發(fā)酵染菌與防治案例

1、第七章,發(fā)酵染菌及防治,防止發(fā)酵生產(chǎn)中雜菌污染有著重要的意義：1、保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量、收率的溫度2、保持發(fā)酵生產(chǎn)正常有序的進(jìn)行3、有利于節(jié)約型社會的建立,一、發(fā)酵異?，F(xiàn)象及染菌分析 （一）種子培養(yǎng)基和發(fā)酵的異?，F(xiàn)象 1、種子培養(yǎng)基異常 出現(xiàn)菌體生長緩慢的原因是：1、種子自身的原因，菌種使用時(shí)間過 長，傳代頻繁、菌體老化及接種量少2、培養(yǎng)基的原因：批次間原料成分波動大。種子培養(yǎng)基營養(yǎng)缺乏3、操作過程中的原因，培養(yǎng)基滅菌不徹底、供氧不足等原因 出現(xiàn)菌絲結(jié)團(tuán)的原因是：通氣不足、溶氧條件差、攪拌的剪切力力過大、培養(yǎng)基質(zhì)量下降等原因 出現(xiàn)代謝不正常的原因是：培養(yǎng)環(huán)境差、接種量少、雜菌污染等原因 2、發(fā)酵

2、異常 1、菌體生長差2、PH異常3、溶解氧水平異常4、泡沫過多5、菌體濃度過高或過低,二）染菌隱患檢查 發(fā)酵過程是否染菌應(yīng)以無菌試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù)。無菌試驗(yàn)方法主要有：顯微鏡檢查法、肉湯培養(yǎng)法、平板培養(yǎng)法、發(fā)酵過程中的異常觀察法,三）發(fā)酵染菌原因 總結(jié)為發(fā)酵工藝流程中的各環(huán)節(jié)漏洞和發(fā)酵過程中管理不善兩方面。 各環(huán)節(jié)漏洞包括：1、培養(yǎng)基滅菌不徹底2、無菌空氣帶菌3、種子帶菌4、消泡劑帶菌5、工藝用水帶菌6、管道及附屬設(shè)備或罐體出現(xiàn)滲漏或死角7、泡沫逃溢8、批次發(fā)酵后清洗不徹底等 發(fā)酵過程中管理不善：1、工人的培訓(xùn)不到位導(dǎo)致操作上的認(rèn)識2、發(fā)酵車間衛(wèi)生環(huán)境差3、設(shè)備未定期檢修4、管理制度不完善,四）

3、染菌原因分析 1、染菌雜菌分析表7-5 2、發(fā)酵染菌的規(guī)模分析 大批量發(fā)酵罐染菌,個(gè)別發(fā)酵染菌：大都是由于設(shè)備滲漏造成，應(yīng)仔細(xì)檢查閥門、罐體、管路是否清潔。 3、不同污染階段分析：1、染菌發(fā)生在種子培養(yǎng)階段，或稱種子培養(yǎng)期染菌2、在發(fā)酵過程中的初始階段發(fā)生染菌，或稱發(fā)酵前期染菌3、發(fā)酵后期染菌大部分由空氣過濾不徹底，中間補(bǔ)料染菌，設(shè)備滲漏、泡沫頂蓋以及操作問題引起,五）染菌隱患處理 在正式發(fā)酵之前必須做到以下幾點(diǎn)：1、嚴(yán)格按照生產(chǎn)工藝要求的各項(xiàng)指標(biāo)、參數(shù)、條件進(jìn)行操作2、投產(chǎn)前進(jìn)行整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的無菌測試3、嚴(yán)格工人的管理，實(shí)行操作記錄制度4、加強(qiáng)在線加測的技術(shù)手段，各種生物傳感器、探頭要定期校

