鐵皮石斛的組織培養(yǎng)

1、.由于石斛自然繁殖力極弱，生長(zhǎng)緩慢，加之人們掠奪性采挖，資源已嚴(yán)重枯竭。而石斛栽培一直未解決其存活率低、進(jìn)入盛產(chǎn)期年限長(zhǎng)等問題，故石斛藥源一直處于緊張狀態(tài)。因此，組織培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化、菌根技術(shù)、懸浮培養(yǎng)等生物技術(shù)在石斛的應(yīng)用意義重大，甚為迫切。石斛的組織培養(yǎng)，可用種子、根、莖尖、莖節(jié)及葉等為外植體，但以種子進(jìn)行組培快繁的為多。原球莖的增殖分化是石斛試管苗繁殖的關(guān)鍵，因此，研究原球莖增殖分化的適宜培養(yǎng)條件非常重要。特別是應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)快速大量繁殖石斛試管苗，是解決其種苗與發(fā)展生產(chǎn)的有效途徑。鐵皮石斛的組織培養(yǎng)鐵皮石斛，又名鐵皮蘭、節(jié)草、耳環(huán)石斛等。野生鐵皮石斛為國家珍稀瀕危保護(hù)植物（三級(jí)）。由于

2、其生長(zhǎng)環(huán)境要求特殊，野生資源已瀕臨滅絕?，F(xiàn)云南晨安生物科技開發(fā)有限公司對(duì)鐵皮石斛的組培快繁已獲成功，月出苗量50萬瓶以上，為鐵皮石斛工廠化育苗和大面積栽培闖出了一條新路。1 胚培養(yǎng)（種子培養(yǎng)）：取人工授粉的鐵皮石斛果實(shí)，用75的乙醇表面消毒，30s后再用0.1升汞溶液消毒8min，無菌水沖洗45次。在無菌操作下，把果實(shí)切成0.1mm見方的小塊，接種到培養(yǎng)基上，每瓶35塊。研究結(jié)果表明，N6培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)和生長(zhǎng)最好，蔗糖濃度2最佳，NAA濃度0.20.5mg/L最適合胚的萌發(fā)和生長(zhǎng)；種子培養(yǎng)中加入椰乳對(duì)胚萌發(fā)和萌發(fā)后的初期生長(zhǎng)起促進(jìn)作用；而香蕉汁對(duì)繼代培養(yǎng)中石斛的生根和壯苗起促進(jìn)作用，生根和壯

3、苗培養(yǎng)中不加入NAA，只用N6+10香蕉汁，苗長(zhǎng)得更粗壯。培養(yǎng)溫度2528，光照強(qiáng)度16002000lx，每日1012h。種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)管34次，當(dāng)幼苗長(zhǎng)出45片真葉并具有34條12cm長(zhǎng)的根時(shí)，可將試管苗進(jìn)行煉苗后移栽。在實(shí)驗(yàn)中尚發(fā)現(xiàn)，石斛原球莖的增殖與胚齡相關(guān)，不同胚齡培養(yǎng)，其萌發(fā)率不同：胚齡45天以下，萌發(fā)率極低，萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)；60天胚齡的胚具34個(gè)細(xì)胞，萌發(fā)率為6；90天胚齡的胚細(xì)胞為74個(gè)，萌發(fā)率為87；120天胚齡的細(xì)胞數(shù)為90個(gè)，萌發(fā)率95以上。實(shí)驗(yàn)表明，組織培養(yǎng)的最適胚齡以種子成熟時(shí)較好，隨著胚齡增長(zhǎng)，其胚細(xì)胞愈多，萌發(fā)率越高。原球莖增殖分化的最適培養(yǎng)基為改良N6+NAA0.2m

4、g/L+2蔗糖。種子萌發(fā)成苗后需及時(shí)將小苗轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根、壯苗培養(yǎng)。有報(bào)道，鐵皮石斛試管茁壯苗階段的適宜培養(yǎng)基為B6（或1/2MS）+10香蕉水提物+NAA2.0mg/L+2蔗糖。生根壯苗培養(yǎng)基為改良N6+10香蕉+2蔗糖，苗長(zhǎng)得更粗壯。將萌芽石斛繼代培養(yǎng)于N6+10香蕉汁生根壯苗培養(yǎng)基中，苗長(zhǎng)得更粗壯。2 莖尖培養(yǎng)：取鐵皮石斛當(dāng)年萌發(fā)的嫩莖尖，用10次氯酸鈉消毒10min，無菌水沖洗45次后接種到培養(yǎng)基上。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度為2528，光照度16002000lx，每日光照1012h。在MS+NAA0.2mg/L+6-BA0.5mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天左右，外植體則可誘導(dǎo)出

5、大小不一的白色顆粒狀愈傷組織，再過20天形成不定芽。將愈傷組織和不定芽切割開，再接種到MS+NAA0.2mgL+6-BA0.5mg/L中，愈傷組織會(huì)增殖并產(chǎn)生不定芽，再將不定芽移到N6+10香蕉汁中培養(yǎng)30天左右，則會(huì)生根長(zhǎng)成植株。3 幼嫩莖段培養(yǎng)：剪取鐵皮石斛幼嫩莖段，按常規(guī)表面滅菌，切成2.0cm左右的切段，每一切段應(yīng)至少保留1個(gè)節(jié)，將其接入芽增殖培養(yǎng)基MS+NAA0.10.5mg/L+6-BA0.52.0mg/L。（蔗糖濃度3.0，PH5.45.8，下各培養(yǎng)基均同）中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度（252），連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1500lx。培養(yǎng)3050天后，可在節(jié)間處長(zhǎng)出12個(gè)新芽。將新芽

6、切下，再接入芽增殖培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，經(jīng)過30天培養(yǎng)，在切口處長(zhǎng)出46個(gè)芽，形成叢生芽簇。將叢生芽切割后，在芽增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖培養(yǎng)，則可獲得大量叢生芽。將上述叢生芽切割成單苗，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基MS（無激素）中培養(yǎng)，40天后，芽可發(fā)育成高3.0cm以上并具23片葉的健壯無根苗。再將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的無根苗，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.1mg/L中培養(yǎng)4060天，在苗基部便可長(zhǎng)出多條肉質(zhì)、綠色氣生根，形成完整植株。尚有報(bào)道，取鐵皮石斛莖，去葉、洗凈、表面滅菌后，在無菌條件下切成約5mm長(zhǎng)的小段，每段必具一個(gè)莖節(jié)，接種于1/2MS或努森培養(yǎng)基內(nèi)，置（261）光照條件下培養(yǎng)，約2周，腋芽長(zhǎng)出，約1個(gè)月則可形成完整植株。4 煉苗與移栽：當(dāng)試管苗有45片葉展開，并具有34條12cm長(zhǎng)的根時(shí)，即可揭開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗1周后，將再生植株移植于細(xì)土與牛糞（1：2）的栽培基質(zhì)中，蓋上薄膜，保持濕度90以上，基質(zhì)以濕潤(rùn)、不積水為宜，置通風(fēng)陰涼處，成活率可達(dá)60。或以碎磚4份，碎木炭1份，珍珠巖和蕨根適量組合為移栽基質(zhì)，其既能透氣，又能排水保水