2) 3 (1) (3) (3) 4 (2) (1) (2) 5 (2) (2) (3) 6 (2) (3) (1) 7 (3) (1) (3) 8 (3) (2) (1) 9 (3) (3) (2) 1明確試驗?zāi)康模_定試驗因素，影響發(fā)酵的因素很多，考慮到實驗室條件及人力和時間，我們不能在一次試驗中包括所有因素，本實驗主要從葡萄糖、接種量、溫度三個因素，每因素選擇三個水平，采用正交表9（34）。2列出水平表，根據(jù)生產(chǎn)上發(fā)酵的現(xiàn)有了解，把葡萄糖、接種量、溫度三個因素各分成三個水平。3.根據(jù)因素水平表（表頭設(shè)計），把正交表的數(shù)字代號依次換成該因素和水平的實際數(shù)字。五、實驗結(jié)果的觀察與記錄試驗

47、結(jié)果分析1.從正交試驗結(jié)果中，我們可以得到本次實驗的直觀最佳條件，但這不一定是最佳理論值。我們可以根據(jù)實驗的最佳條件和理論最佳條件進行比較，在下一步試驗中可以在這些水平范圍內(nèi)，進行改變和加密水平以求得更佳條件。表中R為極差，極差大小反應(yīng)了因素變化時試驗指標(biāo)變化的幅度，因素的極差越大，該因素對指標(biāo)的影響也會越大，也就越重要，就更需要控制在最佳水平上。六、實驗延伸1.要求每位同學(xué)設(shè)計四因素三水平的正交試驗2.驗證正交試驗結(jié)果。生物量的測定方法有比濁法和直接稱重法等。由于酵母在液體深層通氣發(fā)酵過程中是以均一混濁液的狀態(tài)存在的，所以可以采用直接比色法進行測定。測0D值：將菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測定0D值。比色測定時，用以未接種的培養(yǎng)基作空白對照，并將0D值填入表中，最終確定最佳培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵時間。七思考題 (1)比濁計數(shù)在生產(chǎn)實踐中有何應(yīng)用價值? (2)本實驗為什么采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密度？如果你在實驗中需要測定(3)設(shè)計正交試驗的科學(xué)依據(jù)？實驗五 耐高溫酵母