4、正5、定期對設(shè)備進(jìn)行檢修,二、染菌對發(fā)酵的影響 （一）染菌對不同發(fā)酵過程的影響 （二）雜菌的種類和性質(zhì)對發(fā)酵過程的影響 （三）染菌發(fā)生的時(shí)間不同對發(fā)酵的影響：1、種子培養(yǎng)期染菌2、發(fā)酵前期染菌3、發(fā)酵中期染菌4、發(fā)酵后期染菌 （四）染菌程度對發(fā)酵的影響：染菌程度越大，發(fā)酵罐內(nèi)的雜菌量越多，對發(fā)酵的危害也就越大，如果染菌嚴(yán)重尤其是發(fā)酵的前期、中期，對發(fā)酵的影響是非常嚴(yán)重的,三、染菌污染后的挽救和處理 （一）種子培養(yǎng)期染菌的處理：若發(fā)現(xiàn)種子罐被雜菌污染，應(yīng)立即停止向發(fā)酵罐內(nèi)在輸送種子，進(jìn)行滅菌后排放，然后對種子罐連接的物料管道、供氣管道進(jìn)行徹底的滅菌，與此同時(shí)，采用未受污染的正常種子接入發(fā)酵罐中，

5、以保證生產(chǎn)的連續(xù)性，如無備用的種子，則可以選擇一個(gè)適當(dāng)菌領(lǐng)的發(fā)酵罐中的發(fā)酵液作為種子，接入新鮮的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，從而保證生產(chǎn)的正常進(jìn)行,二）發(fā)酵前期染菌處理：1、發(fā)酵前期發(fā)生染菌后，如培養(yǎng)基中的碳、氮源含量還比較高時(shí)，終止發(fā)酵，將培養(yǎng)基加熱至規(guī)定溫度，重新進(jìn)行滅菌處理后，再接入種子進(jìn)行發(fā)酵2、如果此時(shí)染菌已造成較大的危害，培養(yǎng)基中的碳、氮源的消耗量已比較多，則可以放掉部分料液，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，重新進(jìn)行滅菌處理后，再接種進(jìn)行發(fā)酵3、也可采取降溫培養(yǎng)、調(diào)節(jié)PH、調(diào)整補(bǔ)料量、補(bǔ)加培養(yǎng)基等措施進(jìn)行處理,三）發(fā)酵中后期染菌處理1、發(fā)酵中、后期染菌或發(fā)酵前期輕微染菌而發(fā)現(xiàn)較晚時(shí)，可以適當(dāng)加入殺菌劑或抗

6、生素以及正常的發(fā)酵液，以抑制雜菌的生長速度，也可采取降低培養(yǎng)溫度、降低風(fēng)量、停止攪拌、少量補(bǔ)糖等措施，進(jìn)行處理2、如果發(fā)酵過程的產(chǎn)物代謝已到達(dá)一定水平，此時(shí)產(chǎn)品的含量若達(dá)一定值，只要明確是染菌也可放罐3、對沒有提取價(jià)值的發(fā)酵液，加熱后排放 （四）染菌后對設(shè)備的處理：必須放罐后進(jìn)行徹底清洗，空罐加熱滅菌至120以上、保持30min才能使用,四、污染的防治策略 （一）強(qiáng)化空氣處理過程：1、空氣凈化流程2、過濾介質(zhì)選擇3、過濾介質(zhì)的填裝4、空氣凈化系統(tǒng)的管理,二）嚴(yán)格培養(yǎng)原料及設(shè)備的滅菌 1、原料預(yù)處理 原料除雜目的：為了清除谷物或水果原料中的土塊、石塊、掉落的鐵質(zhì)零件，以免使機(jī)械收到磨損，發(fā)生故障

7、。影響后面的發(fā)酵工序 粉碎的目的：為了增大原料的比表面積，減少固體的團(tuán)塊 浸泡的目的：為了使原料與水充分接觸，進(jìn)而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)便于菌體的利用,2、培養(yǎng)基的滅菌 滅菌要求：在保證殺滅雜菌的前提下，盡可能多的保留營養(yǎng)物質(zhì) 3、設(shè)備滅菌 一、實(shí)罐滅菌。應(yīng)該充分排凈發(fā)酵罐內(nèi)的冷空氣二、對設(shè)備死角的處理1、法蘭連接的死角2、渣滓在罐底用環(huán)式空氣分布所形成的死角3、不銹鋼襯里的死角4、接種管路的死角5、排氣管的死角6、不合理補(bǔ)料管配置造成的死角7、壓力表安裝不合理形成的死角,三）定期檢測設(shè)備及管道 1、發(fā)酵設(shè)備的定期檢查：機(jī)械密封在發(fā)酵罐上得到廣泛的應(yīng)用 2、管道、閥門的定期檢查：使用最多的是截止閥，閥門分

