單克隆抗體藥耐藥問(wèn)題與應(yīng)對(duì)策略研究

1、單克隆抗體藥耐藥問(wèn)題與應(yīng)對(duì)策略研究摘 要 單克隆抗體藥物的問(wèn)世，使疾病治療的方式發(fā)生了革命性的變化。過(guò)去的 20 年，單克隆抗體藥物在癌癥、自身免疫等疾病的治療領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。單克隆抗體藥物低毒和高特異性優(yōu)勢(shì)是其成功的關(guān)鍵。單克隆抗體藥物的這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)使其快速替代傳統(tǒng)的化學(xué)療法，但其治療效果也同樣受到耐藥性的困擾。耐藥性是導(dǎo)致單克隆抗體藥物治療效果被抑制的原因之一，單克隆抗體藥物靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞后又被清除的情況，稱為抗體的調(diào)制。靶細(xì)胞通過(guò)順式或反式方式實(shí)現(xiàn)調(diào)制，并形成二次吞噬，導(dǎo)致細(xì)胞聚集沉淀。本文將對(duì)每個(gè)過(guò)程的證據(jù)以及應(yīng)對(duì)策略進(jìn)行討論。關(guān)鍵詞 單克隆抗體藥物； Fcγ 受體；

2、 內(nèi)化作用； 削除作用； 免疫療法。0 引言1975 年，Kohler 和 Milstein 對(duì)單克隆抗體的制備進(jìn)行了描述，為抗體大規(guī)模應(yīng)用于疾病治療奠定了基礎(chǔ)1.Kohler 和 Milstein 也因此獲得1984 年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他們的技術(shù)導(dǎo)致了最早一代單克隆抗體藥物的誕生。此后，單克隆抗體治療充滿了挑戰(zhàn)，如早年使用鼠原抗體帶來(lái)嚴(yán)重的免疫原性問(wèn)題，隨著嵌合抗體、人源化抗體技術(shù)及噬菌體篩選技術(shù)，小鼠表達(dá)人源抗體技術(shù)以及臨床前及臨床試驗(yàn)監(jiān)管力度的加大，免疫原性問(wèn)題等有關(guān)單克隆抗體藥物安全性的情況得到了明顯改善。一些單克隆抗體藥物在臨床上表現(xiàn)出潛在的治療效果?？?CD20 單克隆抗體藥物利妥昔

3、單抗可以明顯提高藥物的響應(yīng)率和患者的總生存期，其批準(zhǔn)上市，標(biāo)志著 B 細(xì)胞惡性腫瘤治療新時(shí)代的開始。單克隆抗體藥物不僅用于 B 細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病的治療，最近，其治療范圍擴(kuò)大到自身免疫性疾病領(lǐng)域，標(biāo)志著單克隆抗體藥物治療已經(jīng)進(jìn)入了后利妥昔單抗時(shí)代;.抗腫瘤壞死因子（ TNF,Anti-tumour necrosisfactor） 單克隆抗體藥物英夫利昔單抗（ Infliximab）對(duì)自身免疫性疾病的治療產(chǎn)生了重要的影響。1998 年，英夫利昔單抗被批準(zhǔn)用于克羅恩?。?Crohn s disease） 的治療，現(xiàn)在被批準(zhǔn)的適應(yīng)證擴(kuò)大到了強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及潰瘍性結(jié)腸炎等

4、。然而，這兩個(gè)成功的單克隆抗體藥物面臨著同樣的挑戰(zhàn)，即單克隆抗體藥物的耐藥性問(wèn)題2.1 單克隆抗體藥物的藥效機(jī)制單克隆抗體藥物的藥效機(jī)制同小分子藥物完全不同。例如，單克隆抗體藥物結(jié)合特異靶點(diǎn)分子作用于天然配體（ 如： Infiximab,單克隆抗體藥物的靶點(diǎn)是 TNF-α） ,單克隆抗體藥物還用于信號(hào)傳導(dǎo) 的 調(diào) 節(jié) （ Herceptin 阻 止 Her-2neu 的 二 聚化）3,或用于免疫系統(tǒng)的效應(yīng)調(diào)節(jié)，如啟動(dòng)血清中的補(bǔ)體效應(yīng)，或通過(guò)抗體 Fc 同 NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上 Fc 受體結(jié)合而啟動(dòng)的 ADCC 效應(yīng)（ 抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用） .實(shí)際上，大多數(shù)治療性單克隆