8、為公稱級、低漏級、蒸汽級和原子級,四）嚴(yán)格培養(yǎng)物的移接 1.無菌室 配合使用化學(xué)滅菌藥劑有：75%酒精、0.6%-0.1%漂白粉、0.5%高錳酸鉀等 無菌室無菌度的要求：把無菌培養(yǎng)皿平板打開蓋子在無菌室內(nèi)放置30min，根據(jù)一般工廠的經(jīng)驗(yàn)，長出的菌落在3個(gè)以下為好,2.滅菌鍋 注意：排氣管是否暢通，因?yàn)闇缇伒呐艢夤茌^小，易被鐵銹或瓶子破碎后的培養(yǎng)基等所堵塞 3、接種用具要求：1、新購置的玻璃儀器的處理2、移種前的操作3、移種操作過程的要求,五）預(yù)防噬菌體的危害 噬菌體是：原核生物的病毒、非常微小，其直徑為0.1微米 噬菌體繁殖過程一般分為五個(gè)階段：噬菌體吸附到寄主細(xì)胞上，噬菌體的頭部核酸通過

9、尾管注入到寄主細(xì)胞中，以寄主細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)為原料，復(fù)制合成噬菌體自身的部件，完成組裝，分泌酶水解細(xì)胞壁使細(xì)胞破裂,1、癥狀：發(fā)酵液光密度不上升或回降；PH逐漸上升，氨利用停止、糖耗、溫升緩慢或停止，產(chǎn)生大量的泡沫，使發(fā)酵液呈黏膠狀 2、原因是環(huán)境污染為主。環(huán)境污染噬菌體是造成噬菌體感染的只要根源 3、防治：1、定期檢查噬菌體并采取有效措施消滅噬菌體2、檢查生產(chǎn)系統(tǒng)，消除各種不安全因素3、選育抗噬菌體菌株和輪換使用生產(chǎn)菌株,應(yīng)急挽救措施 1、加入少量藥物以阻止噬菌體吸附或抑制噬菌體蛋白質(zhì)合成及增殖2、當(dāng)生產(chǎn)進(jìn)行中污染了噬菌體時(shí)，可補(bǔ)入適量的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基或促使菌種生長的生長因子3、大量補(bǔ)接種子液或

10、重新接種抗性菌種培養(yǎng)液，以便繼續(xù)發(fā)酵至終點(diǎn),五 食用菌及生物農(nóng)藥生產(chǎn)中應(yīng)注意的染菌問題1、食用菌生產(chǎn)中的染菌危害,A細(xì)菌 谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大。 肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌，營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制菌生長和合成代謝產(chǎn)物,B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞，發(fā)酵一無所獲。 檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌: 易污染細(xì)菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：無論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄,1）染菌對不同菌種發(fā)酵的影響,2）染菌種類對發(fā)酵的影響,青霉素：怕染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌 鏈霉素：怕染細(xì)

11、短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌 四環(huán)素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌 檸檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌 谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續(xù)污染,3）不同發(fā)酵時(shí)期染菌對發(fā)酵的影響,種子擴(kuò)大時(shí)期染菌: 發(fā)酵前期染菌： 發(fā)酵中期染菌：挽救困難，應(yīng)早發(fā)現(xiàn)，快處理 ，處理方法應(yīng)根據(jù)各種發(fā)酵的特點(diǎn)和具體情況來決定 抗生素發(fā)酵 檸檬酸發(fā)酵 a. 污染細(xì)菌：加大通風(fēng)，加速產(chǎn)酸，調(diào)pH3.0，抑制細(xì)菌 b. 污染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母；通風(fēng)加大，加速產(chǎn)酸,滅菌后棄去,應(yīng)迅速重新滅菌，補(bǔ)充必要的營養(yǎng)成分，重新接種,3）不同發(fā)酵時(shí)期染菌對發(fā)酵的影響,檸檬酸發(fā)酵 c.染黃曲霉