5、抗體是通過(guò) Fc受體，特別是 Fcγ 受體產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)用于疾病治療。Fcγ 受體屬于進(jìn)化相關(guān)的受體蛋白家族，一般依照其與 IgG 結(jié)合性和下游信號(hào)效應(yīng)進(jìn)行分類。人類和小鼠具有高親和力 Fcγ 受體，可以同 IgG單體結(jié)合，其余種屬的 Fcγ 受體屬于中度親和力受體，只能同水溶性 IgG 多聚體或細(xì)胞結(jié)合免疫復(fù)合物結(jié)合。FCγ 受體的主要功能是通過(guò) FcR 區(qū)域的 γ 鏈結(jié)合產(chǎn)生激活信號(hào)，γ 鏈包含了免疫受體酪氨酸活化組件。然而，小鼠和人都具有單一的抑制性 FcγRIIB （ CD32B） ,是基于酪

6、氨酸的免疫抑制性受體，可以降低 FcγR 或 SHIP 招募的其他刺激受體的激活作用4.研究者以 CD20 單克隆抗體藥物作為研究對(duì)象，尋找 FcγR 在單克隆抗體藥物發(fā)揮耐藥的機(jī)制，并需求解除這種耐藥現(xiàn)象的策略。以 CD20 單克隆抗體藥物的體外功能將其劃分為型（ 利妥昔單抗樣） 和型（ 托西莫單抗樣） .型 CD20單克隆抗體藥物的 Fc 片度的富集增強(qiáng)了 C1q 的招募作用，顯示其激活組分的能力，將 CD20 重新分布到細(xì)胞膜微區(qū)域的脂筏上。型 CD20 單克隆抗體藥物不具備這些作用，而是激發(fā)同質(zhì)粘附和溶酶體介導(dǎo)的非凋亡細(xì)胞死亡5.此外，型抗 CD20 單克隆抗體

7、比型抗體更易從細(xì)胞表面內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)。我們對(duì)這兩類單克隆抗體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，揭示單克隆抗體藥物的耐藥機(jī)制及應(yīng)對(duì)策略。2 單克隆抗體藥物的細(xì)胞內(nèi)化CD20 在惡性腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，是抗體治療中理想的靶標(biāo)分子。但是產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞和干細(xì)胞缺失 CD20,并缺少抗原的下調(diào)現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人 CD20 的 B 細(xì)胞研究顯示，型抗 CD20 單克隆抗體較型單克隆抗體更易清除 B 細(xì)胞。使用型抗體治療需要的時(shí)間較長(zhǎng)，程度較大，型和型單克隆抗體藥物通過(guò)不同的通路獨(dú)立介導(dǎo)補(bǔ)體激活和細(xì)胞程序性死亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，型抗 CD20 單克隆抗體被內(nèi)化并在轉(zhuǎn)基因小鼠的 B 細(xì)胞中降解，這和抗 CD20 單克隆抗

8、體處理體外原代和治療人類惡性 B 細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，這一點(diǎn)和型抗 CD20 單克隆抗體的表現(xiàn)不同。內(nèi)化會(huì)縮短單克隆抗體藥物半衰期，并影響調(diào)理細(xì)胞的吞噬功能，這將直接導(dǎo)致單克隆抗體藥物治療效果降低和用藥費(fèi)用增多。2. 1 單克隆抗體藥物的細(xì)胞內(nèi)化Lim 等6對(duì)抗 CD20 單克隆型抗體的細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)中利妥昔單抗 F（ ab‘） 2 片段的結(jié)合反應(yīng)下降，表明可能有 Fc 受體參與了這個(gè)過(guò)程。當(dāng)B 細(xì)胞只表達(dá)抑制性 FcγRIIB 或使用特異性抗體封閉 FcγRIIB 時(shí)，抗體的細(xì)胞內(nèi)化作用被抑制。另外，體外實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞表達(dá)的 Fc&gam

9、ma;RIIB 同細(xì)胞結(jié)合的利妥昔單克隆抗體藥物呈負(fù)相關(guān)。研究還表明，mAb 的 Fc 片段和 FcγR 的 Fc 結(jié)合區(qū)域相互作用增強(qiáng)了單克隆抗體藥物的內(nèi)化作用。型抗 CD20 單克隆抗體和 FcγRIIB 通過(guò)下述兩種方式發(fā)揮作用，與相鄰的細(xì)胞發(fā)生反式作用，在單細(xì)胞表面發(fā)生順式作用。Lim 等6的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間發(fā)生的直接相互作用。結(jié)果表明，為了實(shí)現(xiàn)抗體的細(xì)胞內(nèi)化，需要型抗 CD20 單克隆抗體和 FcγRIIB 的順式相互作用，這一過(guò)程被稱為抗體的雙極橋接。有研究表明，使用利妥昔單克隆抗體藥物治療時(shí)，腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá) FcγRI