12、：加入另一罐將近發(fā)酵成熟的醪液，pH下降，黃曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能夠生長。提前放罐。 發(fā)酵后期污染 染菌量不太多，可繼續(xù)發(fā)酵 污染嚴(yán)重，則提前放罐 殺菌劑的添加：前期無必要，增加成本； 發(fā)現(xiàn)后加入，效果要具體評價(jià),4）雜菌污染對發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響,絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：pH不斷下降，菌絲大量自溶，發(fā)酵液粘度增加，過濾困難 處理方法：將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑；先加絮凝劑使蛋白質(zhì)凝聚后沉淀 雜菌分泌較多蛋白質(zhì)雜質(zhì)時(shí)，對發(fā)酵后處理過程中采用溶媒萃取的提取工藝非常不利，使水相和溶媒之間極易發(fā)生乳化,1.染菌的不良后果,消耗營養(yǎng) 合成新產(chǎn)物；菌體自溶、發(fā)粘等造成分離困難 改變

13、pH 分解產(chǎn)物 噬菌體破壞極大,1. 染菌的檢查與判斷,顯微鏡檢查法 鏡檢出雜菌需要一定時(shí)間 平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法：菌落 噬菌體檢查可采用雙層平板法：噬菌斑 肉湯培養(yǎng)檢查法 發(fā)酵過程的異常現(xiàn)象判斷 DO2水平異常變化 pH異常變化 尾氣CO2異常變化,1,2,2. 污染原因分析,主要原因： 種子帶菌 無菌空氣帶菌 設(shè)備滲漏 滅菌不徹底 操作失誤 技術(shù)管理不善,從污染時(shí)間看：早期污染可能與接種操作不當(dāng)有關(guān)；后期污染可能與及中間補(bǔ)料有關(guān)。 從雜菌種類看： 耐熱芽孢桿菌：與有關(guān) 球菌、無芽孢桿菌：與 有關(guān) 淺綠色菌落的雜菌：與水有關(guān)，即冷卻盤管滲漏 霉菌：與有關(guān)，即無菌室滅菌不徹底或操作問題

14、 酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時(shí)間較長 從染菌幅度看：各個(gè)發(fā)酵罐或多數(shù)發(fā)酵罐染菌，且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問題，若個(gè)別罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問題,2. 污染原因分析,2、生物農(nóng)藥生產(chǎn)中的染菌問題 生物農(nóng)藥定義：又稱生物源農(nóng)藥，指直接利用自然界有益的生物從某些生物中制取的具有殺蟲、防病等作用的生物活性物質(zhì) 兩類：一類是活體生物農(nóng)藥，另一類是代謝產(chǎn)物生物農(nóng)藥 生物農(nóng)藥發(fā)酵生產(chǎn)包括：蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵、白僵菌等發(fā)酵 生產(chǎn)中要注意的問題：保持菌種優(yōu)良的性狀，定期檢查無菌空氣制備系統(tǒng)，嚴(yán)格菌種移接的程序，發(fā)酵過程中控制罐壓及泡沫狀況，防止染菌,3. 預(yù)防,種子帶菌的防治 滅菌徹底 接種可靠

15、：無菌室及設(shè)備可靠，無菌操作可靠 保藏可靠 過濾空氣帶菌的防治 設(shè)備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治,死角,發(fā)酵罐的“死角” 法蘭、內(nèi)襯、接口、表頭、罐內(nèi)部件及其支撐件如攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤管、擋板、空氣分布管及其支撐件 口：人孔（或手孔）、排風(fēng)管接口、燈孔、視鏡口、進(jìn)料管口 發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角” 消除方法：加強(qiáng)清洗并定期鏟除污垢；安裝放汽邊閥 管道安裝不當(dāng)或配置不合理形成的“死角,發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角,法蘭連接不當(dāng)造成的“死角,滅菌時(shí)蒸汽不易通達(dá)的“死角”及其消除方法,培養(yǎng)基與設(shè)備滅菌不徹底的防治 原料性狀：大顆粒的原料過篩除去。 實(shí)罐滅菌時(shí)要充分排除罐內(nèi)冷空氣。 滅菌過程中產(chǎn)生的泡沫造成染菌：添加消泡劑 防止泡沫升頂 連消不徹底 ：最好采用自動控制裝置 滅菌后期罐壓驟變 死角 操作不當(dāng)造成染菌 噬菌體染菌及其防治,3. 預(yù)防,采取哪些措施能夠保持無菌發(fā)酵,物料、培養(yǎng)基、中間補(bǔ)料要滅菌； 發(fā)酵設(shè)備及輔助設(shè)備（空氣過濾裝置、各種發(fā)