10、IB 的患者較低水平表達(dá)的患者的生存期明顯降低6.另外，利妥昔單克隆抗體藥物治療濾泡性淋巴瘤患者的研究也顯示，型抗 CD20 單克隆抗體的細(xì)胞內(nèi)化作用影響了治療效果?？?CD20 的 型 抗 CD20 單 克 隆 抗 體 和FcγRIIB 的順式相互作用與 FcγRIIB 和抗體包被抗原免疫復(fù)合物間的相互作用方式相似。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物與 B 細(xì)胞受體結(jié)合時(shí)，抗體的 Fc 片段和 FcγRIIB 通過(guò)順式發(fā)生相互作用，在細(xì)胞膜處將抑制型 FcγR 和 B 細(xì)胞受體結(jié)合； 激活抑制型 B細(xì)胞受體，對(duì)于抗原特異性 B 細(xì)胞反應(yīng)是一個(gè)負(fù)反饋。抑制型 BC

11、R 的活化，IgG 免疫復(fù)合物引導(dǎo)FcγRIIB 的 B2 亞型的快速內(nèi)化，這個(gè)過(guò)程是不依賴細(xì)胞區(qū)域完整ITIM 序列的。上述研究表明，抗CD20型單克隆抗體和 FcγRIIB 的相互作用引導(dǎo)復(fù)合物向細(xì)胞膜接近，與磷酸化的 FcγRIIB ITIM 形成三聚體復(fù)合物，增強(qiáng)了復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)化作用，過(guò)程與免疫復(fù)合物的內(nèi)化相似。然而，Vaughan 等7的研究顯示，F(xiàn)cγRIIB 的突變體缺乏完整的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，同樣可以完成對(duì)抗 CD20 的型單克隆抗體內(nèi)化的增強(qiáng)作用，與野生型的 FcγRIIB 效果相同。這表明 FcγRIIB 和

12、免疫復(fù)合物之間的相互作用、抗體連接 CD20 的內(nèi)化并不是通過(guò) FcγR 依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，F(xiàn)cγRIIB 的作用可能僅限于物理結(jié)構(gòu)的相互作用。2. 2 脂筏的作用型抗 CD20 單克隆抗體不僅與 FcγRIIB 相結(jié)合。事實(shí)上，B 細(xì)胞靶標(biāo)的抗原抗體復(fù)合物通過(guò)順式反應(yīng) FcγRIIB 結(jié)合到細(xì)胞表面，還包括單克隆抗體與 MHC 、CD40 和 CD38的結(jié)合。然而，這些內(nèi)化作用一般不會(huì)對(duì)抗體連接受體的內(nèi)化產(chǎn)生影響，只有抗 CD38 和 CD19 的抗體會(huì)產(chǎn)生較為明顯的影響。為了進(jìn)一步闡明抗原調(diào)變機(jī)制，研究者對(duì)脂筏結(jié)構(gòu) FcγRIIB

13、在單克隆抗體藥物鏈接 CD20 內(nèi)化過(guò)程中的增強(qiáng)作用進(jìn)行研究。型抗 CD20 單克隆抗體介導(dǎo)了 CD20 向脂筏的重分布，而型抗CD20 單克隆抗體與其他單克隆抗體直接和 B 細(xì)胞表面受體結(jié)合。此外，在與 BCR 相互作用時(shí)，F(xiàn)cγRIIB 也向脂筏重分布。向脂筏的重分布及后續(xù)的內(nèi)吞過(guò)程存在于許多受體配體復(fù)合物及病毒的內(nèi)化過(guò)程中。研究者推測(cè)，F(xiàn)cγRIIB 和利妥昔單克隆抗體藥物在脂筏上的相互作用對(duì)于增強(qiáng)內(nèi)化是必需的，這就解釋了盡管 FcγRIIB 被磷酸化，型抗 CD20 單克隆抗體內(nèi)化和抗體直接與其他受體的內(nèi)化比例基本相當(dāng)8.在脂筏的研究中，研究者使用具

14、有 CD20 突變型的人骨髓瘤細(xì)胞作為研究對(duì)象，因?yàn)?CD20 的突變型不能重分布到脂筏上。在 FcγRIIB 缺失時(shí)，表達(dá)突變型 CD20 的細(xì)胞表現(xiàn)出比野生型細(xì)胞較慢的抗體內(nèi)化作用，這說(shuō)明 CD20 向脂筏的重分布對(duì)于抗體內(nèi)化有重要影響。當(dāng)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 FcγRIIB 時(shí)，抗體內(nèi)化開始加速，這說(shuō)明轉(zhuǎn)染的 FcγRIIB 代替了突變的FcγRIIB 引領(lǐng)突變的 CD20 向脂筏的重分布。為了驗(yàn)證這種情況，研究者利用 FcγRIIB 得到不能向脂筏重分布的突變體 FcγRIIA.突變體 FcγRIIA可以增強(qiáng) C

15、D20 的內(nèi)化，這說(shuō)明內(nèi)化過(guò)程中 CD20向脂筏的作用中 FcγRIIB 可能不是必須的。CD20內(nèi)化過(guò)程中，型抗 CD20 單克隆抗體和 FcγRIIB相互作用的具體機(jī)制尚不清楚。內(nèi)吞作用的前提是膜的曲率，這將形成內(nèi)吞小泡。Stachowiak 等9對(duì)人工脂膜的研究顯示，高度擁擠的蛋白可以誘發(fā)膜形成褶皺及脂質(zhì)小管，褶皺的增加同蛋白質(zhì)濃度相關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)，型抗 CD20 單克隆抗體、FcγRIIB 和 CD20 在細(xì)胞膜上聚集，而型抗體沒(méi)有這種重分布的情況發(fā)生。Stachowiak 等人工脂膜的研究顯示，型抗CD20 單克隆抗體誘發(fā) CD20 和 Fc&ga

16、mma;RIIB 的重分布，這可能觸發(fā)膜褶皺和隨后的內(nèi)吞。這個(gè)過(guò)程中 FcγRIIB 可能與抗體受體復(fù)合物發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞膜上高密度的蛋白招募反應(yīng)，進(jìn)而引起細(xì)胞膜的形變。但這并不能完全解釋在型抗 CD20 單克隆抗體的順式反應(yīng)中 FcγRIIB 和CD20 也發(fā)生相互作用，但是并沒(méi)有觸發(fā) CD20 的內(nèi)化。然而，型單克隆抗體 GA101 （ Obinutu-zumab） 的晶體結(jié)構(gòu)的研究表明， 型抗體結(jié)合CD20 的定位同型抗體不同。這種差異可能是順式反應(yīng)中型和型單克隆抗體同 FcγR 的相互作用的親和力和密度不同。雖然型單克隆抗體和磷酸化的 F

17、cγRIIB 相互作用，但是活化的水平不高。即使對(duì)型抗 CD20 單克隆抗體的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整，也不能啟動(dòng)足夠的招募反應(yīng)使膜引發(fā)皺褶并發(fā)生內(nèi)吞反應(yīng)?；谏鲜龅难芯?，我們認(rèn)為，型單克隆抗體不能誘導(dǎo) CD20 向脂筏的重分布，型單克隆抗體直接定向特異性的靶點(diǎn)蛋白，并保留在細(xì)胞表面而不被內(nèi)化。3 單克隆抗體藥物的削除機(jī)制另一種抗體耐藥性的解釋是抗體的削除機(jī)制或是 Trogocytosis 作用（ 細(xì)胞吞噬的一種機(jī)制）.Taylor 等10基于使用利妥昔單克隆抗體藥物的慢性淋巴細(xì)胞白血?。?Chronic lymphocytic leukemia,CLL） 患者進(jìn)行研究，提出抗體削除機(jī)制可能是患者對(duì)單克隆抗體藥物產(chǎn)生耐藥性的原因。這種機(jī)制有助于解釋在使用利妥昔單克隆抗體藥物治療初期循環(huán) CLL 細(xì)胞數(shù)量降低，但是隨著藥物的持續(xù)使用，CD20 陰性的 CLL 細(xì)胞數(shù)量逐步增加。單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的 FcγR 依賴免疫反應(yīng)中，抗體和靶點(diǎn)復(fù)合物從靶細(xì)胞表面削除或拔掉。最初人們認(rèn)為 FcγRI 介導(dǎo)了這一過(guò)程，之后研究發(fā)現(xiàn)，抗原抗體復(fù)合物與效應(yīng)細(xì)胞 FcγR 的結(jié)合可以完成削除機(jī)制。抑制型 FcγRIIB 的小鼠實(shí)驗(yàn)也證明了削除機(jī)制的存在。而使用腹腔腫瘤小鼠得到的關(guān)于 FcγR